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ResearcherID
- J-8841-2015 (1)
- N-2030-2015 (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 311781 (1)
Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren
(2001)
In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann.
In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis.
Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
The increase in intensively used areas and climate change are direct and indirect consequences of anthropogenic actions, caused by a growing population and increasing greenhouse gas emissions. The number of research studies, investigating the effects of land use and climate change on ecosystems, including flora, fauna, and ecosystem services, is steadily growing. This thesis contributes to this research area by investigating land-use and climate effects on decomposer communities (arthropods and microbes) and the ecosystem service ‘decomposition of dead material’.
Chapter II deals with consequences of intensified land use and climate change for the ecosystem service ‘decomposition of dead organic material’ (necromass). Considering the severe decline in insects, we experimentally excluded insects from half of the study objects. The decomposition of both dung and carrion was robust to land-use changes. Dung decomposition, moreover, was unaffected by temperature and the presence/ absence of insects. Along the altitudinal gradient, however, highest dung decomposition was observed at medium elevation between 600 and 700 m above sea level (although insignificant). As a consequence, we assume that at this elevation there is an ideal precipitation:temperature ratio for decomposing organisms, such as earthworms or collembolans. Carrion decomposition was accelerated by increasing elevation and by the presence of insects, indicating that increasing variability in climate and an ongoing decline in insects could modify decomposition processes and consequently natural nutrient cycles. Moreover, we show that different types of dead organic material respond differently to environmental factors and should be treated separately in future studies.
In Chapter III, we investigated land-use and climate effects on dung-visiting beetles and their resource specialization. Here, all beetles that are preferentially found on dung, carrion or other rotten material were included. Both α- and γ-diversity were strongly reduced in agricultural and urban areas. High precipitation reduced dung-visiting beetle abundance, whereas γ-diversity was lowest in the warmest regions. Resource specialization decreased with increasing temperatures. The results give evidence that land use as well as climate can alter dung-visiting beetle diversity and resource specialization and may hence influence the natural balance of beetle communities and their contribution to the ecosystem service ‘decomposition of dead material’.
The following chapter, Chapter IV, contributes to the findings in Chapter II. Here, carrion decomposition is not only explained by land-use intensity and climate but also by diversity and community composition of two taxonomic groups found on carrion, beetles and bacteria. The results revealed a strong correlation between bacteria diversity and community composition with temperature. Carrion decomposition was to a great extent directed by bacterial community composition and precipitation. The role of beetles was neglectable in carrion decomposition. With this study, I show that microbes, despite their microscopic size, direct carrion decomposition and may not be neglected in future decomposition studies.
In Chapter V a third necromass type is investigated, namely deadwood. The aim was to assess climate and land-use effects on deadwood-inhabiting fungi and bacteria. Main driver for microbial richness (measured as number of OTUs) was climate, including temperature and precipitation. Warmer climates promoted the diversity of bacteria, whereas fungi richness was unaffected by temperature. In turn, fungi richness was lower in urban landscapes compared to near-natural landscapes and bacteria richness was higher on meadows than on forest sites. Fungi were extremely specialized on their host tree, independent of land use and climate. Bacteria specialization, however, was strongly directed by land use and climate. These results underpin previous studies showing that fungi are highly specialized in contrast to bacteria and add new insights into the robustness of fungi specialization to climate and land use.
I summarize that climate as well as intensive land use influence biodiversity. Temperature and precipitation, however, had positive and negative effects on decomposer diversity, while anthropogenic land use had mostly negative effects on the diversity of decomposers.
Summary Timber harvesting is currently the most common commercial utilisation activity in tropical forests. Assessing the effects of logging on different aspects of biodiversity and general ecosystem properties is hence of prime importance if the few remaining areas of intact tropical forest are to be protected effectively and efficiently. Tropical amphibian communities are an appropriate model system for studies on the impacts of human-induced environmental changes on the dynamics of complex biological systems. This thesis elaborates on patterns of diversity changes in tropical forest amphibian communities facing habitat alterations associated with selective logging in two globally important eco-regions (Côte d’Ivoire, Upper Guinea, West Africa and Guyana, the Guiana Shield, northern South America). The thesis is organised along two main themes. After a general introduction, a section on general methodology and an introduction to the model systems studied, the first theme moves from general patterns to underlying processes. A second theme running through both chapters carries from undisturbed systems to disturbed systems. A final section integrates findings and addresses implications for conservation management of anthropogenically altered tropical forests. Several case studies at the species- population and community level are being presented and data on the direct and indirect impacts of anthropogenic habitat alteration on respective organizational levels are provided. A key statement that is stressed on throughout the studies is the fact that common measures of diversity, such as species richness and species-diversity only inadequately reflect processes of diversity change following anthropogenic disturbance. They also fail to describe actual impacts on the dynamics of complex biological systems. It is argued that commonly used measures produce an incoherent and insufficient picture of diversity patterns and the underlying processes that shape these patterns. Thus, an understanding of higher levels of diversity, such as β-diversity and functional diversity (and hence compositional patterns) appears to be the key to effectively mitigating the impacts of human-induced disturbance on amphibian communities. It is shown that the predictability of amphibian community composition depends on the respective level of anthropogenic disturbance imposed on a particular habitat. Hence, human activities that lead to changes in the structure of a forest, such as logging, not only alter simple system descriptors, such as the number of species in a given community, but rather alter the dynamics of the entire system. In this context, functional diversity is shown to be an important aspect underlying the actual mechanism that leads to the observed change of predictability patterns. Functional differences between species, rather than number of species per se appear to be the decisive factor in sustaining desirable ecosystem states and thus in maintaining important ecosystem services. Because biological diversity appears to play a substantial role in ecosystem resilience required to safeguard essential ecosystem functions in the face of environmental change, the thesis calls for a critical revision of common diversity assessments approaches. The studies advocate the reconsideration of the uncritical use of widespread measures and descriptors of biodiversity on grounds of inconsistent patterns found throughout numerous studies, including those presented herein.
In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht.
Recent advances in the development of immunoassays and nucleic acid assays have improved the performance and increased the sensitivity of sensors that are based on biochemical recognition. The new approaches taken by researchers include detecting pathogens by detecting their nucleic acids, using new nontoxic reporter entities for generating signals, and downscaling and miniaturizing sensors to micromigration and microfluidic formats. This dissertation connects some of these successful approaches, thereby leading to the development of novel nucleic acid sensors for rapid and easy detection of pathogens. The author's goal was to develop diagnostic tools that enable investigators to detect pathogens rapidly and on site. While the sensors can be used to detect any pathogen, the author first customized them for detecting particularly Cryptosporidium parvum, a pathogen whose detection is important, yet presents many challenges. Chapter 2 of this thesis presents a novel test-strip for the detection of C. parvum. The test-strip is designed to detect nucleic acids rather than proteins or other epitopes. While test strips are commonly used for sensors based on immunological recognition, this format is very new in applications in which nucleic acids are detected. Further, to indicate the presence or absence of a specific target on the test strip, dye-entrapped, oligonucleotide-tagged liposomes are employed. Using liposomes as reporter particles has advantages over using other reporter labels, because the cavity that the phospholipidic membranes of the liposomes form can be filled with up to 106 dye molecules. By using heterobifunctional linkers liposomes can be tagged with oligonucleotides, thereby enabling their use in nucleic acid hybridization assays. The developed test-strip provides an internal control. The limit of detection is 2.7 fmol/mL with a sample volume of 30 mL. In chapter 3 the detection of nucleic acids by means of oligonucleotide-tagged liposomes is scaled down to a microfluidic assay format. Because the application of biosensors to microfluidic formats is very new in the field of analytical chemistry, the first part of this chapter is devoted to developing the design and the method to fabricate the microchip devices. The performance of the microchips is then optimized by investigating the interactions of nucleic acids and liposomes with the material the chips consist of and by passivating the surface of the chips with blocking reagents. The developed microfluidic chip enabled us to reduce the sample volume needed for one assay to 12.5 mL. The limit of detection of this assay was determined to be 0.4 fmol/mL. Chapters 4 and 5 expand on the development of the microfluidic assay. A prototype microfluidic array that is able to detect multiple analytes in a single sample simultaneously is developed. Using such an array will enable investigators to detect pathogens that occur in the same environment, for example, C. parvum and Giardia duodenalis by conducting a single test. The array's ability to perform multiple sample analysis is shown by detecting different concentrations of target nucleic acids. Further, the author developed a microfluidic chip in which interdigitated microelectrode arrays (IDAs) that consist of closely spaced microelectrodes are integrated. The IDAs facilitate electrochemical detection of cryptosporidial RNA. Electrochemical detection schemes offer benefits of technical simplicity, speed, and sensitivity. In this project liposomes are filled with electrochemically active molecules and are then utilized to generate electrochemical signals. Chapter 6 explores the feasibility of liposomes for enhancing signals derived from nucleic acid hybridization in surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. SPR spectroscopy offers advantages because nucleic acid hybridization can be monitored in real time and under homogeneous conditions because no washing steps are required. SPR spectroscopy is very sensitive and it can be expected that, in the future, SPR will be integrated into microfluidic nucleic acid sensors.
The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry
(MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.
GAS2L3 was identified recently as a target gene of the DREAM complex (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). It was shown that GAS2L3 is expressed in a cell cycle specific manner and that depletion of the protein leads to defects in cytokinesis and genomic instability (Wolter et al., 2012).
Major aim of this thesis was, to further characterize the biochemical properties and physiological function of GAS2L3.
By in vitro co-sedimentation and bundling assays, GAS2L3 was identified as a cytoskeleton associated protein which bundles, binds and crosslinks F-actin and MTs. GST pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments revealed that GAS2L3 interacts in vitro and in vivo with the chromosomal passenger complex (CPC), a very important regulator of mitosis and cytokinesis, and that the interaction is mediated by the GAR domain of GAS2L3 and the C-terminal part of Borealin and the N-terminal part of Survivin. Kinase assays showed that GAS2L3 is not a substrate of the CPC but is strongly phosphorylated by CDK1 in vitro. Depletion of GAS2L3 by shRNA influenced protein stability and activity of the CPC. However pharmacological studies showed that the decreased CPC activity is not responsible for the observed cytokinesis defects upon GAS2L3 depletion. Immunofluorescence experiments revealed that GAS2L3 is localized to the constriction zone by the CPC in a GAR dependent manner and that the GAR domain is important for proper protein function.
New interacting proteins of GAS2L3 were identified by stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with tandem affinity purification and subsequent mass spectrometrical analysis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the obtained mass spectrometrical data.
To address the physiological function of GAS2L3 in vivo, a conditional and a non-conditional knockout mouse strain was established. The non-conditional mouse strain showed a highly increased mortality rate before weaning age probably due to heart failure. The physiological function of GAS2L3 in vivo as well as the exact reason for the observed heart phenotype is not known at the moment.
