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Die Gattung Bordetella, die phylogenetisch in die Gruppe der β-Proteobakterien eingeordnet und zur Familie der Alcaligenaceae gezählt wird, umfasst nach heutigem Wissenstand neun Gram-negative Arten. Die klassischen Bordetella-Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica werden im sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zusammengefasst. Der strikt humanpathogene Erreger B. pertussis stellt als Verursacher des Keuchhustens das wohl bedeutendste Mitglied der Gattung dar. B. parapertussis ist der Verursacher von respiratorischen Erkrankungen in Menschen und Schafen, während B. bronchiseptica für Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren verantwortlich gemacht wird. Zudem kann B. bronchiseptica für einen längeren Zeitraum in der Umwelt überleben. Die in den letzte Jahren identifizierten „neuen“ Bordetella-Arten, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum und B. ansorpii, wurden alle human- oder tierassoziiert isoliert und besitzen unterschiedliches pathogenes Potential, das zum Teil noch näher untersucht werden muss. Eine Ausnahme stellt der aus einer anaeroben dechlorinierten Flusssediment-Anreicherungskultur isolierte Keim B. petrii dar. Dieser ist bis zum heutigen Zeitpunkt der einzige Umweltkeim der Gattung Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). In evolutionärer Hinsicht ist B. petrii besonders interessant, da er sowohl für orthologe Gene einiger Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert, als auch die typischen Eigenschaften eines Umweltkeims aufweist und somit als Bindeglied zu fungieren scheint. Ein solcher Virulenzfaktor ist das BvgAS-System, das in den pathogenen Bordetellen den Hauptregulator der Virulenzgenexpression darstellt, aber in B. petrii strukturell komplexer aufgebaut ist. Neben dem auf Aminosäureebene hoch konservierten Response Regulator bvgA, finden sich in B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, bvgS1 und bvgS2, sowie eine unabhängige hpt-Domäne. Eine periplasmatische Sensordomäne fehlt in beiden Kinasen, und nur in BvgS1 konnte eine PAS-Domäne identifiziert werden. In den letzten Jahren wurden zunehmend B. petrii-Isolate aus den verschiedensten Habitaten isoliert, wie z.B. das Schwammisolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) und das klinisches Isolat aus einem Patienten mit mandibulärer Osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde über einen PCR-Ansatz versucht, mit aus der Wildtypsequenz abgeleiteten Oligonukleotiden das BvgAS1,2-System der Isolate zu sequenzieren, aber nur im klinischen Isolat konnte ein orthologes Genfragment zum Response Regulator bvgA identifiziert werden. Ein Nachweis der Histidinkinasen sowie der hpt-Domäne schlug in allen untersuchten Isolaten fehl. Die vergleichenden Genomanalysen mittels DNA-Microarrays konnten aufgrund fehlender Hybridisierungen keine weiteren Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf DNA-Ebene zwischen den Isolaten und B. petrii DSM 12804 aufzeigen. B. petrii ist ein hoch variabler Umweltkeim, der sich an verschiedene Lebensbedingungen anpassen kann. Dies konnte auch durch die Isolation dreier phänotypisch unterscheidbare Varianten während eines Langzeitwachstumsversuches gezeigt werden (Lechner 2008). Durch die Genomsequenzierung von B. petrii DSM 12804 konnten wenigsten sieben genomischen Inseln beschrieben werden (Gross, Guzman et al. 2008), die durch unterschiedliche Exzision für die Entstehung der Varianten und daraus resultierend für die Variabilität in B. petrii verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Größe der einzelnen genomischen Inseln im Genom von B. petrii durch vergleichende Genomanalysen mittels DNA-Microarrays, mit Ausnahme von GI1, GI5 und GI6, im Vergleich zu den bioinformatischen Vorhersagen bestätigt werden. Diese Inseln zeigten in den Microarray-Analysen eine Vergrößerung bzw. Verkleinerung im Vergleich zu den zuvor beschrieben putativen Grenzen. Die große Instabilität des Genoms von B. petrii DSM 12804 konnte in dieser Arbeit auch durch Microarray-Analysen einzelner Klone aufgezeigt werden, die unterschiedliche Variationen im Bereich der genomischen Inseln aufwiesen. In den Analysen von B. petrii 12804 ΔbvgA bzw. ΔbvgAS konnten zusätzlich zu den gezielten Manipulation im BvgAS1,2-Lokus weitere Deletionen im Bereich von bpet0196-0200, bpet4219-4235 und bpet4176 detektiert werden. Die Re-Integration dieser Genbereiche nach Klonierung einer BvgA-Komplementationsmutante deutet auf eine extrachromosomale plasmid-ähnliche Struktur dieser Bereiche hin. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend bestätigt werden und bleibt weiter zu untersuchen. Im Verlauf der evolutionären Entwicklung der Bordetellen wurde das BvgAS-System, das ursprünglich für die Adaption an Umweltbedingungen mit verschiedenen Sauerstoff-konzentrationen und/oder Temperaturen zuständig war, mit der Regulation der Expression der Virulenzgene verknüpft (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In den Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Funktionalität des BvgAS1,2-Systems in B. petrii konnte aufgezeigt werden, dass die Temperatur ein wichtiger Signalgeber für die Expression des Flagellen- und Chemotaxisoperons ist. In B. bronchiseptica wird die Motilität, bei Temperaturen unter 25°C, negativ durch das BvgAS-System reguliert. Auch in B. petrii konnte in den Untersuchungen eine negative Regulation der Flagellen- und Chemotaxisgene durch das BvgAS1,2-System unter diesen Bedingungen detektiert werden. Ob aber in B. petrii die gleiche hierarchische Struktur zur Regulation der Motilität besteht wie in B. bronchiseptica, bleibt zu untersuchen. Im Verlauf der Untersuchungen konnte dem BvgAS-Zwei-Komponentensystem in B. petrii auch eine Funktion im Energiestoffwechsel eingeräumt werden, um auf wechselnde Sauerstoffbedingungen reagieren zu können. Die Messung des Sauerstoffgehaltes der Umgebung und damit eine Regulation der aeroben bzw. anaeroben Atmung erfolgt in B. petrii wahrscheinlich ebenfalls über das BvgAS1,2-System. Die in der Histidinkinase BvgS1 vorhergesagte PAS-Domäne scheint laut den Analysen für diesen Vorgang von großer Bedeutung zu sein. Desweiteren scheint das System auch die Zusammensetzung der Cytochromoxidase zur optimalen Anpassung an aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bedingungen zu regulieren.
Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp.
Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen.
Die 2001 beschriebene Art B. petrii stellt den ersten Umweltkeim der Gattung Bordetella dar, welcher aus einer anaeroben, dechlorinierenden Anreicherungskultur aus Flusssediment isoliert wurde. Phylogenetisch wird B. petrii an die Basis der Gattung Bordetella eingeordnet und ist in evolutionärer Hinsicht deshalb interessant, weil er sowohl für orthologe Gene bestimmter Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert als auch typische Eigenschaften von Umweltkeimen aufweist und somit eine Art Bindeglied darstellt. Da B. petrii ein orthologes BvgAS-System besitzt (der Hauptregulator der Virulenzgenexpression in den pathogenen Bordetellen), wurde dessen Struktur im Rahmen dieser Arbeit mittels in silico Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Konservierung nur auf Aminosäureebene deutlich zu erkennen ist und der Response Regulator BvgA von B. petrii die stärkste Konservierung aufweist. Desweiteren besitzt B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, BvgS1 und BvgS2, sowie ein separates Gen, welches für eine Hpt-Domäne kodiert. Weitere putative Virulenzfaktoren von B. petrii gehören in die Gruppe der Adhäsionsfaktoren. Diese Faktoren spielen bei den „klassischen“ Bordetellen im Infektionszyklus eine wichtige Rolle für die Anheftung z.B. an die Epithelzellen des Respirationstraktes. Um ein mögliches pathogenes Potential von B. petrii abschätzen zu können, wurden vergleichende Zellkulturstudien mit B. bronchiseptica durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass B. petrii um den Faktor 7,5 weniger in Makrophagen aufgenommen wird. Hinweise auf die Funktionalität des BvgAS-Systems in B. petrii wurden durch Proteomstudien mit einer BvgA-Mutante erhalten, und deuten darauf hin, dass das BvgAS-System in B. petrii möglicherweise eine Funktion in der Respirationskontrolle haben könnte. Im Rahmen der Genomsequenzierung wurden acht genomische Inseln beschrieben, die in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Struktur und ihrem Excisionsverhalten untersucht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die genomischen Inseln, mit Ausnahme der Insel GI0, in verschiedenen Kombinationen, als ringförmige Intermediate aus dem B. petrii Genom ausgeschnitten werden können. Vier der genomischen Inseln (GI1-GI3 und GI6) weisen strukturelle Ähnlichkeiten zu einer Familie syntenischer genomischer Inseln auf, zu denen auch das clc-Element von Pseudomonas sp. Strain B13 zählt. Die größte Ähnlichkeit zum clc-Element weist die Insel GI3 von B. petrii auf. Diese beiden Inseln haben annähernd die gleiche Größe und besitzen Gene zu Abbau von 3-Chlorobenzoat (3-CBA). Die Untersuchung der Stabilität von GI3 ergab, dass nach 125-150 Generationen nur noch 1,5 % der Bakterien die Insel GI3 enthielten. Desweiteren konnte die Übertragung der Insel GI3 von B. petrii auf B. bronchiseptica PS2 gezeigt und der Integrationsbereich bestimmt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch ein neuer Stammbaum der Gattung Bordetella erstellt, in welchen eine Reihe kürzlich neu beschriebener B. petrii Isolate mit aufgenommen wurden wodurch ein zu den pathogenen Bordetellen abgegrenztes Cluster gebildet wird.