There is substantial interest in the identification of genes underlying susceptibility to complex human diseases because of the potential utility of such genes in disease prediction and therapy. The complex age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent cause of legal blindness in industrialized countries and predominantly affects the elderly population over 75 years of age. Although vision loss in AMD results from photoreceptor cell death in the central retina, the initial pathogenesis likely involves processes in the retinal pigment epithelium (RPE) (Liang and Godley, 2003). The goal of the current study was to identify and characterize genes specifically or abundantly expressed in the RPE in order to determine more comprehensively the transcriptome of the RPE. In addition, our aim was to assess the role of these genes in AMD pathogenesis. Towards this end, a bovine cDNA library enriched for RPE transcripts was constructed in-house using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) technique (Diatchenko et al., 1996, 1999), which normalizes for sequence abundance and achieves high enrichment for differentially expressed genes. CAP3 (Huang and Madan, 1999) was used to assemble the high quality sequences of all the 2379 ESTs into clusters or singletons. 1.2% of the 2379 RPE-ESTs contains vector sequences and was excluded from further analysis. 5% of the RPE-ESTs showed homology to multipe chromosomes and were not included in further assembly process. The rest of the ESTs (2245) were assembled into 175 contigs and 509 singletons, which revealed approximately 684 unique genes in the dataset. Out of the 684, 343 bovine RPE transcripts did not align to their human orthologues. A large fraction of clones were shown to include a considerable 3´untranslated regions of the gene that are not conserved between bovine and human. It is the coding regions that can be conserved between bovine and human and not the 3’ UTR (Sharma et al., 2002). Therefore, more sequencing from the cDNA library with reclustering of those 343 ESTs together with continuous blasting might reveal their human orthologoues. To handle the large volume of data that the RPE cDNA library project has generated a highly efficient and user-friendly RDBMS was designed. Using RDBMS data storage can be managed efficiently and flexibly. The RDBMS allows displaying the results in query-based form and report format with additional annotations, links and search functions. Out of the 341 known and predicted genes identified in this study, 2 were further analyzed. The RPE or/and retina specificity of these two clones were further confirmed by RT-PCR analysis in adult human tissues. Construction of a single nucleotide polymphism (SNP) map was initiated as a first step in future case/control association studies. SNP genotyping was carried out for one of these two clones (RPE01-D2, now known as RDH12). 12 SNPs were identified from direct sequencing of the 23.4-kb region, of which 5 are of high frequency. In a next step, comparison of allele frequencies between AMD patients and healthy controls is required. Completion of the expression analysis for other predicted genes identified during this study is in progress using real time RT-PCR and will provide additional candidate genes for further analyses. This study is expected to contribute to our understanding of the genetic basis of RPE function and to clarify the role of the RPE-expressed genes in the predisposition to AMD. It may also help reveal the mechanisms and pathways that are involved in the development of AMD or other retinal dystrophies.
Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert.
Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress.
Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht.
Coxiella burnetii, a Gram negative obligate intracellular bacterium, is the causative
agent of Q fever. It has a world wide distribution and has been documented to
be capable of causing infections in several domestic animals, livestock species,
and human beings. Outbreaks of Q fever are still being observed in livestock
across animal farms in Europe, and primary transmission to humans still oc-
curs especially in animal handlers. Public health authorities in some countries
like Germany are required by law to report human acute cases denoting the
significance of the challenge posed by C. burnetii to public health.
In this thesis, I have developed a platform alongside methods to address the
challenges of genomic analyses of C. burnetii for typing purposes. Identification
of C. burnetii isolates is an important task in the laboratory as well as in the
clinics and genotyping is a reliable method to identify and characterize known
and novel isolates. Therefore, I designed and implemented several methods
to facilitate the genotyping analyses of C. burnetii genomes in silico via a web
platform. As genotyping is a data intensive process, I also included additional
features such as visualization methods and databases for interpretation and
storage of obtained results. I also developed a method to profile the resistome
of C. burnetii isolates using a machine learning approach. Data about antibiotic
resistance in C. burnetii are scarce majorly due to its lifestyle and the difficulty
of cultivation in laboratory media. Alternative methods that rely on homology
identification of resistance genes are also inefficient in C. burnetii, hence, I
opted for a novel approach that has been shown to be promising in other
bacteria species. The applied method relied on an artificial neural network as
well as amino acid composition of position specific scoring matrix profile for
feature extraction. The resulting model achieved an accuracy of ≈ 0.96 on test
data and the overall performance was significantly higher in comparison to
existing models. Finally, I analyzed two new C. burnetii isolates obtained from
an outbreak in Germany, I compared the genome to the RSA 493 reference
isolate and found extensive deletions across the genome landscape.
This work has provided a new digital infrastructure to analyze and character-
ize C. burnetii genomes that was not in existence before and it has also made a
significant contribution to the existing information about antibiotic resistance
genes in C. burnetii.
Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy.
Immuntherapien auf der Basis gut charakterisierter, tumorspezifischer Antigene stellen ein vielversprechendes Konzept der Tumortherapie dar. Ein potentielles Antigen für immuntherapeutische Strategien sollte möglichst tumorspezifisch exprimiert sein und es sollte einen Hinweis auf bereits erfolgte Immunantworten im Patienten geben, wie z.B. die Existenz spezifischer Antikörper oder zytotoxischer T-Zellen (CTL). Eine membranständige Lokalisation ist für die Verwendung von Tumorantigenen in Antikörpertherapien notwendig. Während für viele Neoplasien Tumorantigene bekannt sind, wurden für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bislang nur sehr wenige tumorassoziierte Antigene identifiziert. Die Antigene se57-1, se70-2, cTAGE-1 und GBP-5ta wurden durch serologisches Durchsuchen einer Phagenbank aus Testis- bzw. Tumorgewebe (SEREX-Methode) identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität dieser vier Tumorantigene in einem neu entwickelten ELISA mit CTCL-, Parapsoriasis-, Melanom- und Kontrollseren untersucht. se70-2 und cTAGE-1 Protein erkannten nur wenige Patientenseren. Für GBP-5ta konnte dagegen eine signifikant höhere Reaktivität der CTCL-Seren im Vergleich zu den Kontrollseren ermittelt werden. Bei se57-1 waren die CTCL- und die Parapsoriasisseren hoch signifikant verschieden zu den Kontrollseren. Dieses putativ virusinduzierte Antigen sollte in zukünftigen Arbeiten auf seine mögliche Funktion als Entzündungsmarker weiter untersucht werden. Für das CTCL sollten weitere Kombinationen von Tumorantigenen auf ihren diagnostischen Wert in der Serologie getestet werden. Des Weiteren konnten in dieser Arbeit die CTCL assoziierten Antigene se2-2 und die GBP-5 Familie genauer charakterisiert werden: Die Expressionsanalyse von se2-2 Protein und mRNA in verschiedenen Normalgeweben zeigte ein differentielles Expressionsmuster. Im SEREX wurde se2-2 serologisch spezifisch nur von CTCL-Seren erkannt. Möglicherweise wäre se2-2 eine geeignete Zielstruktur für die serologische Diagnostik des CTCL. Aufgrund seiner fehlenden Tumorspezifität ist se2-2 für die Immuntherapie jedoch wenig geeignet. Die neu identifizierte GBP-5 Familie besteht aus mindestens drei Spleißvarianten (GBP-5ta, GBP-5a und GBP-5b), die zwei Proteine, GBP-5ta und GBP-5a/b, kodieren. GBP-5ta ist gegenüber GBP-5a/b C-terminal um 97 AS verkürzt. GBP-5ta mRNA wird differentiell exprimiert, während GBP-5ta Protein PBMC-spezifisch exprimiert wird. In CTCL-Tumorgewebe konnte GBP-5ta nachgewiesen werden, wogegen in Melanomzelllinien fast ausschließlich GBP-5a/b vorliegt. Gegen GBP-5ta konnte eine humorale Immunantwort bei CTCL-Patienten nachgewiesen werden: Im SEREX wurde GBP-5ta nur von CTCL-Patientenseren erkannt. Auch in der ELISA-Methode reagierten signifikant mehr Patientenseren als Kontrollseren mit GBP-5ta. Die höhere Immunogenität von GBP-5ta gegenüber GBP-5a/b im SEREX unterstreicht die Bedeutung der verkürzten Variante. Ob CTL gegen GBP-5ta präsentierende Zellen existieren, wird momentan untersucht. Die GBP-5 Spleißvarianten sind hoch homolog zur Familie der GTPasen, zu denen auch das Onkogen Ras gehört. Das verkürzte Protein von GBP-5ta könnte durch den Verlust der C-terminalen Domäne seine eventuelle anti-proliferierende Funktion verlieren. Ein Knock-out Versuch von GBP-5 könnte die Bedeutung von GBP-5 in der Tumorzelle untersuchen. Darüber hinaus wäre es vielversprechend, die GTPase Aktivität der GBP-5 Varianten in einem GTP-Bindungs-Assay zu überprüfen. GBP-5ta könnte eine mögliche Ursache des unkontrollierten Wachstums der Tumorzelle und somit eine vielversprechende potentielle Zielstruktur für therapeutische Ansätze für das CTCL sein.
Marine Schwämme der Gattung Aplysina besitzen Bromotyrosinealkaloide als typische Sekundärmetabolite. Diese Alkaloide werden in einer enzymatischen Abwehrreaktion zu biologisch aktiven Produkten abgebaut. In der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung von 14 Schwamminhaltstsoffen aus dem Schwamm Aplysina insularis beschrieben. 14-oxo-Aerophobin-2 konnte als neues Bromoisoxazolinalkaloid beschrieben werden. Anhand des Schwammes Aplysina cauliformis wurde die Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina vorgenommnen, die von zwei aufeinanderfolgenden Enzymen durchgeführt wird. Hierbei konnte erstmals eine Nitrilhydratase aus dem marinen Habitat beschrieben werden, die in der beschriebenen Abwehrreaktion als zweites Enzym beteiligt ist.
Rhodococcus equi is a Gram-positive intracellular pathogen which can cause severe bronchopneumonia in foals. In recent years, the role of this bacterium as human pathogen has been noted, as R.equi infections in humans have increase in frequency. This increase is associated with the rise in immunosupressed individuals, specially AIDS patients, where infection leads to symptoms and pathology similar to those seen in foals with a high mortality rate. Due to its capability to survive and multiply in murine and equine macrophages, R.equi has been classified as a facultative intracellular bacterium. R.equi is found frequently in macrophages in alveolar infiltrate from infected animals. The pathogenicity of R.equi depends on its ability to exist and multiply inside macrophages and has been associated with the presence of virulence plasmids. It has been observed that, inside foal alveolar macrophages, R.equi-containing vacuoles (RCVs) do not mature into phagolysosomes. However, most of the intracellular events during R.equi infection have not been investigated in detail. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of R.equi and the mechanism by which the bacteria avoid destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmids of R.equi for the establishment of RCVs was also evaluated. Furthermore, the intracellular fate of viable and non-viable R.equi was compared in order to study whether viability of R.equi influeciantes the establishment of RCVs. In this study, the RCV was characterized by using a variety of endocytic markers to follow the path of the bacteria trhough murine macropages. Transmission electron microscopy-base analysis showed that R.equi was found equally frequently in phagosomes with loosely or thightly apposed membranes, and RCV often contains numerous membranous vesicles. Laser scanning microscopy of infected macrophages showed that the majority of phagosomes containing R.equi acquired transiently the early endosomal markers Rab5, Ptlns3P, and EEA-1, suggesting initially undisturbed phagosome maturation. Although the RCV acquired some late endosomal markers, such as Rab7, LAMP-1, and Lamp-2, they did not acquired vATPase, did not interact with pre-labeled lysosomes, and failed to acidify. These data clearly suggest that the RCV is a compartment which has left vacuoles that resemble multivesicular body compartments (MVB), which are transport intermediates between early and late endosomes and display internal vesicles very similar to the ones observed within RCVs. Analyisis of several R.equi strains containing either VapA- or VapB-expressing plasmids or neither demonstrated that the possession of the virulence-associated plasmids does not affect phagosome trafficking over a two hour period of infection. The finding that non-viable R.equi was still able to inhibit phagosome maturation (although not to the same extent as viable R.equi did) suggests that heat-insensitive factors, such as cell periphery lipids, may play a major role in inhibition of phagosome maturation, although heat-sensitive factors may also be involved.
Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes.
The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration.
Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.
In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes.
Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer befruchteten Eizelle ist nur durch komplexe zelluläre Regulationsmechanismen möglich. Dabei spielt der Notch-Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle während der Determination von Zellschicksalen und der Zelldifferenzierung. Die primären Zielgene der Notch-Signalkaskaskade bei Vertebraten sind die Hes- sowie die kürzlich identifizierten Hey-Gene. Die Hey-(hairy and E(spl) related with YRPW motif)-Gene kodieren drei hairy/E(spl)/Hes-verwandte basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren, die durch eine Orange-Domäne und einen charakteristischen Carboxyterminus gekennzeichnet sind. Während der Embryonalentwicklung werden die Hey-Gene dynamisch in zahlreichen Geweben exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, neue Hey-Interaktionsproteine aus embryonalen Genbanken zu isolieren, die Bindung an weitere bHLH-Transkriptionsfaktoren zu überprüfen und ihre DNA-Bindung zu analysieren. Um die physiologische Hey2-Funktion zu ergründen, wurden Hey2-Knockoutmäuse untersucht. In einem ersten Versuch wurde eine neue Screeningmethode erprobt, bei der Proteinexpressionsfilter mit markierten Hey1-Peptiden nach interagierenden Proteinen durchsucht wurden. Hierbei sind 53 Proteine isoliert worden, jedoch konnte nach eingehenderen Untersuchungen kein relevanter Bindungsspartner beschrieben werden. Für weitere Analysen unter mehr physiologischen Bedingungen wurde das Yeast Two-Hybrid Verfahren für Hey1 und Hey2 etabliert. Das Screening von murinen embryonalen cDNA-Genbanken mit verschiedenen Hey1-Fragmenten führte zur Isolation von mehreren hundert Klonen. Die interessantesten Kandidaten wurden weiteren biochemischen Tests unterzogen, wobei jedoch keine neuen Interaktionspartner verifiziert werden konnten. Mit gezielten direkten Yeast Two-Hybrid und GST-Pulldown Assays für vermutete Kandidaten konnte jedoch die Interaktion von Hey1 bzw. Hey2 mit den bHLH-Proteinen E2-2, E2-5, MyoD und c-hairy1 nachgewiesen werden. Außerdem wurde festgestellt, dass Hey1 und Hey2 Homodimere und Hey1/Hey2-Heterodimere bilden. Die stärkste Interaktion wurde mit dem in der Somitogenese rhythmisch exprimierten c-hairy1-Protein beobachtet. Da Hey2 und c-hairy1 im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten coexprimiert werden und starke Heterodimere ausbilden, erscheint es wahrscheinlich, dass beide Proteine gemeinsam die Transkription nachgeschalteter Gene steuern. Diese Interaktionsstudien zeigten außerdem erstmals, dass die Orange-Domäne entscheidend an der Bildung der Dimere beteiligt ist, da durch sie die Dimerisierung in vivo deutlich verstärkt wurde. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Hey1 und Hey2, im Gegensatz zu den übrigen hairy-Proteinen, nicht mit dem Corepressor Groucho/TLE1 interagieren. Electrophoretic Mobility Shift Assays ergaben, dass die Hey1- und Hey2-Proteine an eine E(spl)-spezifische E-Box DNA-Sequenz (CACGTG) binden. Auch die interagierenden bHLH-Proteine c-hairy1, E2-2 und E2-5 binden als Homodimere an diese DNA-Sequenz. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Hey2-Genfunktion an Hey2-Knockoutmäusen untersucht. Etwa 80 % der homozygoten Mäuse starben wenige Tage nach der Geburt. Sie zeigten eine massive Hypertrophie der Herzventrikel, die wahrscheinlich die Todesursache darstellt. Die lacZ-Expression der untersuchten Organe entsprach der Hey2-Expression im Wildtyp. Es fiel dabei auf, dass es postnatal zu einer Herunterregulation der Hey2-Transkription kommt. Mit Elektrokardiogrammen wurden keine Reizleitungsstörungen bei neugeborenen Hey2-Knockoutmäusen festgestellt. Interessanterweise konnte mit Arteriographien ausgeschlossen werden, dass die Ventrikelhypertophie Folge einer Aortenstenose wie bei der gridlock (zf-Hey2)-Mutante im Zebrafisch ist. Vielmehr führt eine homozygote Hey2-Deletion zu einer Kardiomyopathie in Kombination mit verschiedenene Herzfehlern. Untersuchungen der Hey1- und HeyL-Expression in Hey2-Knockoutembryonen mittels RNA in situ Hybridisierungen zeigten keine Veränderungen im Vergleich mit dem Wildtyp. Daraus kann gefolgert werden, dass Hey1 und HeyL zumindest dort, wo sie nicht mit Hey2 coexprimiert sind, die Hey2-Funktionen nicht kompensieren können. Weitere Erkenntnisse über die Funktionen der Hey-Gene werden sicherlich die Studien an den Doppelknockoutmäusen ergeben. Die bisherigen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Hey-Gene essentiell für die murine Herzentwicklung sind. Weitere Untersuchungen müssen nun zeigen, welche Rolle diese Gene bei der Entstehung von kongenitalen Herzfehlern des Menschen spielen.
In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.
Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der
Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl
und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat.
Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen‐zu‐Männchen
Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert.
To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate.
The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase.
We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins.
Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression.
Cataglyphis ants are famous for their navigational abilities. They live in hostile habitats where they forage as solitary scavengers covering distances of more than hundred thousand times their body lengths. To return to their nest with a prey item – mainly other dead insects that did not survive the heat – Cataglyphis ants constantly keep track of their directions and distances travelled. The navigational strategy is called path integration, and it enables an ant to return to the nest in a straight line using its home vector. Cataglyphis ants mainly rely on celestial compass cues, like the position of the sun or the UV polarization pattern, to determine directions, and they use an idiothetic step counter and optic flow to measure distances. In addition, they acquire information about visual, olfactory and tactile landmarks, and the wind direction to increase their chances of returning to the nest safe and sound. Cataglyphis’ navigational performance becomes even more impressive if one considers their life style. Most time of their lives, the ants stay underground and perform tasks within the colony. When they start their foraging careers outside the nest, they have to calibrate their compass systems and acquire all information necessary for navigation during subsequent foraging. This navigational toolkit is not instantaneously available, but has to be filled with experience. For that reason, Cataglyphis ants perform a striking behavior for up to three days before actually foraging. These so-called learning walks are crucial for the success as foragers later on. In the present thesis, both the ontogeny and the fine-structure of learning walks has been investigated. Here I show with displacement experiments that Cataglyphis ants need enough space and enough time to perform learning walks. Spatially restricted novices, i. e. naïve ants, could not find back to the nest when tested as foragers later on. Furthermore, ants have to perform several learning walks over 1-3 days to gain landmark information for successful homing as foragers. An increasing number of feeder visits also increases the importance of landmark information, whereas in the beginning ants fully rely on their path-integration vector. Learning walks are well-structured. High-speed video analysis revealed that Cataglyphis ants include species-specific rotational elements in their learning walks. Greek Cataglyphis ants (C. noda and C. aenescens) inhabiting a cluttered pine forest perform voltes, small walked circles, and pirouettes, tight turns about the body axis with frequent stopping phases. During the longest stopping phases, the ants gaze back to their nest entrance. The Tunisian Cataglyphis fortis ants inhabiting featureless saltpans only perform voltes without directed gazes. The function of voltes has not yet been revealed. In contrast, the fine structure of pirouettes suggests that the ants take snapshots of the panorama towards their homing direction to memorize the nest’s surroundings. The most likely hypothesis was that Cataglyphis ants align the gaze directions using their path integrator, which gets directional input from celestial cues during foraging. To test this hypothesis, a manipulation experiment was performed changing the celestial cues above the nest entrance (no sun, no natural polarization pattern, no UV light). The accurately directed gazes to the nest entrance offer an easily quantifiable readout suitable to ask the ants where they expect their nest entrance. Unexpectedly, all novices performing learning walks under artificial sky conditions looked back to the nest entrance. This was especially surprising, because neuronal changes in the mushroom bodies and the central complex receiving visual input could only be induced with the natural sky when comparing test animals with interior workers. The behavioral findings indicated that Cataglyphis ants use another directional reference system to align their gaze directions during the longest stopping phases of learning walk pirouettes. One possibility was the earth’s magnetic field. Indeed, already disarraying the geomagnetic field at the nest entrance with an electromagnetic flat coil indicated that the ants use magnetic information to align their looks back to the nest entrance. To investigate this finding further, ants were confronted with a controlled magnetic field using a Helmholtz coil. Elimination of the horizontal field component led to undirected gaze directions like the disarray did. Rotating the magnetic field about 90°, 180° or -90° shifted the ants’ gaze directions in a predictable manner. Therefore, the earth’s magnetic field is a necessary and sufficient reference system for aligning nest-centered gazes during learning-walk pirouettes. Whether it is additionally used for other navigational purposes, e. g. for calibrating the solar ephemeris, remains to be tested. Maybe the voltes performed by all Cataglyphis ant species investigated so far can help to answer this question..
The mold Aspergillus fumigatus causes life-threatening infections in immunocompromised patients. Over the past decade new findings in research have improved our understanding of A. fumigatus-host interactions. One of them was the detection of localized areas of tissue hypoxia in the lungs of mice infected with A. fumigatus. The transcription factor hypoxia-inducible factor 1α (HIF 1α) is known as the central regulator of cellular responses to hypoxia. Under normoxia, this constitutively expressed protein is degraded by oxygen-dependent mechanisms in most mammalian cell types. Interaction with pathogens can induce HIF 1α stabilization under normoxic conditions in innate immune cells. Bacterial infection models revealed that hypoxic microenvironments and signaling via HIF 1α modulate functions of host immune cells. Moreover, it was recently described that in murine phagocytes, HIF 1α expression is essential to overcome an A. fumigatus infection. However, the influence of hypoxia and the role of HIF 1α signaling for anti-A. fumigatus immunity is still poorly understood, especially regarding dendritic cells (DCs), which are important regulators of anti-fungal immunity. In this study, the functional relevance of hypoxia and HIF 1α signaling in the response of human DCs against A. fumigatus has been investigated.
Hypoxia attenuated the pro-inflammatory response of DCs against A. fumigatus during the initial infection as shown by genome-wide microarray expression analyses and cytokine quantification. The up-regulation of maturation-associated molecules on DCs stimulated with A. fumigatus under hypoxia was reduced; however, these DCs possessed an enhanced capacity to stimulate T cells. This study thereby revealed divergent influence of hypoxia on anti-A. fumigatus DC functions that included both, inhibiting and enhancing effects.
HIF-1α was stabilized in DCs following stimulation with A. fumigatus under normoxic and hypoxic conditions. This stabilization was partially dependent on Dectin-1, the major receptor for A. fumigatus on human DCs. Using siRNA-based HIF 1α silencing combined with gene expression microarrays, a modulatory effect of HIF-1α on the anti-fungal immune response of human DCs was identified. Specifically, the transcriptomes of HIF-1α silenced DCs indicated that HIF-1α enhanced DC metabolism and cytokine release in response to A. fumigatus under normoxic and hypoxic conditions. This was confirmed by further down-stream analyses that included quantification of glycolytic activity and cytokine profiling of DCs. By that, this study demonstrated functional relevance of HIF 1α expression in DCs responding to A. fumigatus. The data give novel insight into the cellular functions of HIF 1α in human DCs that include regulation of the anti-fungal immune response under normoxia and hypoxia. The comprehensive transcriptome datasets in combination with the down-stream protein analyses from this study will promote further investigations to further characterize the complex interplay between hypoxia, activation of Dectin-1 and HIF-1α signaling in host responses against A. fumigatus.