Das four-jointed (fj) Gen in Drosophila ist zum einen am proximo-distalen Längenwachstum der Extremitäten beteiligt, zum anderen spielt es auch eine Rolle in dem in neuerer Zeit verstärkt untersuchten planaren Zellpolaritätssignalweg (PCP-Signalweg). Über das in der Maus identifizierte homologe fjx1 Gen ist dagegen vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die nähere Charakterisierung von fjx1 sowie die Identifizierung möglicher Interaktionspartner. Durch RNA in situ Hybridisierung wurde zunächst das räumliche und zeitliche Expressionsmuster von fjx1 in Embryonen und adulten Organen untersucht. Dabei zeigte sich, dass fjx1 in allen Stadien vor allem im Gehirn, aber auch in epithelialen Strukturen verschiedener Organe exprimiert war. Obwohl die Expression von fjx1 ebenso wie die von fj über den Notch-Signalweg reguliert wird, konnte im Gegensatz zu Drosophila jedoch keine Regulation von fjx1 über den Wnt- und/oder den JAK/STAT-Signalweg nachgewiesen werden. Da Fj in Drosophila zumindest teilweise sezerniert wird und nicht-zellautomome Effekte zeigt, wurde ein Fjx1-Rezeptor gesucht. Mit Hilfe eines Fjx1-AP Fusionsproteins konnten Bindungsstellen überlappend bzw. angrenzend zu Regionen mit fjx1-Expression gefunden werden. Beispielsweise zeigten in der embryonalen Lunge und der Niere sowohl die in situ Hybridisierung (fjx1-Expression) als auch die Inkubation mit dem Fusionsprotein (Lokalisation des Bindungspartners) Färbung in epithelialen Strukturen, während im adulten Gehirn die Färbungen in jeweils benachbarten Schichten des Hippocampus und des Kleinhirns detektiert wurden. Durch Expressionsklonierung bzw. Coimmunpräzipitation konnte der Rezeptor jedoch nicht identifiziert werden. Aufgrund der Tatsache dass fj in Drosophila in enger Beziehung zu dachsous (ds) und fat (ft) steht, wurden die homologen Gene in der Maus gesucht und deren Expressionsmuster analysiert. In Embryonalstadien war dchs1 komplementär zu fjx1 in mesenchymalen Geweben zu finden, ähnlich der Situation in Drosophila, wo fj und ds in gegenläufigen Gradienten exprimiert sind. Das homologe Gen von ft, fat-j, war hingegen nicht ubiquitär exprimiert, sondern wie dchs1 im Mesenchym. Ergänzend dazu wurden die fat-like (ftl) Homologen, fat1-3, epithelial detektiert. Die Expression in adulten Organen wurde mit Real-Time-PCR untersucht, die zeigte, dass alle Gene (fj, ds und fat Homologe) relativ stark im adulten Gehirn zu finden sind. Mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierungen konnten die Gene im Riechhirn, im Hippocampus und im Kortex des Großhirns sowie in der Körnerschicht des Kleinhirns lokalisiert werden. Um Hinweise auf die Funktion von Fjx1 zu erhalten, wurde in Datenbanken nach Proteinen mit ähnlicher Aminosäuresequenz gesucht, die eventuell Auskunft über mögliche Proteindomänen geben sollten. Bei den gefundenen fünf Mausproteinen handelte es sich jedoch um hypothetische bzw. noch nicht untersuchte Proteine, so dass Rückschlüsse auf die Funktion von Fjx1 nicht möglich waren. Die Expression dieser Gene war nach Datenbankangaben entweder sehr spezifisch, beschränkt auf ein bestimmtes Gewebe (z.B. Milchdrüse oder Nebenniere) oder schwach und dafür ubiquitär, was sich auch durch eine schwache, einheitliche Färbung in der RNA in situ Hybridisierung bestätigte. Die Proteinstruktur von Fjx1 und der Fjx1-ähnlichen Proteine sowie die Art der konservierten Reste geben Grund zu der Annahme, dass es sich um (sezernierte) Glykosyltransferasen handeln könnte, was durch die zumindest zeitweise Lokalisation von Fjx1 im Golgi-Apparat bestärkt wird. Auch die in Drosophila gefundenen Ergebnisse sprechen für eine derartige Funktion von Fj, obwohl auch hier noch keine konkreten biochemischen Belege vorliegen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Konservierung des in Drosophila entdeckten Fj/Ds/Ft-Siganlwegs in Vertebraten hin, wenn auch der genaue Mechanismus der Interaktion zwischen den Proteinen noch nicht geklärt ist und weiterer Untersuchungen bedarf.
Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.
In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Themenbereiche bearbeitet, die zur Charakterisierung der intrazellulären, bakteriellen Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus beitrugen. Es wurden phylogenetische Untersuchungen mit Hilfe der 16S rDNA-Sequenzen der Symbionten und der Sequenzen der Cytochrom-Oxidase-Untereinheit I (COI-Sequenzen) ihrer Wirte durchgeführt, die zur näheren Klärung der Fragen zu Übertragungsweg und Stellung der Camponotus-Endosymbionten verhalfen. Untersuchungen an dreizehn verschiedenen Camponotus-Arten brachten folgende Ergebnisse. Die intrazellulären Bakterien der Ameisen gehören zur g-Subklasse der Proteobakterien. Innerhalb des 16S-Stammbaumes der Symbionten kann man drei Untergruppen unterscheiden, in denen die einzelnen Arten enger miteinander verwandt sind. Bei den nächstverwandten Bakteriennachbarn der Camponotus-Endosymbionten handelt es sich um die ebenfalls symbiontisch lebenden Bakterien der Gattungen Wigglesworthia und Buchnera. Die Ameisen-Symbionten besitzen in ihren rrs-Genen intervenierende DNA-Sequenzen (IVS), die stabile Sekundärstrukturen ausbilden können. Ihre 16S-Gene sind nicht strangaufwärts von den 23S-Genen lokalisiert. Durch diese genetische Besonderheit ähneln die Camponotus-Symbionten den Buchnera-Symbionten, deren rRNA-Gene auf zwei Transkriptionseinheiten verteilt sind. Innerhalb des Stammbaumes der untersuchten Wirtsameisen existieren ebenfalls drei Untergruppen, deren einzelne Arten enger miteinander verwandt sind. Die direkte Gegenüberstellung des Symbionten-Stammbaumes mit dem der Ameisen zeigt ein weitgehend gleiches Verzweigungsmuster. Beide Dendrogramme zeigen signifikante Übereinstimmungen bezüglich ihrer taxonomischen Beziehungen und legen eine kongruente Entwicklung von Symbionten und Wirten, die nur durch einen vertikalen Übertragungsweg erzeugt werden kann, nahe. Einzige Ausnahme bildete hierbei der C. castaneus-Symbiont, bei dem ein horizontaler Transfer von Symbionten nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen ermöglichten die Benennung einer neuen Symbiontengattung innerhalb der gamma-Subgruppe der Proteobakterien: "Candidatus Blochmannia spp." Histologische Studien der Endosymbiose mit Hilfe von licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sollten Fragen zur Symbiontenlokalisation innerhalb adulter Individuen beantworten und die Ergebnisse zum Übertragungsweg der intrazellulären Bakterien festigen. Die Endosymbionten sind in den Mitteldarmepithelien von Arbeiterinnen, Königinnen und Männchen in Myzetozytenzellen lokalisiert, die in das Mitteldarmepithel interkalieren. Diese spezialisierten Zellen besitzen kaum Vesikel und tragen keinen Mikrovillisaum. In den Oozyten der Ovarien von Königinnen und Arbeiterinnen wurden ebenfalls große Symbiontenmengen gefunden. Die Spermatheka der Königinnen und die Geschlechtsorgane der Männchen waren symbiontenfrei. Die Abwesenheit von Symbionten innerhalb dieser beiden Organe zeigt, dass eine Bakterieninfektion der weiblichen Tiere nicht durch die Männchen stattfindet, sondern wie schon in den phylogenetischen Untersuchungen postuliert, ein rein maternaler Übertragungsweg der Symbionten vorliegt. Die Detektion der Bakterien in Eiern und Larven der Ameisen mittels In situ-Hybridisierungen trugen zur Aufklärung des Weges der Endosymbionten während der Embryogenese bei. Während sich im abgelegten Ei ein Ring aus Symbionten bildete, kam es in den Larvenstadien 1 bis 3 zur Auswanderung der Bakterien in Meso- bzw. Ektoderm. Im größten untersuchten Larvenstadium 4, das kurz vor der Verpuppung stand, konnten die Symbionten ausschließlich in den Myzetozyten des Mitteldarmes detektiert werden. Die Behandlung der Ameisen mit Antibiotika ermöglichte es, symbiontenfreie Ameisen zu erzeugen, die über einen längeren Zeitraum weiterlebten, ohne ihre Symbionten zu regenerieren. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, die intrazellulären Bakterien intakt aus dem sie umgebenden Mitteldarmgewebe zu isolieren. Somit konnten gereinigte Symbionten für Kultivierungs- und Infektionsversuche verwendet werden. Diese Versuche die mit Hilfe von Bakteriennährmedien und Insektenzelllinien durchgeführt wurden, zeigten jedoch sehr deutlich, dass es nicht möglich ist, die Camponotus-Symbionten außerhalb ihrer Wirte zu kultivieren.
Das Arbeitsgebiet Tissue Engineering befasst sich mit der Klärung der Mechanismen, die der Funktionen verschiedener Gewebearten zu Grunde liegen sowie mit der Entwicklung alternativer Strategien zur Behandlung von Organversagen bzw. Organverlusten. Einer der kritischsten Punkte im Tissue Engineering ist die ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Bioartifizielle Gewebe mit einer Dicke von bis zu 200 µm können mittels Diffusion ausreichend versorgt werden. Für dickere Transplantate ist die Versorgung der Zellen alleine durch Diffusion jedoch nicht gegeben. Hierfür müssen Mechanismen und Strategien zur Prävaskularisierung der artifiziellen Gewebekonstrukte entwickelt werden, damit die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung aller Zellen, auch im Inneren des Transplantates, von Anfang an gewährleistet ist. Eine wichtige Rolle bei der Prävaskularisierung spielt die Angiogenese. Dabei ist die Wahl einer geeigneten Zellquelle entscheidend, da die Zellen die Basis für die Angiogenese darstellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen (mvEZ) sind maßgeblich an der Angiogenese beteiligt. Das Problem bei der Verwendung von humanen primären mvEZ ist ihre geringe Verfügbarkeit, ihre limitierte Proliferationskapazität und der schnelle Verlust ihrer typischen Endothelzellmarker in-vitro. Der Aufbau standardisierter in-vitro Testsysteme ist durch die geringe Zellausbeute auch nicht möglich. Die upcyte® Technologie bietet hierfür einen Lösungsansatz. In der vorliegenden Arbeit konnten upcyte® mvEZ als Alternative zu primären mvEZ generiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen eine erweiterte Proliferationsfähigkeit aufweisen und im Vergleich zu primären mvEZ durchschnittlich 15 zusätzliche Populationsverdopplungen leisten können. Dadurch ist es möglich 3x104-fach mehr upcyte® mvEZ eines Spenders zu generieren verglichen mit den korrespondierenden Primärzellen. Die gute und ausreichende Verfügbarkeit der Zellen macht sie interessant für die Standardisierung von in-vitro Testsystemen, ebenso können die Zellen zur Prävaskularisierung von Transplantaten eingesetzt werden. Upcyte® mvEZ zeigen zahlreiche Primärzellmerkmale, die in der Literatur beschrieben sind. Im konfluenten Zustand zeigen sie die für primäre mvEZ spezifische pflastersteinartige Morphologie. Darüber hinaus exprimieren upcyte® mvEZ typische Endothelzellmarker wie CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 und VEGFR-2 vergleichbar zu primären mvEZ. Eine weitere endothelzellspezifische Eigenschaft ist die Bindung von Ulex europaeus agglutinin I Lektin an die alpha-L-Fucose enthaltene Kohlenhydratstrukturen von mvEZs. Auch hier wurden upcyte® Zellen mit primären mvEZ verglichen und zeigten die hierfür charkteristischen Strukturen. Zusätzlich zu Morphologie, Proliferationskapazität und endothelzellspezifischen Markern, zeigen upcyte® mvEZ auch mehrere funktionelle Eigenschaften, welche in primären mvEZ beobachtet werden können, wie beispielsweise die Aufnahme von Dil-markiertem acetyliertem Low Density Lipoprotein (Dil-Ac-LDL) oder die Fähigkeit den Prozess der Angiognese zu unterstützen. Zusätzlich bilden Sphäroide aus upcyte® mvEZ dreidimensionale luminäre Zellformationen in einer Kollagenmatrix aus. Diese Charakteristika zeigen den quasi-primären Phänotyp der upcyte® mvEZs. Upcyte® mvEZ stellen darüber hinaus eine neuartige mögliche Zellquelle für die Generierung prävaskularisierter Trägermaterialien im Tissue Engineering dar. In der vorliegenden Arbeit konnte die Wiederbesiedlung der biologisch vaskularisierte Matrix (BioVaSc) mit upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZ gezeigt werden. Der Einsatz von upcyte® mvEZ in der BioVaSc stellt einen neuen, vielversprechenden Ansatz zur Herstellung eines vaskularisierten Modells für Gewebekonstrukte dar, wie beispielsweise einem Leberkonstrukt. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZs sind und somit eine geeignete Alternative für die Generierung prävaskulierter Trägermaterialien und Aufbau von in-vitro Testsystemen darstellen. Darüber hinaus wurde ein neues, innovatives System für die Generierung einer perfundierten, mit Endothelzellen wiederbesiedelten Matrix für künstliches Gewebe in-vitro entwickelt.
Charakterisierung von angeborenen Hörstörungen mit Hilfe von Hochdurchsatz-Sequenziermethoden
(2020)
Fast 500 Millionen Menschen weltweit sind von einer Hörstörung betroffen. Es wird sogar angenommen, dass diese Anzahl laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) noch steigen und 2050 jeder zehnte Mensch eine Hörstörung aufweisen wird. Mindestens in 50% aller Fälle ist die Hörstörung genetisch bedingt. Durch die jüngsten Fortschritte der Sequenzierungstechnologien hat die genetische Analyse von Hörstörungen an Bedeutung gewonnen, vor allem hinsichtlich Familienplanung, geeigneter Therapien und zukünftiger möglichen Therapieansätzen, um das Hörvermögen wiederherzustellen. Die folgende Arbeit stellt 155 familiäre Fälle vor, die genetisch untersucht wurden. Diese Fälle konnten in zwei Kohorten unterteilt werden. Eine Kohorte (n = 74) umfasste Patienten mit kaukasischem Hintergrund, während die andere Kohorte (n = 81) Patienten beinhaltete, die aus dem Iran rekrutiert wurden. Für die Untersuchung wurde zum einen eine Panel-Analyse mit dem TruSight One Panel (Illumina, San Diego, USA) und zum anderen eine Exom-Sequenzierung durchgeführt. Anschließend wurden die Daten mit Analyse-Programmen wie GensearchNGS (PhenoSystems, Wallonia, Belgien) ausgewertet. Insgesamt konnte für 55% aller Fälle eine pathogene oder wahrscheinlich pathogene Variante durch Next Generation Sequencing diagnostiziert werden. Die meisten der gelösten Fälle (ca. 73%) stammten aus der iranischen Kohorte, was durch elterliche Blutsverwandtschaft und erhöhte Inzidenz von Hörstörungen im Iran zu erklären ist. 27% der gelösten Fälle gehörten der zweiten Kohorte an. Mutationen in den Genen MYO15A, LHFPL5, TECTA und SLC26A4 konnten überwiegend bei iranischen Patienten identifiziert werden. Varianten im Gen TECTA als auch im Gen SLC26A4 wurden ebenfalls in der kaukasischen Kohorte identifiziert. Beide Ethnien wiesen jeweils ein eigenes Mutationsspektrum auf. Jedoch wurden in beiden Gruppen Überschneidungen im klinischen Bild durch pathogene Varianten in einer Vielzahl von Hörstörungsgenen, sowie unterschiedliche klinische Phänotypen, deren Ursache pathogene Varianten im gleichen Hörstörungsgen zugrunde liegen, und familiäre Locus-Heterogenität beobachtet.. In dieser Arbeit konnte eine De Novo Mutation im CEACAM16-Gen (DFNA4B) bestätigt und der Effekt von einer wiederholt betroffenen Aminosäure im S1PR2-Gen (DFNB68) beschrieben werden. Darüber hinaus wurden mehrere Patienten mit X-chromosomalem Hörverlust aufgrund von Defekten im POU3F4-Gen (DFNX2) und Deletionen im SMPX-Gen (DFNX4) diagnostiziert. Zusätzlich konnte mit Hilfe einer Exom-basierten Copy Number Variation-Analyse eine Deletion im OTOA-Gen (DFNB22) gefunden werden, welche sich bis in die Tandempseudogenregion erstreckte.