This study investigates mechanisms and consequences of sexual selection in a polygynous population of dusky warblers Phylloscopus fuscatus, breeding near Magadan in the Russian Far East. In particular, the study focuses on individual variation in the reproductive behaviours of both females and males. The mating system of this population is characterised by facultative polygyny (17 per cent of the males mated with more than one female), and by an outstandingly high rate of extra-pair paternity (45 per cent of the offspring was not sired by the social partner of the female). The occurrence of polygyny is best explained by the ‘polygyny-threshold model’ (PTM). A novel finding of this study is that female mating decisions follow a conditional strategy. First-year females that have no prior breeding experience prefer monogamy over territory quality, while older females more often mate polygynously. I argue that the costs of receiving no male help may be higher for inexperienced females, while the benefits of having a free choice between territories may be higher for individuals that know which territories had the highest breeding success in previous years. Furthermore, I find support for the existence of two female mating strategies. The ‘emancipated’ female which is not dependent on male help, is free to choose the best territory and the best copulation partners. The ‘help-dependent’ female, in contrast, is bound to find a partner who is willing to assist her with brood care, thus she will have to accept territories and genetic fathers of lesser quality. The most unexpected finding on female mating behaviours is that this dichotomy between emancipated and help-dependent females is accompanied by morphological specialisation, which indicates that there is genetic variation underlying these female mating strategies. Male mating behaviours are characterised by competition for ownership of the best territories and by advertisement of male quality to females, as these are the factors which largely determine male reproductive success. Male success in obtaining copulations depended on the quality of their song, a fact that explains why males spend most of the daytime singing during the period when females are fertile. Individuals that were able to maintain a relatively high sound amplitude during rapid frequency modulations were consistently preferred by females as copulation partners. Studies of physiological limitations on sound production suggest that such subtle differences in male singing performance can provide an honest reflection of male quality. The present study is the first to indicate that females may judge the quality of a male’s song by his performance in sound production. Quality of song was also related to winter survival, which suggests that females can enhance the viability of their offspring by seeking extra-pair fertilisations from good singers (good-genes hypothesis). In general, the present study demonstrates that a complete understanding of avian mating systems is not possible without a detailed analysis of alternative behavioural strategies and of how individuals adjust their reproductive tactics according to their individual needs and abilities.
1. Zusammenfassung
Während der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege für Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenläsion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose, führt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verzögerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Auslöser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das für eines von fünf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschlüsseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken.
Primäre pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erhöhte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen Häufung von Mitochondrien - ein frühes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern.
Aus älteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF über den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen führt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabhängigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abhängige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilität von axonalen Mitochondrien aus.
Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen primärer pmn mutierter und wildtypischer
Motoneurone erhöht und einen Anstieg von ATP auslöst. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) auslöst, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, nämlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien.
Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\
Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\
Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\
The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\
During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\
In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\
This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\
The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\
In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\
Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\
Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\
With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\
Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\
Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research.
Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden.
The monarch butterfly (Danaus plexippus) performs one of the most astonishing behaviors in the animal kingdom: every fall millions of these butterflies leave their breeding grounds in North Amerika and migrate more than 4.000 km southwards until they reach their overwintering habitat in Central Mexico. To maintain their migratory direction over this enormous distance, the butterflies use a time-compensated sun compass. Beside this, skylight polarization, the Earth’s magnetic field and specific mountain ranges seem to guide the butterflies as well the south. In contrast to this fascinating orientation ability, the behavior of the butterflies in their non-migratory state received less attention. Although they do not travel long distances, they still need to orient themselves to find food, mating partners or get away from competitors. The aim of the present doctoral thesis was to investigate use of visual cues for orientation in migrating as well as non-migrating monarch butterflies. For this, field experiments investigating the migration of the butterflies in Texas (USA) were combined with experiments testing the orientation performance of non-migratory butterflies in Germany.
In the first project, I recorded the heading directions of tethered butterflies during their annual fall migration. In an outdoor flight simulator, the butterflies maintained a southwards direction as long as they had a view of the sun’s position. Relocating the position of the sun by 180° using a mirror, revealed that the sun is the animals’ main orientation reference. Furthermore, I demonstrated that when the sun is blocked and a green light stimulus (simulated sun) is introduced, the animals interpreted this stimulus as the ‘real’ sun. However, this cue was not sufficient to set the migratory direction when simulated as the only visual cue in indoor experiments. When I presented the butterflies a linear polarization pattern additionally to the simulated sun, the animals headed in the correct southerly direction showing that multiple skylight cues are required to guide the butterflies during their migration.
In the second project, I, furthermore, demonstrated that non-migrating butterflies are able to maintain a constant direction with respect to a simulated sun. Interestingly, they ignored the spectral component of the stimulus and relied on the intensity instead. When a panoramic skyline was presented as the only orientation reference, the butterflies maintained their direction only for short time windows probably trying to stabilize their flight based on optic-flow information. Next, I investigated whether the butterflies combine celestial with local cues by simulating a sun stimulus together with a panoramic skyline. Under this conditions, the animals’ directedness was increased demonstrating that they combine multiple visual cues for spatial orientation.
Following up on the observation that a sun stimulus resulted in a different behavior than the panoramic skyline, I investigated in my third project which orientation strategies the butterflies use by presenting different simulated cues to them. While a bright stripe on a dark background elicited a strong attraction of the butterflies steering in the direction of the stimulus, the inverted version of the stimulus was used for flight stabilization. In contrast to this, the butterflies maintained arbitrary directions with a high directedness with respect to a simulated sun. In an ambiguous scenery with two identical stimuli (two bright stripes, two dark stripes, or two sun stimuli) set 180° apart, a constant flight course was only achieved when two sun stimuli were displayed suggesting an involvement of the animals’ internal compass. In contrast, the butterflies used two dark stripes for flight stabilization and were alternatingly attracted by two bright stripes. This shows that monarch butterflies use stimulus-dependent orientation strategies and gives the first evidence for different neuronal pathways controlling the output behavior.
The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells.
Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction.
This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda.
The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section.
Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes ΔaroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann.
Chapter 1 – General introduction
Anthropogenic land-use and climate change are the major drivers of the global biodiversity loss. Yet, biodiversity is essential for human well-being, as we depend on the availability of potable water, sufficient food and further benefits obtained from nature. Each species makes a somewhat unique contribution to these ecosystem services. Furthermore, species tolerate environmental stressors, such as climate change, differently. Thus, biodiversity is both the "engine" and the "insurance" for human well-being in a changing climate. Here, I investigate the effects of temperature and land use on herbivory (Chapter 2), predation (Chapter 3) and pest control (Chapter 4), and at the same time identify features of habitats (e.g. plant richness, proximity to different habitat types) and landscapes (e.g. landscape diversity, proportion of oilseed rape area) as potential management targets in an adaptation strategy to climate change. Finally, I discuss the similarities and differences between factors influencing herbivory, predation and pest control, while placing the observations in the context of climate change as a multifaceted phenomenon, and highlighting starting points for sustainable insect pest management (Chapter 5).
Chapter 2 – Plant richness, land use and temperature differently shape invertebrate leaf-chewing herbivory on major plant functional groups
Invertebrate herbivores are temperature-sensitive. Rising temperatures increase their metabolic rates and thus their demand for carbon-rich relative to protein-rich resources, which can lead to changes in the diets of generalist herbivores. Here, we quantified leaf-area loss to chewing invertebrates among three plant functional groups (legumes, non-leguminous forbs and grasses), which largely differ in C:N (carbon:nitrogen) ratio. This reseach was conducted along spatial temperature and land-use gradients in open herbaceous vegetation adjacent to different habitat types (forest, grassland, arable field, settlement). Herbivory largely differed among plant functional groups and was higher on legumes than forbs and grasses, except in open areas in forests. There, herbivory was similar among plant functional groups and on legumes lower than in grasslands. Also the presence of many plant families lowered herbivory on legumes. This suggests that open areas in forests and diverse vegetation provide certain protection against leaf damage to some plant families (e.g. legumes). This could be used as part of a conservation strategy for protected species. Overall, the effects of the dominant habitat type in the vicinity and diverse vegetation outweighed those of temperature and large-scale land use (e.g. grassland proportion, landscape diversity) on herbivory of legumes, forbs and grasses at the present time.
Chapter 3 – Landscape diversity and local temperature, but not climate, affect arthropod predation among habitat types
Herbivorous insects underlie top-down regulation by arthropod predators. Thereby, predation rates depend on predator community composition and behaviour, which is shaped by temperature, plant richness and land use. How the interaction of these factors affects the regulatory performance of predators was unknown. Therefore, we assessed arthropod predation rates on artificial caterpillars along temperature, and land-use gradients. On plots with low local mean temperature (≤ 7°C) often not a single caterpillar was attacked, which may be due to the temperature-dependent inactivity of arthropods. However, multi-annual mean temperature, plant richness and the dominant habitat type in the vicinity did not substantially affect arthropod predation rates. Highest arthropod predation rates were observed in diverse landscapes (2-km scale) independently of the locally dominanting habitat type. As landscape diversity, but not multi-annual mean temperature, affected arthropod predation rates, the diversification of landscapes may also support top-down regulation of herbivores independent of moderate increases of multi-annual mean temperature in the near future.
Chapter 4 – Pest control and yield of winter oilseed rape depend on spatiotemporal crop-cover dynamics and flowering onset: implications for global warming
Winter oilseed rape is an important oilseed crop in Europe, yet its seed yield is diminished through pests such as the pollen beetle and stem weevils. Damage from pollen beetles depends on pest abundances, but also on the timing of infestation relative to crop development as the bud stage is particularly vulnerable. The development of both oilseed rape and pollen beetles is temperature-dependent, while temperature effects on pest abundances are yet unknown, which brings opportunities and dangers to oilseed rape cropping under increased temperatures. We obtained measures of winter oilseed rape (flowering time, seed yield) and two of its major pests (pollen beetle, stem weevils) for the first time along both land-use and temperature gradients. Infestation with stem weevils was not influenced by any temperature or land-use aspect considered, and natural pest regulation of pollen beetles in terms of parasitism rates of pollen beetle larvae was low (< 30%), except on three out of 29 plots. Nonetheless, we could identify conditions favouring low pollen beetle abundances per plant and high seed yields. Low pollen beetle densities were favoured by a constant oilseed rape area relative to the preceding year (5-km scale), whereas a strong reduction in area (> 40%) caused high pest densities (concentration effect). This occurred more frequently in warmer regions, due to drought around sowing, which contributed to increased pollen beetle numbers in those regions. Yet, in warmer regions, oilseed rape flowered early, which possibly led to partial escape from pollen beetle infestation in the most vulnerable bud stage. This is also suggested by higher seed yields of early flowering oilseed rape fields, but not per se at higher temperatures. Thus, early flowering (e.g. cultivar selection) and the interannual coordination of oilseed rape area offer opportunities for environmental-friendly pollen beetle management.
Chapter 5 – General discussion
Anthropogenic land-use and climate change are major threats to biodiversity, and consequently to ecosystem functions, although I could show that ecosystem functions such as herbivory and predation barely responded to temperature along a spatial gradient at present time. Yet, it is important to keep several points in mind: (i) The high rate of climate warming likely reduces the time that species will have to adapt to temperature in the future; (ii) Beyond mean temperatures, many aspects of climate will change; (iii) The compensation of biodiversity loss through functional redundancy in arthropod communities may be depleted at some point; (iv) Measures of ecosystem functions are limited by methodological filters, so that changes may be captured incompletely. Although much uncertainty of the effects of climate and land-use change on ecosystem functions remains, actions to halt biodiversity loss and to interfere with natural processes in an environmentally friendly way, e.g. reduction of herbivory on crops, are urgently needed. With this thesis, I contribute options to the environment-friendly regulation of herbivory, which are at least to some extent climate resilient, and at the same time make a contribution to halt biodiversity loss. Yet, more research and a transformation process is needed to make human action more sustainable. In terms of crop protection, this means that the most common method of treating pests with fast-acting pesticides is not necessarily the most sustainable. To realize sustainable strategies, collective efforts will be needed targeted at crop damage prevention through reducing pest populations and densities in the medium to long term. The sooner we transform human action from environmentally damaging to biodiversity promoting, the higher is our insurance asset that secures human well-being under a changing climate.
Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.
Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsgerätes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch künstliche Säugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von primären Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt für eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis für ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann.
In the present study a knockout mouse model of the Popeye domain containing gene 2 (Popdc2) was generated and functionally characterized. The Popdc2 null mutants were viable with an apparent normal life span. ß-galactosidase staining to visualize the expression of the Popdc2-LacZ transgene revealed the presence of the Popdc2 in heart, bladder, smooth and skeletal muscles. In the heart LacZ was found to be present in cardiac myocytes with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. Holter ECGs records of the heart function of the 8 months (but not in 3 and 6 months) old mutant and WT littermates revealed a pronounced sinus bradycardia in the mutant mice in response to three different stress regimens: isoproterenol infusion, mental stress and a physical exercise. Histological examination of the Popdc2 null mutants SAN revealed structural alterations as was detected by HCN4 staining. Moreover, volume measurements using 3-D reconstructions of serial sections stained with HCN4 antibody revealed a volume reduction of about 30% in the mutant SAN. Taken together data presented in this study suggest that the Popdc2 KO mouse line may serve as an animal model of human sick sinus syndrome. In the second part of this thesis the Popdc2 gene promoter was analyzed. Three transcription factors binding sites were predicted in the promoter region and characterized.
Fische der Gattung Xiphophorus stellen eines der am besten untersuchten Modellsysteme zur Untersuchung genetischer Geschlechtsbestimmung innerhalb dieser Klasse von mehr als 24.000 Arten dar. X. maculatus kann männliche (XX/ XY) oder weibliche (WY/ YY) Heterogametie aufweisen. Zusätzlich sind atypische Geschlechtsbestimmungssysteme beschrieben worden, die auf autosomale Modifikatoren zurückgeführt wurden. Obwohl kürzlich das Mastergen der Geschlechtsbestimmung im Medaka (Oryzias latipes) als ein Mitglied der Dmrt-Genfamilie identifiziert wurde, konnte Dmrt1bY als Mastergen der Geschlechtsbestimmung von Xiphophorus und anderen Fischen ausgeschlossen werden. Xiphophorus wurde zum wissenschaftlichen Modellsystem, da bestimmte zwischenartliche Kreuzungshybride maligne Melanome entwickeln. Das dafür verantwortliche Onkogen Xmrk und sein physiologisches Gegenstück egfrb liegen eng gekoppelt (< 0,6 cM) in der Geschlechtsbestimmungsregion von X. maculatus. Die Kopplungsgruppe umfasst noch weitere Loci wie den geschlechtsbestimmenden Locus SD, den Locus RY für rötliche und gelb-bräunliche Farbmuster und den Locus Mdl, der außer schwarzen Pigmentflecken auch noch den Bildungsort und die Schwere der Melanome in Hybriden mit X. helleri steuert. Die enge Kopplung dieser Loci entspricht einem physikalischen Abstand von ca. 1 Megabase (Mb) und ermöglicht eine Strategie der positionellen Klonierung der von diesen Loci kodierten Gene. Die Analyse großer Cosmid- und BAC- (Bacterial Artificial Chromosome) Contigs, welche im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden und die mehr als 1 Mb sowohl des X- als auch des Y-Chromosoms des Platys X. maculatus abdecken, zeigte eine hohe Dichte von Retroelementen und anderen repetitiven Sequenzen, besonders im Bereich des dominanten Onkogens Xmrk und in einer durch das duplizierte Gen ps-criptY gekennzeichneten, Y-spezifischen Region. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eines dieser Elemente (XIR) spezifisch auf dem Y-Chromosom akkumuliert, was möglicherweise einen frühen Schritt der Differenzierung der Geschlechtschromosomen des Platys darstellt. Es konnten mehrere Duplikationsereignisse in diese Region nachgewiesen werden. Erstens wurde egfrb dupliziert, dessen Kopie zum Onkogen Xmrk wurde. Zweitens konnte die mehrfache Duplikation eines Melanocortin-Rezeptorgens mc4r nachgewiesen werden, von dem 9 Kopien auf dem X-Chromosom in einer Tandem-ähnlichen Struktur vorliegen und mindestens 9 Kopien auf dem Y-Chromosom. Mindestens 11 der insgesamt 19 Kopien besitzen nicht unterbrochene offene Leseraster, deren konzeptionelle Translationsprodukte die strukturellen Charakteristika funktionaler Rezeptoren zeigen. Drittens wurde das autosomale Gen cript dupliziert und liegt nun in jeweils einer Kopie (ps-cript1) direkt stromabwärts von Xmrk auf beiden Geschlechtschromosomen und in einer zusätzlichen Kopie auf dem Y-Chromosom (ps-criptY), wo es eine Region mit Syntenie zum menschlichen Chromosom 2p markiert. Andere potentielle Gene zeigen Homologien zu den menschlichen Genen CHRNA, CHRND und TMEFF und lassen auf eine syntenische Region zum menschlichen Chromosom 2q schließen. Diese Region ist involviert in autosomale Geschlechtsumkehr im Mensch, allerdings wurde noch kein dafür verantwortliches Gen identifiziert. Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse der Analyse von Sequenzen in der geschlechtsbestimmenden Region von X. maculatus bilden die Basis für ein tieferes Verständnis der Mechanismen, die zur Plastizität der von der Xmrk-SD-Region vermittelten Eigenschaften führen. Auf dieser Grundlage sollten zukünftige Arbeiten zur Identifizierung des Mastergens der Geschlechtsbestimmung führen. Die Identifizierung dieses neuen Gens könnte außerdem zur Aufklärung anderer Geschlechtsbestimmungsmechanismen innerhalb der Fische beitragen, was besonders im Hinblick auf kommerziell genutzte Arten z.B. in der Aquakultur großen Nutzen bringen kann. Einige der analysierten Gene der Xmrk-Region zeigen geschlechtsspezifische Expressionsmuster, allerdings steht die funktionelle Analyse noch am Anfang. Phänotypen, die mit Pigmentmusterbildung und dem Zeitpunkt der sexuellen Reifung in Zusammenhang stehen, könnten auf den in dieser Arbeit identifizierten Melanocortin-Rezeptoren (mc4r) beruhen. Ihre strukturellen Eigenschaften und Expressionsmuster weisen auf ihre mögliche Rolle in einem oder mehreren dieser Vorgänge hin. Verglichen mit den nicht duplizierten Melanocortin-Rezeptoren anderer Vertebraten könnte die ungewöhnlich hohe Anzahl an Kopien als Grundlage für evolutionäre Veränderungen dieser Gene dienen. Obwohl ihre Funktionalität noch gezeigt werden muss, könnten diese Kopien typische evolutionäre Veränderungen duplizierter Gene wie die Übernahme einer neuen Funktion durch das Codieren neuer Proteine nach Mutationen, die Reduktion ihrer Funktion durch die auf weniger Gewebe eingeschränkte Expression und den Verlust ihrer Funktion durch Mutationen, die das Leseraster unterbrechen, zeigen.
Mechanismen zur Regulierung der Nestgröße während des Koloniewachstums bei Blattschneiderameisen
(2009)
Die Strukturen der Ameisennester, so wird seit einiger Zeit vermutet, entstehen aufgrund eines selbstorganisierten Prozesses, bei dem die einzelne Ameise nur über lokale Informationen verfügt, ohne eine Übersicht über das globale Muster zu haben. Die Gesamtstruktur resultiert demnach viel eher durch multiple Interaktionen, die entweder direkt zwischen den Individuen oder zwischen den Individuen und ihrer Umgebung stattfinden. Ziel dieser Arbeit war es, die Kriterien zu untersuchen, nach denen sich die Blattschneiderameisen während des Nestbaus richten, um so die Frage zu beantworten, ob es für die Entstehung der Strukturen nur der Interaktion mit der Umgebung bedarf oder ob direkte soziale Interaktionen auch einen Einfluss darauf haben. Betrachtet wurde dazu die Kontrolle der Nestgröße während verschiedener Stadien der Kolonieentwicklung: in der Gründungsphase, in der die Königin die Entscheidungen alleine und ohne soziale Interaktionen fällt; in der darauf folgenden Etablierungsphase, in der Arbeiterinnen entweder alleine oder in kleinen Gruppen die bereits existierenden Strukturen verändern; sowie im adulten Stadium, in der die Bautätigkeit von mehreren Tausend Arbeiterinnen ausgeführt werden kann. Königinnen graben unverzüglich nach dem Hochzeitsflug ein Gründungsnest, das aus einem vertikalen Tunnel und einer horizontalen Kammer besteht, in welcher die erste Brut und der Pilz gezüchtet werden. Um ein Gründungsnest zu graben, muss die Königin zuerst mit ihren Mandibeln kopfüber am Boden graben. Hierbei legt sie einen Tunnel an, der einen etwas größeren Durchmesser als sie selbst besitzt. Ist dann die gewünschte Tunnellänge erreicht, so wechselt sie vom vertikalen Tunnel zum horizontalen Kammergraben, worauf anschließend der Tunnel verschlossen wird. Die Frage, die sich nun stellt, ist, wie Atta vollenweideri Königinnen die Länge des Tunnels bewerten, um den Wechsel zum Kammergraben einzuleiten. Aufgrund der Ergebnisse wird angenommen, dass die Königinnen sowohl die Länge des Tunnels, wahrscheinlich über Propriozeption, als auch die Grabezeit abschätzen und mit einer internen Referenz vergleichen. Wurde demnach weder die erwartete Länge noch die maximal schon investierte Zeit erreicht, so fuhren die Königinnen fort den Tunnel zu verlängern. Der Wechsel vom Tunnel zum Kammergraben wurde dann eingeleitet, wenn die Königinnen, in Abhängigkeit von den jeweiligen Bodenbedingungen, entweder zuerst die erwartete Länge oder die zu investierende Zeit erreicht hatten. Daraufhin fingen sie an die Kammer zu bauen, wobei sie die nun ausgegrabenen Lehmpartikel dazu benutzten, den Tunnel zu verschließen. Diese wurden von oben bis unten komplett verschlossen, womit die Kammergrößen von den Tunnellängen abhängig waren. Wurden die Königinnen jedoch mit Tunneln konfrontiert, die experimentell über die erwartete Länge hinaus verlängert wurden, so wurden diese nicht mehr über die komplette Strecke, sondern in mehreren Teilabschnitten verschlossen. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulierung der Kammergröße ein weiterer Mechanismus involviert ist. Nach 2-3 Monaten schlüpfen in der Regel die ersten Arbeiterinnen, womit die Kolonie in die Wachstumsphase eintritt. Mit dem Wachsen der Kolonie wird das Gründungsnest verändert, wobei die Arbeiterinnen die bereits existierende Pilzkammer vergrößern und neue Tunnel anlegen. Nach welchen Kriterien sie sich dabei richten, war allerdings nicht bekannt. Gezeigt werden konnte, dass Acromyrmex lundi Arbeiterinnen anfangen ein Nest zu vergrößern, wenn sich der frei für die Ameisen zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert und dass sie aufhören, wenn wiederum genügend Platz vorhanden ist. Eine Zunahme in der Gruppengröße (1, 2, 6 und 12 Tiere) bewirkte somit, einen proportionalen Anstieg des ausgegrabenen Volumens und damit der Arbeitsleistung der Kolonie. Ob beim Graben aber eher die schon vorhandenen Pilzkammer vergrößert oder neue Tunnel angelegt werden, hing von der Stimuluskombination ab. So bewirkte ein Platzmangel, ausgelöst durch eine, relativ zur Nestgröße, große Zahl an Arbeiterinnen, das bereits existierende Tunnel verlängert oder neue angelegt wurden. Eine Kammervergrößerung konnte dagegen nur beobachtet werden wenn Pilz vorhanden und der Platz in der Kammer reduziert war. Die Arbeiterinnen reagierten dabei, auf dieselben Stimuli mit denselben Verhaltensmustern, unabhängig davon ob sie alleine oder in einer Gruppe gruben. Je mehr Ameisen sich aber in der Gruppe befanden desto mehr wurden die Kammern zunächst vergrößert, wobei sich jedoch keine Korrelation mit der Gruppengröße zeigte. Dies lässt darauf schließen, dass die Vergrößerung von den sich gleichzeitig am Graben beteiligenden Ameisen abhängt, die die Kammern so lange vergrößern bis genügend Platz vorhanden ist. Die Zahl der Ameisen die sich jedoch am Graben beteiligen nimmt mit steigender Gruppengröße zu, weswegen die Kammern bei