Diese Untersuchung zeigt die enormen Möglichkeiten zur Detektion von Mutationen bei heterogenen Erkrankungen durch Anwendung von Next Generation Sequencing. Weiterhin konnte eine intragenische Deletion im Gen COL9A1 identifiziert werden, die im Zusammenhang mit einer scheinbar isolierten Hörstörung steht und durch den komplexen Umlagerungsmechanismus FoSTeS/MMBIR (Fork Stalling und Template Switching/Microhomology-mediated Break-induced Replication) entstand, der so bei Hörstörungen noch nicht beschrieben wurde. Auf der Suche nach Genen, die bisher noch nicht mit Hörstörungen assoziiert werden konnten, wurden acht Familien in eine Kandidatengenuntersuchung miteinbezogen und eine Exom-weite Analyse durchgeführt. Bei fünf Familien konnte noch keine ursächliche Variante identifiziert werden. Jedoch wurde bei drei Familien mit einer autosomal dominanten Schwerhörigkeit eine genetische Ursache identifiziert und TECTB, ATP11A und THBS2 konnten als Kandidatengene ermittelt werden. Diese Arbeit zeigt, wie wichtig es ist, die kausale Variante bei Hörstörungspatienten zu detektieren. Eine genetische Diagnostik ermöglicht eine endgültige Diagnose eines Syndroms, ist für die Klassifizierung der Hörstörung notwendig und trägt zu einer zukünftigen Therapie der Patienten bei.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Metaphasen von Fibroblastenkulturen (AA, WL, SCH, H-51) von Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Werner Syndrom (WS) mit der Spektralen Karyotypisierung (SKY) analysiert. Die Auswertung bestätigte in allen vier Zelllinien (ZLL) die zuvor mit konventionellen Methoden (z.B. mit G- und R-Bänderung) etablierten zytogenetischen Charakteristika des WS in Form des „Variegated Translocation Mosaicism“ (VTM) und der im zeitlichen Verlauf einer Zellkultur vorherrschenden zytogenetischen, dominanten Klone, deren Eigenschaften mit den drei Schlagwörtern „clonal attenuation“, „clonal succession“ und „clonal expansion“ bereits durch Salk et al. [28] treffend umschrieben wurden. Alle ZLL wurden nach 7 oder 8 Passagen seneszent, einer für WS-Fibroblasten typischen, reduzierten Lebensspanne. In der genaueren Analyse der aberranten Metaphasen war SKY den konventionellen Methoden deutlich überlegen. Während bei Salk et al. in 1005 Metaphasen 271 Brüche entdeckt wurden, wurden mit SKY in 69 Metaphasen 108 Brüche eindeutig klassifiziert, was außerdem eine detailliertere Einteilung der Klone in unterschiedliche, teilweise singuläre Subklone erforderlich machte. Die bisher noch nie in WS-Zellen festgestellten trizyklischen Chromosomenaustausche und dreifach-rekombinanten Chromosomen zeigten die Fähigkeit der SKY-Methode, komplexe genomische Veränderungen genau darzustellen. Zudem wurde erstmals ein pseudotetraploider Subklon T mit 87-90 Chromosomen entdeckt, der aus der Mutterkultur WL stammte und ein ungewöhnliches Wachstumspotential von etwa 45 Populationsverdoppelungen (PD) erreichte und die durchschnittlichen 20 PD von WS-Fibroblasten um mehr als das Doppelte überschritt, aber unter den 54 PD von Kontrollfibroblasten lag. Eine Tetrasomie wurde für alle autosomalen Chromosomen außer den Chromosomen 4 und 6 festgestellt, die jeweils dreimal, die Geschlechtschromosomen X und Y jeweils zweimal vertreten waren. Die Translokationen waren identisch mit denen von Klon a aus WL, allerdings in jeweils zweifacher Ausführung. 77 der 10 Chromosomen beinhalteten in den 69 Metaphasen ≥6 Brüche und waren in jeweils mindestens 3 der 4 ZLL an Chromosomenaberrationen beteiligt. V.a. Chromosom 16 war mit 17 Bruchpunkten bzw. in 23 von 78 aberranten Chromosomen am häufigsten involviert. Zudem war es an zwei der drei dreifach-rekombinierten Chromosomen und bei einem der zwei trizyklischen Chromosomenaustausche beteiligt. Dies weist auf eine möglicherweise große Bedeutung von Chromosom 16 in Rekombinationsprozessen hin. Auffällig war eine nicht-zufällige Bruchpunktverteilung. Die Bruchpunkte 3q11→q12, 9q13, 15q15, 16q12→q13 und 16q22 waren mögliche hot spots für Bruchereignisse und trugen Rechnung für ≈21% der Bruchereignisse. V.a. 16q22 brach am häufigsten (11mal), war als einziger Bruchpunkt in allen 4 Zelllinien vorhanden und maßgeblich für die hohe Beteiligung des Chromosoms 16 an strukturellen Aberrationen verantwortlich. 16q22 wurde in vorherigen Untersuchungen bisher noch nicht als einer der bevorzugten Bruchpunkte in WS festgestellt. Einige der bei Salk et al. genannten hot spots wurden in dieser Arbeit bestätigt, jedoch mit unterschiedlichem Verteilungsmuster. Dies hängt möglicherweise mit der höheren Sensitivität von SKY, aber auch mit der in dieser Arbeit relativ niedrigen Anzahl an Metaphasen zusammen. Für SKY bestehen weitere mannigfaltige Anwendungsmöglichkeiten , die in der zytogenetischen Forschung nicht nur auf dem Gebiet des WS Fortschritte erzielen können. SKY ist zudem eine sichere Methode, erfordert jedoch einen hohen zeitlichen und materiellen Aufwand, die die Anwendungsmöglichkeiten wiederum limitieren. Als diagnostisches Instrument erscheint SKY daher nur in Fällen sinnvoll, in denen nach der Anwendung konventioneller Methoden weiterhin Unsicherheiten bezüglich der Diagnose bestehen. Mit der Eigenschaft komplexe Rearrangements mit hoher Sensitivität zweifelsfrei nachzuweisen, kann es jedoch als der Gold-Standard bei unklaren Fällen gelten.
Immuntherapien auf der Basis gut charakterisierter, tumorspezifischer Antigene stellen ein vielversprechendes Konzept der Tumortherapie dar. Ein potentielles Antigen für immuntherapeutische Strategien sollte möglichst tumorspezifisch exprimiert sein und es sollte einen Hinweis auf bereits erfolgte Immunantworten im Patienten geben, wie z.B. die Existenz spezifischer Antikörper oder zytotoxischer T-Zellen (CTL). Eine membranständige Lokalisation ist für die Verwendung von Tumorantigenen in Antikörpertherapien notwendig. Während für viele Neoplasien Tumorantigene bekannt sind, wurden für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bislang nur sehr wenige tumorassoziierte Antigene identifiziert. Die Antigene se57-1, se70-2, cTAGE-1 und GBP-5ta wurden durch serologisches Durchsuchen einer Phagenbank aus Testis- bzw. Tumorgewebe (SEREX-Methode) identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität dieser vier Tumorantigene in einem neu entwickelten ELISA mit CTCL-, Parapsoriasis-, Melanom- und Kontrollseren untersucht. se70-2 und cTAGE-1 Protein erkannten nur wenige Patientenseren. Für GBP-5ta konnte dagegen eine signifikant höhere Reaktivität der CTCL-Seren im Vergleich zu den Kontrollseren ermittelt werden. Bei se57-1 waren die CTCL- und die Parapsoriasisseren hoch signifikant verschieden zu den Kontrollseren. Dieses putativ virusinduzierte Antigen sollte in zukünftigen Arbeiten auf seine mögliche Funktion als Entzündungsmarker weiter untersucht werden. Für das CTCL sollten weitere Kombinationen von Tumorantigenen auf ihren diagnostischen Wert in der Serologie getestet werden. Des Weiteren konnten in dieser Arbeit die CTCL assoziierten Antigene se2-2 und die GBP-5 Familie genauer charakterisiert werden: Die Expressionsanalyse von se2-2 Protein und mRNA in verschiedenen Normalgeweben zeigte ein differentielles Expressionsmuster. Im SEREX wurde se2-2 serologisch spezifisch nur von CTCL-Seren erkannt. Möglicherweise wäre se2-2 eine geeignete Zielstruktur für die serologische Diagnostik des CTCL. Aufgrund seiner fehlenden Tumorspezifität ist se2-2 für die Immuntherapie jedoch wenig geeignet. Die neu identifizierte GBP-5 Familie besteht aus mindestens drei Spleißvarianten (GBP-5ta, GBP-5a und GBP-5b), die zwei Proteine, GBP-5ta und GBP-5a/b, kodieren. GBP-5ta ist gegenüber GBP-5a/b C-terminal um 97 AS verkürzt. GBP-5ta mRNA wird differentiell exprimiert, während GBP-5ta Protein PBMC-spezifisch exprimiert wird. In CTCL-Tumorgewebe konnte GBP-5ta nachgewiesen werden, wogegen in Melanomzelllinien fast ausschließlich GBP-5a/b vorliegt. Gegen GBP-5ta konnte eine humorale Immunantwort bei CTCL-Patienten nachgewiesen werden: Im SEREX wurde GBP-5ta nur von CTCL-Patientenseren erkannt. Auch in der ELISA-Methode reagierten signifikant mehr Patientenseren als Kontrollseren mit GBP-5ta. Die höhere Immunogenität von GBP-5ta gegenüber GBP-5a/b im SEREX unterstreicht die Bedeutung der verkürzten Variante. Ob CTL gegen GBP-5ta präsentierende Zellen existieren, wird momentan untersucht. Die GBP-5 Spleißvarianten sind hoch homolog zur Familie der GTPasen, zu denen auch das Onkogen Ras gehört. Das verkürzte Protein von GBP-5ta könnte durch den Verlust der C-terminalen Domäne seine eventuelle anti-proliferierende Funktion verlieren. Ein Knock-out Versuch von GBP-5 könnte die Bedeutung von GBP-5 in der Tumorzelle untersuchen. Darüber hinaus wäre es vielversprechend, die GTPase Aktivität der GBP-5 Varianten in einem GTP-Bindungs-Assay zu überprüfen. GBP-5ta könnte eine mögliche Ursache des unkontrollierten Wachstums der Tumorzelle und somit eine vielversprechende potentielle Zielstruktur für therapeutische Ansätze für das CTCL sein.
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Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf.
Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen.
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren.
In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind.
Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt.
In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann.
SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.
Das Zielartenkonzept
(1992)
No abstract available
Der Einfluss des PI3-Kinase Signalwegs auf die Regulation des alternativen HIV-1 prä-mRNA Spleißens
(2013)
In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie.
In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.
Die komplexen Aktivitätsmuster während der Futtersuche bei Ameisen sind kein Resultat einer einfachen Selbstorganisation mit starren Regeln sind, sondern diese Regeln werden vielmehr permanent durch den Informationsaustausch zwischen den Arbeiterinnen modifiziert. Die Furagierökologie hat vor allem einen Einfluss auf die Rekrutierungsstrategie der Tiere. Blattschneiderameisen furagieren an großen und stabilen Nahrungsressourcen auf diese sie nach dem Auffinden sofort stark rekrutieren. Camponotus rufipes besucht hingegen Futterquellen, die in ihrer Ergiebigkeit schlecht vorhersagbar sind. Daher steigern die Tiere ihre Rekrutierungsintensität erst nachdem sie sich durch mehrmaliges Aufsuchen der Futterquelle von deren Beständigkeit überzeugt haben.
Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren.
Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes
(2010)
Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellulären Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum für die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktionsäquivalente für die Produktion von Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen verändert werden. In vielen Fällen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbrücken führt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgeführt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am stärksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 –fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante höher als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auffällig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH verändert war. Zu den am stärksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen zählen lmo0135-7, sie codieren für einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren könnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zusätzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auffälligen Phänotyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Veränderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zelluläre Homöostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollständig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine nähere in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verstärkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das ursprünglich 253 Aminosäuren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verkürzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu verändern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuführen. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgeführt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 näher aufzuklären. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgewählt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das für die allgemeine Stressantwort in Listerien zuständig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms“ von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erhöht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, während die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilität und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgeklärt werden.
Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen.
In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut.
In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet.
In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung.
Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte.
Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert.
Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen.
In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider.
Zurzeit sterben jährlich ca. 11.000 Männer in Deutschland am Prostatakarzinom. Damit stellt dies die zweithäufigste Krebstodesursache von Männern dar. Da das Prostatakarzinom häufig asymptomatisch verläuft, wird die Erkrankung oftmals erst so spät erkannt, dass zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Metastasierung stattgefunden hat. Durch metastasierende Prostatakarzinomzellen werden Lymphknoten, Knochen und Lungen befallen. Es sind zwei unterschiedliche Verbreitungsarten von metastasierenden Tumorzellen beschrieben. Zum einen kann eine Migration über Lymphgefäße erfolgen, ein Prozess der als lymphatische Metastasierung bezeichnet wird. Zum anderen können Tumorzellen über das Blutsystem im Körper zirkulieren: die hämatogene Metastasierung. In dieser Arbeit wurde die lymphatische Metastasierung der humanen Prostatakarzinomzellline PC-3 im Detail analysiert und Teilaspekte der hämatogenen Verteilung untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen bildete die Vergrößerung lumbaler und renaler Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden Mäusen 60 Tage nach der Implantation von PC-3-Zellen. Es wurde daraufhin der zeitliche Verlauf der Vergrößerung untersucht und festgestellt, dass sowohl das Volumen als auch die Anzahl vergrößerter Lymphknoten von Woche zu Woche nach Implantation der PC-3-Tumore zunehmen. Anschließend wurden alle vergrößerten Lymphknoten bezüglich des Vorhandenseins von metastasierenden humanen PC-3-Zellen in den Mäusen untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung von Primern für humanes β-Aktin. Sechs Wochen nach Implantation konnten in 90 % der vergrößerten Lymphknoten PC-3-Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch lentivirale Transduktion das Gen für das rot fluoreszierende Protein (RFP) in die PC-3-Zellen inseriert, wodurch eine Visualisierung dieser Zellen in der Maus ermöglicht wurde. Es konnten metastasierende PC-3-RFP-Zellen in lumbalen und renalen Lymphknoten PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse nachgewiesen werden. Ebenso konnte mittels RFP gezeigt werden, dass die Lymphknotenmetastasierung in Abhängigkeit von der Lokalisation des PC-3-RFP-Tumors erfolgt. Es kam zur Metastasierung jener Lymphknoten, in deren Einzugsgebiet sich der PC-3-Tumor befand. Es wurde eine PC-3-RFP-Zellmigration zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen nachgewiesen und bei immunhistologischen Untersuchungen stellte sich heraus, dass PC-3-RFP-Zellen tatsächlich in lymphatischen Bahnen zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen migrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass es von Woche zu Woche nach Implantation von PC-3-Zellen zu einer Zunahme der Anzahl von Lymphgefäßen in PC-3-Tumoren kommt. Die Zunahme der Lymphgefäßdichte korrelierte hierbei positiv mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen. Es konnten weiterhin neben Lymphknotenmetastasen hämatogene Mikrometastasen in den Lungen PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse beobachtet werden. Da die Haupttodesursache von Prostatakarzinompatienten in der Bildung von Metastasen liegt, ist es von herausragender Bedeutung eine effektive Therapie gegen lymphatische und hämatogene Metastasen zu entwickeln. Aus diesem Grund erlangt die onkolytische Virustherapie große Bedeutung. Deshalb wurde als zweiter Aspekt in dieser Arbeit der Einfluss des onkolytischen Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf den Prozess der PC-3-Zellmetastasierung untersucht. Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass GLV-1h68 in der Lage ist, erfolgreich sowohl migrierende PC-3-Zellen als auch metastasierende PC-3-Zellen in Lymphknoten zu kolonisieren. In der Folge wurde deshalb ein möglicher Metastasen-inhibierender Effekt von GLV-1h68 untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass GLV-1h68 drei Wochen nach intravenöser Injektion eine signifikante Reduktion der Anzahl der für PC-3-Zellen positiven Lymphknoten bewirkt. Des Weiteren konnte ein inhibierender Effekt von GLV-1h68 auf die im Blut zirkulierenden PC-3-Zellen und auf hämatogene Metastasen in den Lungen beobachtet werden. Durch intravenöse Injektion von GLV-1h68 in PC-3-RFP-Tumor-tragenden Mäusen konnte gezeigt werden, dass es zu einer präferentiellen Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den Tumoren kommt. Auch nach intraperitonealer und intratumoraler Injektion von GLV-1h68 konnte eine präferentielle Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Lymph- und Blutgefäße von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass es sieben Tage nach intravenöser Injektion von GLV-1h68 zu einer signifikanten Abnahme von beiden Gefäßarten kam. Es wurde in dieser Arbeit somit gezeigt, dass GLV-1h68 in der Lage ist, sowohl lymphatische als auch hämatogene Metastasen der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 erfolgreich zu eliminieren. Folglich dürften onkolytische Vaccinia-Viren ein vielversprechendes Therapeutikum für die Behandlung des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms darstellen.
Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden.