großen Ameisenzahlen größer wurden. Gleichzeitig mit dem Vergrößern fingen die Ameisen jedoch an ausgegrabene Lehmpartikel in der Kammer zu deponieren. Dies bewirkte, dass vor allem größere Kammern im Nachhinein verkleinert wurden, bis ein bestimmter Abstand zum Pilz erreicht war, bei dem eventuell zwei Ameisen aneinander vorbeilaufen konnten. Somit hatte die Einlagerung der Lehmpartikel in der Kammer zur Folge, dass die Kammergröße im Nachhinein besser dem Pilzvolumen angepasst wurde. Ähnlich wie bei der Kammervergrößerung verhielt es sich beim Anlegen der Tunnel. Auch diese wurden umso breiter je mehr Tiere sich gleichzeitig am Graben beteiligten und wurden dann im Nachhinein durch Einlagerung von Lehmpartikeln auf eine bestimmte Breite reduziert. Zusätzlich wurden die Tunnel aber auch umso länger je mehr Ameisen sich in der Gruppe befanden, weshalb die Nestgröße über die Größe der Gruppe reguliert wurde. Acromyrmex lundi Nester bestehen in der Regel aus einer großen zentralen Pilzkammer und aus mehreren Tunneln, die diese mit der Erdoberfläche verbinden. Wie die Ameisen in dem adulten Stadium die Größe der Pilzkammer regulieren, wurde bisher noch nicht untersucht. Als mögliche Kriterien, nach denen sich die Ameisen richten könnten, wurde sowohl das vorhandene Pilzvolumen als auch die Anzahl an Arbeiterinnen in Betracht gezogen. Gezeigt werden konnte, dass die Kammern umso größer werden, je mehr Pilzvolumen vorhanden ist. Aufgrund dessen wird angenommen, dass der Pilz beim Bau der Pilzkammer als Vorlage dient und somit das Grabeverhalten räumlich organisiert. Eine Erhöhung der Ameisenzahlen bewirkte dagegen eine Vergrößerung des Nestvolumens durch das Anlegen von Tunneln. Dadurch nahm das insgesamt ausgegrabene Volumen und damit die Grabeaktivität mit der Größe der Kolonie zu. Allerdings stieg es nicht, wie bei den kleinen Gruppen beobachtet werden konnte, proportional zur Koloniegröße an. Vermutet wird, dass sowohl die Kammer- als auch die Nestvergrößerung über die Individuendichte reguliert wird. Demnach würden die Tiere anfangen zu graben, wenn die Individuendichte über einen Schwellenwert ansteigt und aufhören, wenn die Dichte wiederum unter diesen Schwellenwert fällt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die Grabeaktivität nicht nur über die Individuendichte, sondern zusätzlich noch durch ein rhythmisches Graben in der Nacht geregelt zu sein scheint. Zusammengenommen konnte also gezeigt werden, dass Königinnen auf Stimuli in ihrer Umgebung reagieren, indem sie die Tiefe des Gründungsnestes durch das Abschätzen der schon gegrabenen Tunnellänge bestimmen. Das Nestgraben erfolgt allerdings nicht nach einem einfachen Stimulus-Antwort-Mechanismus, sondern die Königinnen richten sich zusätzlich noch nach der Zeit, was einen internen Messfaktor darstellt. Ebenfalls scheint die Kammergröße durch mindestens zwei Mechanismen reguliert zu werden. Somit fließen sowohl bei der Bestimmung der Tunnellänge als auch bei der Regulation der Kammergröße mehrere Kriterien in die Entscheidung mit ein. Ebenso wie die Königinnen reagieren einzelne Individuen auf unterschiedliche Stimuli in ihrer Umgebung, wodurch unterschiedliche Neststrukturen entstehen können. So fangen Ameisen an ein Nest zu vergrößern, wenn sich der zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert. Wächst der Pilz so reduziert sich der Abstand zwischen Pilz und Kammerwand, was für die Tiere ein Signal ist, die Kammer zu vergrößern. Dabei wird der Pilz als Vorlage verwendet, der das Graben räumlich organisiert. Ist der Platz innerhalb des Nestes dagegen aufgrund des Koloniewachstums reduziert, so fangen die Arbeiterinnen an Tunnel auszugraben, so dass die Nestgröße der Koloniegröße angepasst wird. Allerdings, so wird vermutet, hängt die Anzahl der sich am Graben beteiligenden Ameisen sowie auch deren Arbeitsleistung von der Größe der Gruppe ab. Demnach sind die Individuen nicht nur sensitiv auf die Stimuli, die aus ihrer Umgebung kommen, sondern ändern ihr Verhalten auch in Abhängigkeit von dem sozialen Umfeld, in dem sie sich befinden.
Effects of timing and herbivory on a grass-endophyte association and its trophic interactions
(2017)
I.) Plant associated microorganisms can affect the plant`s interaction with herbivores and higher trophic levels. For instance, endophytic fungi infecting aerial plant parts of grass species produce bioactive alkaloids that can negatively affect species from higher trophic levels, indicating a defensive mutualism between the grass and the endophyte. However, beneficial insects can also be negatively affected by the endophyte, which might question the mutualistic effect of endophytic fungi. On the other hand, grass-endophytes are affected by environmental conditions and species interactions. Grazing can increase endophyte frequencies in natural habitats. Furthermore, endophyte mediated effects on herbivores are most pronounced during warm summers following rainy springs. In this study, we investigated whether endophyte derived alkaloids cascade up a food chain (chapter II) and whether their concentrations depend on plant age and season (chapter III). Further we analysed, whether altered herbivore phenology affects the endophytic fungus (chapter IV) and whether endophyte derived alkaloid production is induced by different herbivore species (chapter V).
II.) In our first experimental study we analysed whether grass-endophyte derived alkaloids decreased the performance of two ladybird species feeding on aphids exclusively reared on endophyte infected grass (6 weeks young grass). Further, we screened species from three trophic levels (grass, herbivores and aphid predators) for their alkaloid content using two year old infected grass as diet for herbivores. We established an UPLC-MS method to detect and quantify the amount of the endophyte derived alkaloids peramine and lolitrem B extracted from the organic plant and insect material. Performance parameters of ladybirds revealed little differences between ladybirds fed on aphids reared on endophyte infected and non-infected grass, which probably resulted from low alkaloid concentrations in the young (6-weeks old) endophyte infected grass used in this part of the study. Alkaloid quantification of the two year old endophyte infected grass, herbivores and aphid predators revealed similar concentrations between grass and aphids, while aphid predators contained approximately half of that amount which still exceeded the bioactive threshold. We conclude that alkaloids produced by grass-endophytes cascade up the food chain and are responsible for fitness disadvantages of higher trophic levels.
III.) In the second study we investigated the impact of plant age and seasonal timing on grass-endophyte growth and alkaloid production. Plants were sown in April of 2013 and sampled monthly over 30 consecutive months. Endophyte growth was quantified with real-time PCR (qPCR) and alkaloid concentrations with UPLC-MS. We showed that alkaloid concentrations and fungal growth followed a seasonal rhythmicity and that alkaloid concentrations increased with plant age. Alkaloid concentrations peak during summer, when also herbivore abundances are high. Consequently, we conclude that plant age and season contribute to the toxicity of endophytes on grass herbivores
IV.) In the third study we simulated earlier spring arrival of aphids by enhancing aphid abundance on endophyte infected and endophyte-free grass in spring and analysed responses across three trophic levels. Enhanced aphid abundance in spring caused higher aphid abundances during the study period. Predators stayed unaffected by increased herbivore abundances; however they did level aphid numbers within two weeks after arrival on the plants, independent of aphid abundance. Grass-endophyte showed a time delayed growth, two weeks after aphid abundance peak and after predators already controlled aphid infestations on the plants. We conclude that phenology shifts of herbivorous insects can affect multi-trophic interactions leading to desynchronizations between phenologies of interacting species and mismatches in food-webs.
V.) In the fourth study we analysed whether herbivores induce endophyte growth and alkaloid production and whether different types of herbivores induce specific alkaloid production. We applied three different herbivore treatments on endophyte infected grass over 18 weeks. Locust herbivory increased the insect deterring alkaloid peramine and clipping of plants (simulation of grazing livestock) increased the vertebrate toxic alkaloid lolitrem B. Aphid herbivory did not affect endophyte derived alkaloid concentrations. Endophyte responses to herbivory were species specific which indicates a primarily plant protecting role of alkaloid synthesis in endophyte infected plants and a close chemical crosstalk between interacting species.
VI.) In summary, we showed that endophyte derived alkaloids affect higher trophic levels and that alkaloid concentrations in the plant depend on prevalent herbivore species, plant age and seasonal timing. Our results indicate a close chemical crosstalk between the host plant and the endophytic fungus which is susceptible to environmental changes altering the endophyte`s alkaloid production in plants. We gained insights into the grass-endophyte symbiosis in ecological contexts and conclude that several factors determine the herbivore toxic potential of endophytic fungi and thereby their plant mutualistic or parasitic character. Future studies should investigate the mechanisms behind the herbivore induced alkaloid concentration increase, shown in this thesis, especially whether plant signals mediate the endophyte response. Furthermore it would be interesting to study the induction of indirect endophyte mediated defence and how it affects multi-trophic level interactions.
SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.
Die Schistosomiasis ist nach wie vor eine der häufigsten parasitären Erkrankungen der Welt und verursacht erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Folgen, insbesondere in ärmeren, ländlichen Regionen. Durch Immunreaktionen auf die im Wirt abgelegten Eier des Parasiten können sich chronische Verlaufsformen manifestieren. Dabei kann es zu irreversiblen Schäden kommen. Um dies zu verhindern sind eine frühe und sichere Diagnose sowie eine Behandlung mit Praziquantel (PZQ) unabdingbar. Zudem spielt der zuverlässige Nachweis der Schistosomiasis eine Schlüsselrolle bei der Überwachung, Prävention und Kontrolle der Erkrankung. In epidemiologischen Studien findet am häufigsten die mikroskopische Kato-Katz (KK)-Methode zum Nachweis von Schistosoma mansoni Eiern im Stuhl Anwendung. Dieses Verfahren ist äußerst spezifisch und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung, wodurch die Intensität der vorliegenden Infektion bestimmt werden kann. Die Sensitivität der Testmethode ist jedoch nur moderat, insbesondere bei einer niedrigen Infektionsintensität. Zudem kann eine Infektion erst nach der Präpatenzzeit nachgewiesen werden. Der ebenfalls häufig eingesetzte urinbasierte Point-of-Care Circulating Cathodic Antigen (POC-CCA)-Test weist zwar eine höhere Sensitivität aber geringere Spezifität als das KK-Verfahren auf. Als hochsensitive und sehr spezifische Methode zur Diagnose der Schistosomiasis hat sich der Nachweis von Schistosoma-spezifischer DNA mittels Real-Time PCR herausgestellt. Allerdings wird für die Durchführung dieser Technik ein gut ausgestattetes Labor benötigt, das sich in der Regel nicht in unmittelbarer Nähe zum Patienten im Feld befindet. Daher ist es besonders wichtig, über praktikable und schnelle Konservierungsmethoden zu verfügen, die bevor die Extraktion und Amplifikation der DNA stattfindet, einen einfachen Transport und eine einfache Lagerung des Probenmaterials ermöglichen.