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Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher größten überzähligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies ermöglichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergewöhnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen über die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie könnte zukünftig auch auf andere Länder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzbänderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergewöhnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und spät replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten hauptsächlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv über die beiden Arme der überzähligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven überzähligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information über B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie für die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution überzähliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des größten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten überzähligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms, allerdings unter Tötung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation über das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest“) vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, können so schnell und zuverlässig auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch künftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der überzähligen Chromosomen auf die nächste Generation zu studieren.
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Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden.
Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert.
Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation.
Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt.
Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt.
Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist.
Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert.
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Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
Die Bcl-2-Familienmitglieder A1 und sein humanes Homolog Bfl-1 gewährleisten das Überleben der Zelle. Gleichzeitig trägt eine Dysregulation der Expression von A1/ Bfl-1 zur Krebsentstehung bei. Die Stabilität von A1/ Bfl-1 wird durch deren Ubiquitinylierung sowie die anschließende proteosomale Degradation gesteuert. Mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens wurde die E3-Ubiquitinligase HectD1 als potentieller Interaktionspartner von A1/ Bfl-1 identifiziert. Die Interaktion von A1 und HectD1 des Yeast-Two-Hybrid-Screens konnte in Säugerzellen bestätigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass lediglich 87 Aminosäuren für eine Interaktion von HectD1 und A1 nötig sind. Da membrangebundenes HectD1 zu einer Translokation von zytosolischem A1 an die Zellmembran führt, kann man davon ausgehen, dass beide Proteine auch in vivo miteinander interagieren. Eine dominant negative HectD1-Mutante schließlich beeinflusst die Ubiqutinylierung von A1 und führt somit zu dessen Stabilisierung. Diese Daten legen nahe, dass HectD1 ein wichtiger negativer Regulator von A1/ Bfl-1 ist und dass HectD1 für die Regulierung der A1/ Bfl-1-Proteinmenge in (Krebs)zellen sehr wichtig ist.
Degenerative Bandscheibenerkrankungen wie Protrusionen oder vorgefallenes Nukle-usgewebe führen häufig zu chronischen Schmerzen und schränken die Bewegungsmo-bilität sehr ein. Operative Behandlungsmöglichkeiten wie die Nukleotomie oder die Fusion von Wirbelkörpern stellen traumatische Eingriffe in das komplexe System der Wirbelsäule dar. Biologische Verfahren, durch die eine Regeneration des geschädigten Gewebes erzielt werden kann, sind klinisch bisher nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung, Herstellung und Testung regenerativer azellulä-rer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I, die den degenerierten Nukleus pulposus ersetzen sollen. Insbesondere eine Höhenminderung der Bandscheibe kann zu Anschlussdegenerationen benachbarter Segmente führen. Dies soll durch die Implan-tatmatrix ausgeglichen werden. Nach der Konstruktion und dem Bau eines Reaktors aus dem Hochleistungskunststoff Polytetrafluorethylen (PTFE), der allen Anforderungen eines CE-Konformitätsbewertungsverfahrens entspricht, wird eine hoch verdichtete Kollagen Typ I Matrix mit einer Stärke von 1 mm hergestellt. Diese kann über den Pro-zess der Lyophilisation auf 0,6 mm weiter reduziert werden. Es gelingt, die Matrix in einer Edelstahlhülse zu platzieren, über die mit Hilfe eines passgenauen Führungssta-bes die endoskopische Implantation in die Nukleuskavität erfolgen soll. Im Rahmen der Interkorporellen Fusionstage des Diakonie Klinikums Stuttgart wird das operative Handling an einem humanem Präparat simuliert. Die Implantation erfolgt offen über einen transforaminalen Zugang in zwei nukleotomierte Segmente der lumbalen Wir-belsäule. Die anwesenden Wirbelsäulenchirurgen beurteilen die Möglichkeit der endo-skopischen Applikation als positiv und machbar.
Durch den Zusatz des Polysaccharids Hyaluronsäure gelingt es, die Quelleigenschaften der hoch verdichteten Matrix zu steigern, so dass diese wie natives Nukleusgewebe in der Lage ist, Flüssigkeit in Ruhe wieder aufzunehmen. Das Quellpotential und die da-mit einhergehende Volumenzunahme nach Kompression sind für ein Nukleusersatzma-terial essentiell. Die hier verwendete Hyaluronsäure geht jedoch im offenen System der in vitro Inkubation innerhalb von 11 Tagen verloren. Dennoch zeigen sich weitere Vorteile gegenüber der Matrix ohne Hyaluronsäure-Zusatz innerhalb der Testungen heraus. Diese sind neben dem erhöhten Quellpotential z. B. eine gesteigerte Rate der Zellproliferation der verwendeten bovinen und humanen Bandscheibenzellen (bBSZ und hBSZ) sowie humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die über die Be-stimmung der Zellzahl und Viabilität ermittelt wird. Zudem zeigt sich eine gesteigerte mechanische Stabilität, die über die Spannungs-Kompressions-Messungen evaluiert wird. Über Lebend-/ Totfärbungen und Zytotoxizitätstests an Monolayerkulturen kann zudem nachgewiesen werden, dass die notwendige Endsterilisation durch γ-Bestrahlung zu keinen zytotoxischen Veränderungen der Matrix führt. Da die verdich-tete Implantatmatrix azellulär als Medizinprodukt der Klasse III eingesetzt werden soll, wird als ergänzende Matrix zur Füllung kleinster Hohlräume die zunächst flüssige ChondroFillerliquid Matrix (ein Knorpelersatzmaterial der Firma Amedrix GmbH, Esslin-gen) durch den Zusatz von Hyaluronsäure modifiziert und in der Zellkultur getestet. Da es sich hierbei um ein Zweikammerspritzensystem handelt, ist die Verwendung von Additiva wie z. B. Stammzellen technisch möglich. Die Ermittlung der maximalen Inku-bationszeit von Zellen in verschieden konzentrierten hyperosmotischen Neutralisations-lösungen ergibt eine Dauer von 5 min, bis irreversible Zellschäden auftreten. In Migra-tionsversuchen kann gezeigt werden, dass die ChondroFillerliquid Matrix als Konektiv zwischen nativem Nukleusgewebe und verdichteter Implantatmatrix fungiert. Des Wei-teren synthetisieren bBSZ, hBSZ und hMSC sulfatierte Glykosaminoglykane und behal-ten dabei ihr charakteristisches Genexpressionsprofil. Die chondrogene Differenzie-rung durch die Verwendung eines chondrogenen Differenzierungsmediums gelingt bei den hMSC bereits nach einer Kultivierungsdauer von 14 d. Die Zellverteilung in den Implantatmatrices und deren Morphologie entspricht dem nativen Nukleusgewebe. Die biomechanische Testung an einem international anerkannten Modellsystem für humane Wirbelsäulen – der Kalbswirbelsäule – ergibt, dass die Nukleotomie zu einer Erhöhung des Range of Motion (RoM) in alle Richtungen nach Flexion/Extension, Seit-neigung rechts/links und axiale Rotation rechts/links sowie zu einer Höhenreduktion des Segments im Vergleich zum Intaktzustand führt. Nach der Implantation der ver-dichteten Implantatmatrix wird der RoM deutlich reduziert. Das Segment weist dadurch eine hohe Steifigkeit ähnlich dem Intaktzustand auf. Die Höhenreduktion kann durch die Implantation beinahe vollständig wieder ausgeglichen werden. Im Rahmen der zyklischen Dauerbelastungen treten jedoch Implantatextrusionen auf. Zudem nimmt die Steifigkeit deutlich ab, der RoM hingegen wieder zu. Da das bovine Modell jedoch nicht der in vivo Situation entspricht und beispielsweise eine zunehmende In-tegration des Implantats durch Einwachsen nicht ermöglicht, ist die hohe Extrusionsra-te als nicht realistisch zu werten. Klinische Studien am Tier und Mensch müssen zeigen, inwieweit derartige Extrusionen ohne die Verwendung eines Anulusverschlußsystems auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen geeigneten Reaktor zu ent-wickeln und mit diesem eine biokompatible, stabile und quellfähige Matrix herzustel-len, die den Höhenverlust nach einer Nukleotomie auszugleichen vermag. Die modifi-zierte ChondroFillerliquid Matrix stellt eine ideale Ergänzung dar, da über diese Zellen oder andere Additiva verabreicht werden können und deren konektive Wirkung die Zellbesiedlung der azellulären Matrix begünstigt.
Soziale Insekten wie die Honigbiene (Apis mellifera) besitzen ein breites Spektrum an Abwehrmechanismen gegen Pathogenbefall, sowohl auf der Ebene der Kolonie (soziale Immunität) als auch auf der Stufe des Individuums (angeborenes Immunsystem). Die Hauptaufgabe der relativ kurzlebigen Drohnen besteht in der Begattung von Jungköniginnen. Daher stellte sich die Frage, ob auch die Drohnen ähnlich den Arbeiterinnen mit energieaufwendigen Immunreaktionen auf Infektionen reagieren. Wie im Folgenden beschrieben, konnte ich nachweisen, dass Drohnen eine ausgeprägte Immunkompetenz besitzen. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus humoralen und zellulären Abwehrreaktionen zusammen. Bei der humoralen Immunantwort werden bestimmte evolutionär konservierte Signalkaskaden aktiviert, an deren Ende die Expression einer Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und immunspezifischen Proteinen (IRPs) steht. Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurden von mir zum einen Hemmhoftests durchgeführt, um die gesamte antimikrobielle Aktivität der Haemolymphe nach artifizieller Infektion zu ermitteln und zum anderen spezifische AMPs bzw. IRPs identifiziert. Hierzu wurden die Haemolymphproteine in ein- oder zwei-dimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und ausgewählte Proteinbanden bzw. -spots mittels nano HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponenten des zellulären Immunsystems sind Wundheilung, Phagozytose, Einkapselung und Nodulation. In meiner Arbeit habe ich zum ersten Mal Noduli bei infizierten Drohnen nachweisen können. Frisch geschlüpfte adulte Drohnen (1d) weisen ein breites Spektrum an Immunreaktionen auf, das sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten umfasst. Nach Infektion mit dem Gram-negativen Bakterium E.coli und verschiedenen bakteriellen Zellwandbestandteilen wie Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglycan (PGN) und 1,3ß-Glucan (Bestandteil von Pilzzellwänden), werden die AMPs Hymenoptaecin, Defensin 1 und Abaecin induziert. Desweiteren exprimieren junge adulte Drohnen eine Reihe hochmolekularer immunspezifischer Proteine (IRPs) wie z.B. Carboxylesterase (CE 1), eine Serinprotease, die möglicherweise an der Prozessierung der Prophenoloxidase beteiligt ist, ein Peptidoglycan-interagierendes Protein (PGRP-S2) und zwei Proteine unbekannter Funktion, IRp42 und IRp30. Parallel zu bekannten bienenspezifischen AMPs wurde ein animales Peptidtoxin (APT) in Drohnenlarven, adulten Drohnen und adulten Hummeln nach E.coli Infektion in der Haemolymphe nachgewiesen. Von dem als OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1) benannten Peptid war bereits bekannt, dass es in Fischen paralytische und damit toxische Effekte auslöst. Meine Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei OCLP 1 um ein Peptidtoxin mit antimikrobiellen Eigenschaften und damit um eine neue Klasse von AMPs handelt. Die allgemeine humorale Immunkompetenz scheint während der gesamten Lebensspanne adulter Drohnen (~ 7 Wochen) konstant zu bleiben, wie durch die gleichbleibende antimikrobielle Aktivität im Hemmhoftest gezeigt wurde. Junge Drohnen reagieren auf eine E.coli Infektion mit der Bildung zahlreicher Noduli (~1000 Noduli/Drohn), die vor allem entlang des Herzschlauches zu finden sind. Diese zelluläre Immunantwort nimmt mit dem Alter der Drohnen ab, so dass bei 18 d alten Drohnen nur noch rund 10 Noduli/Drohn gefunden werden. Auf der anderen Seite nimmt die phagozytotische Aktivität bei älteren Drohnen scheinbar zu. In einer Reihe von parallel laufenden Versuchsreihen konnte ich eindrucksvoll zeigen, dass zelluläre Immunreaktionen wie Phagozytose und Nodulation unmittelbar nach bakterieller Infektion einsetzen. Hierbei erreicht die Nodulibildung 8-10 h p.i. eine Plateauphase, wohingegen die humorale Immunantwort erst 6 h p.i. schwach einsetzt, danach stetig zunimmt und noch 72 h p.i. nachweisbar ist. Es ist mir gelungen, eine Methode zur künstlichen Aufzucht von Drohnenlarven zu etablieren. Diese ermöglichte konstante und sterile Versuchsbedingungen zur Untersuchung der Immunreaktionen von Larven. Nach Infektion mit E.coli reagieren Drohnenlarven mit einer starken Aktivierung ihrer humoralen Immunantwort durch die Expression von AMPs, jedoch werden keine hochmolekularen IRPs wie in adulten Drohnen hochreguliert. Zudem ist die Nodulibildung in Larven nur schwach ausgeprägt. Völlig unerwartete Beobachtungen wurden beim Studium der Immunkompetenz von Drohnenpuppen gemacht. Nach Injektion lebender E.coli Zellen in Drohnenpuppen stellte ich eine dramatische Veränderung im Aussehen der Puppen fest. Die Puppen verfärbten sich gräulich schwarz. Genauere Untersuchungen haben dann gezeigt, dass die Drohnenpuppen, wie auch die der Arbeiterinnen, offensichtlich keine zelluläre Abwehrreaktion aktivieren können und die humorale Immunantwort nur sehr schwach ausfällt und viel zu spät einsetzt.
p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben
Pflanzen sind verschiedenen Umweltbedingungen ausgesetzt, die zu suboptimalen Wachstumsbedingungen führen können. Dies gilt für eine Vielzahl von biotischen und abiotischen Faktoren. In der hier vorgelegten Arbeit wird der Effekt von erhöhten Temperaturen und Hitze genauer analysiert. Hitze ist einer der wichtigsten abiotischen Stressfaktoren, der das Pflanzenwachstum und die Reproduktion beeinflusst. Viele wichtige Kulturpflanzen zeigen immense Ertragseinbußen, die durch Hitze hervorgerufen werden. Durch den fortschreitenden Klimawandel werden jedoch Hitzeperioden immer häufiger und somit die Folgen für die Nahrungsproduktion immer gravierender. Zur Züchtung von Pflanzen die hitzetolerant sind und weniger hohe Ertragseinbußen unter diesem Stress aufweisen, ist es essenziell die grundlegenden molekularen Mechanismen der Hitzetoleranz zu verstehen. Es müssen die verschiedenen physiologischen und biochemischen Prozesse identifiziert werden, die es Pflanzen ermöglichen, sich anzupassen. Es ist bekannt, dass die Anpassungsmechanismen von Pflanzen komplex sind und sowohl Veränderungen auf zellulärer wie auch auf organismischer Ebene beinhalten. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Erkenntnisse zu gewinnen, wie diese Anpassung vonstattengeht und welche molekularen Prozesse an ihr beteiligt sind. Ein Hauptaugenmerk lag dabei auf dem Einfluss des Lipidmetabolismus und den daran beteiligten Enzymen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Akkumulation von Triacylglycerolen bei hohen Temperaturen die basale Thermotoleranz bei Arabidopsis thaliana erhöht. Wie jedoch der genaue Mechanismus dieser durch Triacylglycerole vermittelten Thermotoleranz funktioniert, war bis dato nicht bekannt. Ich konnte zeigen, dass die angesammelten Triacylglycerole genutzt werden können, um die Stomata während des Hitzestress zu öffnen. Dies führt zu einer erhöhten Transpiration und somit einer Kühlung der Blätter. Der Abbau von Triacylglycerolen und Stärke am Morgen ist notwendig, um die Stomata zu öffnen. Zusätzlich dient der Abbau der Aufrechterhaltung des Citratzyklus und somit der Energieversorgung. In weiteren Experimenten konnte ich durch Fütterung mit stabil markierter Laurinsäure zeigen, dass die Triacylglycerole auch dem Aufbau neuer Aminosäuren unter Stressbedingungen dienen. Die hier vorgestellten Arbeiten bieten die Grundlage, um den Mechanismus der Thermotoleranz besser zu verstehen. Das Verständnis der in dieser Arbeit beschriebenen molekularen Signalwege und Enzyme kann langfristig dazu beitragen hitzeresistentere Nutzpflanzen zu züchten.