Das Ziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit war, die Sensitivität und Spezifität der klassischerweise verwendeten KK-Methode und des POC-CCA-Tests mit der
Real-Time PCR- Methode unter Verwendung von Stuhlproben, Urinproben, Serumproben sowie auf Filterpapier getrocknete Blutproben (dried blood spots – DBSs) zu vergleichen. Zudem wurde die Anwendbarkeit der Real-Time PCR aus Serum- und Urinproben zur Therapiekontrolle überprüft. Die dazu notwendigen Studien wurden alle in der Region Mwanza in Tansania durchgeführt, welche als hochendemisch für S. mansoni gilt. Für die Untersuchungen zur stuhlbasierten Real-Time PCR wurden als Studienteilnehmer Schulkinder gewählt. Aufgrund der erforderlichen Blutabnahme wurden die anderen Teilstudien nur mit erwachsenen Probanden durchgeführt. Unter Verwendung der KK-Methode als Goldstandard erzielten die Real-Time PCR aus Stuhlproben und der POC-CCA-Test sehr hohe Sensitivitäten von 99,5% bzw. 89,7%, jedoch nur geringe Spezifitäten von 29,55% und 22,73%. Die KK-Methode weist bekanntermaßen nur eine geringe bis moderate Sensitivität auf und ist daher nicht gut als Referenz geeignet. Deshalb wurde zusätzlich eine latente Klassenanalyse angewandt, um die tatsächlich Erkrankten zu ermitteln und anhand dieser die diagnostische Güte der verwendeten Tests zu bestimmen. Hier zeigte der POC-CCA-Test die höchste Sensitivität (99,5%) sowie eine Spezifität von 63,4%. Der Real-Time PCR-Test hatte eine Sensitivität von 98,7% und die höchste Spezifität (81,2%). Die Spezifität der KK-Technik betrug 72,8%, die Sensitivität war signifikant niedriger (89,7%) als bei den anderen beiden Methoden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der POC-CCA-Schnelltest empfindlicher ist als die KK-Methode und zum Screening von S. mansoni-Infektionen eingesetzt werden kann. Die Stuhl-PCR war zwar ebenfalls hochsensitiv und zeigte unter den drei getesteten Diagnoseverfahren die höchste Spezifität, aber aufgrund der höheren Kosten und der komplizierten Anwendung sollte für epidemiologische Untersuchungen in Hochprävalenzregionen der POC-CCA-Test bevorzugt werden. Bei unklaren Diagnosen kann die Real-Time PCR-Methode als Bestätigungstest Anwendung finden.
In der Teilstudie zur serum- und urinbasierten Real-Time PCR in einer endemischen Region vor und nach der Behandlung mit PZQ wurden folgende Ergebnisse erzielt: Unter Verwendung einer kombinierten Referenz aus den Ergebnissen des parasitologischen KK-Tests und / oder der serumbasierten PCR konnte zu Studienbeginn eine Prävalenz von S. mansoni von 77,1% ermittelt werden. In Bezug auf die Sensitivität zeigte der DNA-Nachweis aus Serum (96,3%) und der POC-CCA-Assay (77,8%) die höchsten Ergebnisse. Die urinbasierte Real-Time PCR zeigte die geringste Empfindlichkeit (33,3%). Durch die Behandlung mit Praziquantel wurde eine signifikante Reduktion der S. mansoni Prävalenz erreicht. Zwanzig Wochen nach Therapie konnte durch die KK-Methode keine, mit dem POC-CCA-Test 33,3% und mit der serumbasierten Real-Time PCR 58,3% Infektionen festgestellt werden. Die Analyse der mittels der serumbasierten PCR bestimmten mittleren Ct-Werte im zeitlichen Verlauf zeigte, dass dieser eine Woche nach der Behandlung signifikant abnahm (von 30,3 auf 28) und 20 Wochen später über den Basiswert (34,9) anstieg. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur DNA-Ausgangsmenge, die in die PCR eingesetzt wurde. Dies deutet darauf hin, dass kurz nach der Therapie ein DNA-Anstieg zu verzeichnen war und 20 Wochen später weniger DNA als zu Beginn der Studie nachweisbar war. Dieser DNA-Verlauf lässt verschiedene Interpretationsmöglichkeiten zu. Die Daten zeigen jedoch, dass die serumbasierte Real-Time PCR eine ausgezeichnete diagnostische Genauigkeit aufweist. Da die nachgewiesene DNA jedoch keine Rückschlüsse auf das Parasitenstadium zulässt und es sich hierbei auch um DNA aus im Gewebe verbliebenen Eiern oder Reinfektionen handeln könnte, ist diese Methode in Hochprävalenz- Regionen nicht zur Therapiekontrolle geeignet. Die Verwendung von Urin zum DNA-Nachweis erzielte keine vielversprechenden Ergebnisse. Die Sensitivität der Real-Time PCR aus DBSs war ebenfalls sehr gering (45,4%) und kann ohne weitere ausführliche Testung hinsichtlich Lagertemperatur, Lagerdauer, verschiedener Filterpapierarten und Extraktionsmethoden nicht empfohlen werden.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Studien, dass sowohl die stuhl- als auch die serumbasierte Real-Time PCR bei der Erkennung und Bewertung der Infektionsprävalenz, einem wichtigen Aspekt epidemiologischer Studien, deutlich empfindlicher ist als das mikroskopische KK-Verfahren. Aufgrund des hohen Kosten- und Personalaufwandes und der Notwendigkeit eines gut ausgestatteten Labors wird sich diese Methode aber nicht zum Screening in hochendemischen Ländern durchsetzen. Sie kann jedoch einen Mehrwert bei der Diagnose der Schistosomiasis bieten, vor allem bei frühen oder leichten Infektionen. Zudem kann diese hochsensitive und spezifische Methode als Bestätigungstest bei unklaren Diagnosen herangezogen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden malakologische Untersuchungen zur Identifizierung potenzieller Übertragungsorte für die Schistosomiasis rund um die im Viktoriasee gelegene Insel Ijinga durchgeführt. Diese Analysen fanden innerhalb eines Pilotprojektes zur Eliminierung der Erkrankung auf der Insel Ijinga statt, wobei ein intensiviertes Behandlungsprotokoll, welches die gesamte Inselbevölkerung einschloss, Anwendung fand. Die Kontrolle der Praziquanteleffektivität nach mehreren Behandlungsrunden bringt eine Reihe diagnostischer Herausforderungen mit sich. Hier könnte die Beurteilung der Schistosoma-Infektion in den Zwischenwirtschnecken vor und nach der Therapie als Indikator für den Erfolg der Maßnahme dienen. Zu diesem Zweck erfolgte zunächst eine Baseline-Untersuchung, bei der Schnecken an Uferregionen gesammelt wurden, an denen die Inselbewohner häufigen Wasserkontakt hatten. Die Schnecken wurden anhand morphologischer Merkmale identifiziert und mithilfe der Real-Time PCR-Methode auf Infektionen mit S. mansoni untersucht. Insgesamt wurden 35,4% (279/788) S. mansoni- positive Zwischenwirtschnecken (Biomphalaria) detektiert. Dies verdeutlicht, dass an den meisten Wasserkontaktstellen um die Insel Ijinga ein potentielles Risiko für die Übertragung der Schistosomiasis besteht. Die mithilfe der KK-Methode ermittelte Gesamtprävalenz von S. mansoni in der humanen Bevölkerung betrug 68,9%. Nachdem die Bewohner der Insel viermal mit PZQ behandelt wurden, zeigte sich in der kontinuierlich überwachten Sentinelgruppe eine Reduktion der Prävalenz auf 28,7%. Zu diesem Zeitpunkt wurde ebenfalls die Analyse der Schnecken wiederholt und es konnten 16,8% (57/350) Schnecken mit einer S. mansoni Infektion nachgewiesen werden. Die Reduktion der Infektionshäufigkeit in den Schnecken vor und nach der viermaligen Behandlung der Bevölkerung war signifikant (χ² = 74.335, p < 0,001). Dies deutet darauf hin, dass die intermediären Wirtsschnecken zur Überwachung von Kontrollmaßnahmen verwendet werden können.
T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains.
The phylum Tardigrada consists of about 1000 described species to date. The animals live in habitats within marine, freshwater and terrestrial ecosystems allover the world. Tardigrades are polyextremophiles. They are capable to resist extreme temperature, pressure or radiation. In the event of desiccation, tardigrades enter a so-called tun stage. The reason for their great tolerance capabilities against extreme environmental conditions is not discovered yet. Our Funcrypta project aims at finding answers to the question what mechanisms underlie these adaption capabilities particularly with regard to the species Milnesium tardigradum. The first part of this thesis describes the establishment of expressed sequence tags (ESTs) libraries for different stages of M. tardigradum. From proteomics data we bioinformatically identified 144 proteins with a known function and additionally 36 proteins which seemed to be specific for M. tardigradum. The generation of a comprehensive web-based database allows us to merge the proteome and transcriptome data. Therefore we created an annotation pipeline for the functional annotation of the protein and nucleotide sequences. Additionally, we clustered the obtained proteome dataset and identified some tardigrade-specific proteins (TSPs) which did not show homology to known proteins. Moreover, we examined the heat shock proteins of M. tardigradum and their different expression levels depending on the actual state of the animals. In further bioinformatical analyses of the whole data set, we discovered promising proteins and pathways which are described to be correlated with the stress tolerance, e.g. late embryogenesis abundant (LEA) proteins. Besides, we compared the tardigrades with nematodes, rotifers, yeast and man to identify shared and tardigrade specific stress pathways. An analysis of the 50 and 30 untranslated regions (UTRs) demonstrates a strong usage of stabilising motifs like the 15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE) but also reveals a lack of other common UTR motifs normally used, e.g. AU rich elements. The second part of this thesis focuses on the relatedness between several cryptic species within the tardigrade genus Paramacrobiotus. Therefore for the first time, we used the sequence-structure information of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) as a phylogenetic marker in tardigrades. This allowed the description of three new species which were indistinguishable using morphological characters or common molecular markers like the 18S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) or the Cytochrome c oxidase subunit I (COI). In a large in silico simulation study we also succeeded to show the benefit for the phylogenetic tree reconstruction by adding structure information to the ITS2 sequence. Next to the genus Paramacrobiotus we used the ITS2 to corroborate a monophyletic DO-group (Sphaeropleales) within the Chlorophyceae. Additionally we redesigned another comprehensive database—the ITS2 database resulting in a doubled number of sequence-structure pairs of the ITS2. In conclusion, this thesis shows the first insights (6 first author publications and 4 coauthor publications) into the reasons for the enormous adaption capabilities of tardigrades and offers a solution to the debate on the phylogenetic relatedness within the tardigrade genus Paramacrobiotus.
Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein.