Mit über 24.000 Arten sind etwa die Hälfte aller heute lebenden Wirbeltiere Fische. Im Gegensatz zu Vögeln oder Säugetieren weisen Fische eine erstaunliche Vielfalt und Variabilität der Geschlechtsbestimmungsmechanismen auf. Sämtliche Formen von Zwittrigkeit sowie umweltbedingte und genetische Geschlechtsbestimmung sind beschrieben worden. Die molekularen Grundlagen der genetischen Geschlechtsbestimmung bei Fischen sind jedoch weitgehend unbekannt. Für einige Fischarten, wie etwa der Zebrafisch, die beliebte Modellorganismen zur Untersuchung z.B. von Krankheiten sind, liegen bereits sequenzierte Genome vor. Dennoch sind diese Modellorganismen aufgrund bisher nicht identifizierbarer Geschlechtschromosomen oder fehlender geschlechtsgebundener molekularer Marker als Modellorganismen zur Untersuchung der genetischen Geschlechtsbestimmung und der Evolution der Geschlechtschromosomen ungeeignet. Bei Stichling und Medaka, ebenfalls Fische mit vollständig sequenzierten Genomen, konnte hingegen die geschlechtsbestimmende Region identifiziert werden. Im Medaka ist bereits das geschlechtsbestimmende Gen identifiziert worden, eine Y-spezifische Kopie des Gens dmrt1. Dmrt1bY konnte aber lediglich in einigen Medaka Arten nachgewiesen werden und stellt somit keinesfalls das universelle geschlechtsbestimmende Gen der Fische dar. Da die geschlechtsbestimmenden Regionen von Medaka und Stichling evolutionär gesehen relativ jung und linienspezifisch sind, spiegeln sie nur begrenzt den evolutionären Verlauf der Entstehung von Geschlechtschromosomen und Geschlechtsbestimmungsmechanismen wider. Der Platyfisch Xiphophorus maculatus ist ein hervorragender Modellorganismus zur Untersuchung der Geschlechtsbestimmung und Evolution von Geschlechtschromosomen. Er wird seit Ende 1920 zur Untersuchung von malignen Melanomen verwendet. Interspezifische Hybride bilden durch die kreuzungsbedingte Aktivierung eines Tumorlocus erbliche Melanome aus. Der Tumorlocus konnte bereits molekular identifiziert werden. Er entspricht dem Onkogen Xmrk, das durch eine Xiphophorus-spezifische Duplikation des Protoonkogens egfrb gebildet worden ist. Onkogen und Protoonkogen, die beide für epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren codieren, befinden sich in der Subtelomerregion auf den Geschlechtschromosomen des Platyfisches. Sie flankieren die etwa 1 Mb große geschlechtsbestimmende Region. Neben dem geschlechtsbestimmenden Locus sind verschiedene pigmentzelldefinierende Loci in dieser Region vorzufinden. Die Geschlechtschromosomen X und Y des Platyfisches sind sehr homolog, lassen sich aber sowohl cytogenetisch als auch genetisch gut voneinander unterscheiden. Zur Untersuchung der genetischen Struktur der geschlechtsbestimmenden Region und zur Identifizierung des geschlechtsbestimmenden Gens mittels positioneller Klonierung, wurde eine artifizielle Bakterienchromosom-(BAC) Bibliothek aus männlichen Platyfischen (Genotyp XY) angelegt. Onkogen und Protoonkogen sowie verschiedene andere X- und Y-chromosomale molekulare Marker wurden als Startpunkte für „Chromosomen-Walking“ und den Aufbau von X- und Y-chromosomalen artifizielle Bakterienchromosom (BAC)-Contigs verwendet. Hauptaufgabe meiner Doktorarbeit war die Erweiterung und physikalische Verknüpfung verschiedener X- und Y-chromosomaler Contigs mittels molekularbiologischer und cytogenetischer Methoden sowie die Identifizierung von Genen mittels Bioinformatik und funktioneller Analyse. Bis zum jetzigen Zeitpunkt decken die BAC-Contigs 3,1 Mb auf dem Y-Chromosom und 3,8 Mb auf dem X-Chromosom in der geschlechtsbestimmenden Region ab. Sie stellen mitunter die größten geschlechtschromosomalen Contigs bei Fischen dar. Die X- und Y-chromosomalen Contigs werden derzeit in Kollaboration mit dem Sequenzierungszentrum Genoscope in Frankreich komplett durchsequenziert. Erste Sequenzanalysen weisen auf eine molekulare Differenzierung zwischen den X- und Y-Geschlechtschromosomen in der geschlechtsbestimmenden Region hin. Es konnten ein duplizierter Bereich auf dem Y Chromosom sowie eine Inversion in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert werden. Nichthomologe Rekombinationsereignisse zwischen transponierbaren Elementen und wiederholende Sequenzen sind mutmaßlich an dieser molekularen Umordnung beteiligt. Solche transponierbaren und sich wiederholenden Elemente akkumulieren in der geschlechtsbestimmenden Region und erschwerten auch maßgeblich Aufbau und Ausweitung der geschlechtschromosomalen Contigs. Während die meisten Elemente auf beiden Geschlechtschromosomen zu finden sind, konnten auch Y-spezifische Kopien nachgewiesen werden, wie beispielsweise der endogene Retrovirus foamy. Eine Reihe von Genkandidaten wurden in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert. Einige stellen aussichtsreiche Kandidaten für den geschlechtsbestimmenden Locus dar. So ist das Gen fredi, das für einen putativen Transkriptionsfaktor mit Helix-Turn-Helix Motiv codiert, im Hoden stark exprimiert. Verschiedene fredi Kopien sind auf dem X und Y Chromosom in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert worden. Interessanterweise ist die codierende Sequenz der X-chromosomalen fredi Kopien durch ein transponierbares Element zerstört. Die Y-chromosomalen Kopien sind hingegen scheinbar nicht beeinträchtigt. Zwei weitere miteinander verwandter Genkandidaten namens fah und tan, die bislang für Genprodukte mit unbekannten Eigenschaften codieren, liegen nebeneinander in der geschlechtsbestimmenden Region vor. Expressionsanalysen beider Gene weisen eine spezifische Expression im Ovar und zwar in der vegetativen Hemisphäre der Oocyten auf. Orthologe Gene wurden in Medaka und Zebrafisch identifiziert und kloniert. Expressionsanalysen in Medaka zeigten eine Ovar-spezifische Transkription wie in Xiphophorus, während im Zebrafisch fah und tan ubiquitär exprimiert sind. Interessanterweise konnte im Platyfisch eine Spleißvariante von fah identifiziert werden, die auch im Hoden exprimiert ist. Dies macht fah zu einem vielversprechenden Kandidaten für den geschlechtsbestimmenden Locus. Die genomischen Regionen, in der fah und tan bei anderen Fischarten wie Medaka, Zebrafisch und Kugelfisch identifiziert wurden, zeigen hohe Syntenie zur geschlechtsbestimmenden Region des Platyfisches und könnten auch bei diesen Fischarten eine Rolle in der Geschlechtsbestimmung spielen. Ein einziges Gen, das mit fah und tan verwandt ist, konnte auch in Maus, Huhn und Frosch nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte auf dem menschlichen X-Chromosom eine mit Stoppcodons durchzogene, zu fah/tan homologe Pseudogene Sequenz identifiziert werden. Diese Syntenie zwischen Geschlechtschromosomen von Fischen und Säugern könnte auf eine evolutionär sehr alte geschlechtsbestimmende Region der Wirbeltiere hindeuten. Zusammenfassend hat diese Arbeit neben neuen Erkenntnissen über die Evolution der Geschlechtschromosomen bei Fischen verschiedene Genkandidaten für den geschlechtsbestimmenden Locus geliefert, die nun auch funktionell analysiert werden müssen.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.
1. Bei der Anemomenotaxis arbeiten die Windrichtungen perzipierenden, paarigen Sinnesorgane der Antennen - vermutlich die Johnstonschen Organe - als Synergisten zusammen. Der Ausfall der für die Windrichtung spezifischen afferenten Meldungen eines Fühlers führt zu einer Halbierung der Drehtendenzstärke (Abb.I-ll). Es konnten keine Anhaltspunkte gefunden werden, die auf eine direkte zentrale Kompensation dieses Effektes hinweisen. Verschiedene Arten der Ausschaltung, totalc (Abb.2) oder teilweise (Abb. 4) Amputation (bei der der Pedicellus unverletzt bleibt) oder Blockierung des Pedicellus-Flagellumgelenks durch Lackierung (Abb.3), bewirken dieselben Änderungen im Orientierungsverhalten. 2. Der einzelne Fühler fungiert bei der Anemomenotaxis als "zweisinniger Lenker". Ein Käfer mit nur einem Fühler ist - nach einer genügend langen Erholungszeit - noch fähig, die Windrichtung festzustellen und zu ihr eindeutige menotaktische Kurse zu steuern (vgl. z. B. Abb. 1, 9). Außerdem kann er sich wie ein intakter Käfer (Abb. 14) bei plötzlicher Anderung der Reizrichtung um den kleineren Winkelbetrag zu seiner Sollrichtung zurückdrehen (Abb. 15). 3. Zwischen Drehtendenzstärke und Reizrichtung besteht nach den Ergebnissen der Ausschaltversuche eine Sinusfunktion. Gleichgroße Rechts- oder Linksabweichungen des Käfers von der positiven oder negativen Grundrichtung werden von rechtem und linkem Fühler mit der gleichen Drehtendenzstärke bewertet (Abb. 13). Es ist deshalb naheliegend, anzunehmen, daß jeder Fühler bei der Reizrichtungsbewertung seinen Abweichungsbetrag von der nächsten der beiden Grundstellungen mißt. In einer Grundstellung befindet sich der Fühler jeweils dann, wenn sich der Käfer genau gegen oder mit dem Wind eingestellt hat. 4. Afferente Drehtendenz und efferentes Drehkommando sind Dreherregungsgrößen, die sich bei Einstellung des Sollwinkels durch ihre antagonistische Wirkung aufheben. Halbierung der Drehtendenzstärke durch