The expression of the MYC proto-oncogene is elevated in a large proportion of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Previous findings in PDAC have shown that this increased MYC expression mediates immune evasion and promotes S-phase progression. How these functions are mediated and whether a downstream factor of MYC mediates these functions has remained elusive. Recent studies identifying the MYC interactome revealed a complex network of interaction partners, highlighting the need to identify the oncogenic pathway of MYC in an unbiased manner.
In this work, we have shown that MYC ensures genomic stability during S-phase and prevents transcription-replication conflicts. Depletion of MYC and inhibition of ATR kinase showed a synergistic effect to induce DNA damage. A targeted siRNA screen targeting downstream factors of MYC revealed that PAF1c is required for DNA repair and S-phase progression. Recruitment of PAF1c to RNAPII was shown to be MYC dependent. PAF1c was shown to be largely dispensable for cell proliferation and regulation of MYC target genes.
Depletion of CTR9, a subunit of PAF1c, caused strong tumor regression in a pancreatic ductal adenocarcinoma model, with long-term survival in a subset of mice. This effect was not due to induction of DNA damage, but to restoration of tumor immune surveillance.
Depletion of PAF1c resulted in the release of RNAPII with transcription elongation factors, including SPT6, from the bodies of long genes, promoting full-length transcription of short genes. This resulted in the downregulation of long DNA repair genes and the concomitant upregulation of short genes, including MHC class I genes. These data demonstrate that a balance between long and short gene transcription is essential for tumor progression and that interference with PAF1c levels shifts this balance toward a tumor-suppressive transcriptional program. It also directly links MYC-mediated S-phase progression to immune evasion. Unlike MYC, PAF1c has a stable, known folded structure; therefore, the development of a small molecule targeting PAF1c may disrupt the immune evasive function of MYC while sparing its physiological functions in cellular growth.
The Western Honeybee (Apis mellifera) is among the most versatile species in the world. Its adaptability is rooted in thousands of the differently specialized individuals acting jointly together. Thus, bees that are able to handle a certain task or condition well can back up other individuals less capable to do so on the colony level. Vice versa, the latter individuals might perform better in other situations. This evolutionary recipe for success ensures the survival of colonies despite challenging habitat conditions. In this context, the ectoparasitic mite Varroa destructor reflects the most pronounced biotic challenge to honeybees worldwide. Without proper treatment, infested colonies rapidly dwindle and ultimately die. Nevertheless, resistance behaviours against this parasite have evolved in some populations through natural selection, enabling colonies to survive untreated. In this, different behaviours appear to be adapted to the respective habitat conditions and may complement each other. Yet, the why and how of this behavioural response to the mite remains largely unknown. My thesis focuses on the biological background of Varroa-resistance traits in honeybees and presents important findings for the comprehension of this complex host-parasite interaction. Based on this, I draw implications for both, applied bee breeding and scientific investigations in the field of Varroa-resistance. Specifically, I focus on two traits commonly found in resistant and, to a lower degree, also mite-susceptible colonies: decreased mite reproduction and the uncapping and subsequent recapping of sealed brood cells. Examining failures in the reproductive success of mites as a primary mechanism of Varroa-resistance, I was able to link them to specific bee behaviours and external factors. Since mite reproduction and the brood rearing of bees are inevitably connected, I first investigated the effects of brood interruption on the reproductive success of mites. Brood interruption decreased the reproductive success of mites both immediately and in the long term. By examining the causes of reproductive failure, I could show that this was mainly due to an increased share of infertile mites. Furthermore, I proved that interruption in brood rearing significantly increased the expression of recapping behaviour. These findings consequently showed a dynamic modulation of mite reproduction and recapping, as well as a direct effect of brood interruption on both traits. To further elucidate the plasticity in the expression of both traits, I studied mite reproduction, recapping behaviour and infestation levels over the course of three years. The resulting extensive dataset unveiled a significant seasonal variation in mite reproduction and recapping. In addition, I show that recapping decreases the reproductive success of mites by increasing delayed developing female offspring and cells lacking male offspring. By establishing a novel picture-based brood investigation method, I could furthermore show that both the removal of brood cells and recapping activity specifically target brood ages in which mite offspring would be expected. Recapping, however, did not cause infertility of mites. Considering the findings of my first study, this points towards complementary mechanisms.
This underlines the importance of increased recapping behaviour and decreased mite reproduction as resistance traits, while at the same time emphasising the challenges of reliable data acquisition. To pave the way for a practical application of these findings in breeding, we then investigated the heritability (i.e., the share of genotypic variation on the observed phenotypic variation) of the accounted traits. By elaborating comparable test protocols and compiling data from over 4,000 colonies, we could, for the first time, demonstrate that recapping of infested cells and decreased reproductive success of mites are heritable (and thus selectable) traits in managed honeybee populations.
My thesis proves the importance of recapping and decreased mite reproduction as resistance traits and therefore valuable goals for breeding efforts. In this regard, I shed light on the underlying mechanisms of both traits, and present clear evidence for their interaction and heritability.
Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.
Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.
Despite belonging to the best described patterns in ecology, the mechanisms driving biodiversity along broad-scale climatic gradients, like the latitudinal gradient in diversity, remain poorly understood. Because of their high biodiversity, restricted spatial ranges, the continuous change in abiotic factors with altitude and their worldwide occurrence, mountains constitute ideal study systems to elucidate the predictors of global biodiversity patterns. However, mountain ecosystems are increasingly threatened by human land use and climate change. Since the consequences of such alterations on mountainous biodiversity and related ecosystem services are hardly known, research along elevational gradients is also of utmost importance from a conservation point of view. In addition to classical biodiversity research focusing on taxonomy, the significance of studying functional traits and their prominence in biodiversity ecosystem functioning (BEF) relationships is increasingly acknowledged. In this dissertation, I explore the patterns and drivers of mammal and dung beetle diversity along elevational and land use gradients on Mt. Kilimanjaro, Tanzania. Furthermore, I investigate the predictors of dung decomposition by dung beetles under different extinction scenarios.
Mammals are not only charismatic, they also fulfil important roles in ecosystems. They provide important ecosystem services such as seed dispersal and nutrient cycling by turning over high amounts of biomass. In chapter II, I show that mammal diversity and community biomass both exhibited a unimodal distribution with elevation on Mt.Kilimanjaro and were mainly impacted by primary productivity, a measure of the total food abundance, and the protection status of study plots. Due to their large size and endothermy, mammals, in contrast to most arthopods, are theoretically predicted to be limited by food availability. My results are in concordance with this prediction. The significantly higher diversity and biomass in the Kilimanjaro National Park and in other conservation areas underscore the important role of habitat protection is vital for the conservation of large mammal biodiversity on tropical mountains.
Dung beetles are dependent on mammals since they rely upon mammalian dung as a food and nesting resource. Dung beetles are also important ecosystem service providers: they play an important role in nutrient cycling, bioturbation, secondary seed dispersal and parasite suppression. In chapter III, I show that dung beetle diversity declined with elevation while dung beetle abundance followed a hump-shaped pattern along the elevational gradient. In contrast to mammals, dung beetle diversity was primarily predicted by temperature. Despite my attempt to accurately quantifiy mammalian dung resources by calculating mammalian defecation rates, I did not find an influence of dung resource availability on dung beetle richness. Instead, higher temperature translated into higher dung beetle diversity.
Apart from being important ecosystem service providers, dung beetles are also model organisms for BEF studies since they rely on a resource which can be quantified easily. In chapter IV, I explore dung decomposition by dung beetles along the elevational gradient by means of an exclosure experiment in the presence of the whole dung beetle community, in the absence of large dung beetles and without any dung beetles. I show that dung decomposition was the highest when the dung could be decomposed by the whole dung beetle community, while dung decomposition was significantly reduced in the sole presence of small dung beetles and the lowest in the absence of dung beetles. Furthermore, I demonstrate that the drivers of dung decomposition were depend on the intactness of the dung beetle community. While body size was the most important driver in the presence of the whole dung beetle community, species richness gained in importance when large dung beetles were excluded. In the most perturbed state of the system with no dung beetles present, temperature was the sole driver of dung decomposition. In conclusion, abiotic drivers become more important predictors of ecosystem services the more the study system is disturbed.
In this dissertation, I exemplify that the drivers of diversity along broad-scale climatic gradients on Mt. Kilimanjaro depend on the thermoregulatory strategy of organisms. While mammal diversity was mainly impacted by food/energy resources, dung beetle diversity was mainly limited by temperature. I also demonstrate the importance of protected areas for the preservation of large mammal biodiversity. Furthermore, I show that large dung beetles were disproportionately important for dung decomposition as dung decomposition significantly decreased when large dung beetles were excluded. As regards land use, I did not detect an overall effect on dung beetle and mammal diversity nor on dung beetle-mediated dung decomposition. However, for the most specialised mammal trophic guilds and dung beetle functional groups, negative land use effects were already visible. Even though the current moderate levels of land use on Mt. Kilimanjaro can sustain high levels of biodiversity, the pressure of the human population on Mt. Kilimanjaro is increasing and further land use intensification poses a great threat to biodiversity. In synergy wih land use, climate change is jeopardizing current patterns and levels of biodiversity with the potential to displace communities, which may have unpredictable consequences for ecosystem service provisioning in the future.
Der Connective tissue growth factor, CTGF, ist ein mit der EZM assoziiertes Protein, das diverse zelluläre Aktivitäten, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Migration, besitzt. Die umfassenden biologischen Eigenschaften des CTGF in verschiedenen Zelltypen spiegelt seine Fähigkeit, eine Vielfalt an Zelloberflächenmolekülen (HSPGs, Integrine, …) als auch andere bioaktive Moleküle (BMP-4, TGF-β1, ...) zu binden, wieder. Eine veränderte CTGF-Expression ist mit mehreren fibrotischen Erkrankungen assoziiert und CTGF selbst stimuliert die Entstehung und Progression fibrotischer Defekte. Genauere Informationen über den Einfluss des CTGF auf die Genexpression von Zellen waren bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde zunächst humanes CTGF in HEK-Zellen exprimiert und anschließend in mehreren chromatographischen Schritten aufgereinigt. Die biologische Charakterisierung zeigte, dass das rekombinante Protein mit BMP-2 in Oberflächenplasmonresonanzstudien und auf Zellbasis interagiert. Desweiteren konnte auch eine Interaktion mit Balb3T3-Zellen festgestellt werden. Die biologische Aktivität des Proteins wurde durch Proliferationsassays mit einer Endothelzelllinie und primären Fibroblasten des menschlichen Tenon bestätigt. Das reine rekombinante Protein wurde für Genexpressionsanalysen an humanen primären Fibroblasten des Tenon eingesetzt. Ergebnisse dieser Studie der Genexpression von HTF von drei unabhängigen Spendern zeigten, dass CTGF verschiedene biologische und physiologische Prozesse beeinflusst. Bekannte proliferatorische Eigenschaften und der Einfluss auf die EZM konnten bestätigt werden. Neben den bisher bekannten Funktionen der durch CTGF verursachten Effekte bei der Wundheilung, die überwiegend in der zweiten und dritten Phase der Wundheilung im Bereich der Umstrukturierung der EZM zu finden sind, konnten mehrere regulierte Gene nachgewiesen werden, die eine Rolle in der ersten Phase der Wundheilung, der Inflammation, spielen. Die interessantesten bisher im Zusammenhang mit CTGF noch nicht beschriebenen proinflammatorischen Proteine sind die CXC-Chemokine 1, 2, 6 und 8 sowie IL-6, die in den CTGF behandelten Fibroblasten stärker exprimiert waren. CTGF scheint somit eine mannigfaltige koordinierte Rolle in der Wundheilung am Auge, einschließlich Inflammation und EZM-Remodeling sowie möglicherweise auch in der Angiogenese und Hämostase, zu spielen und damit seine Rolle als mulitmodularer Faktor zu bestätigen.
Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte.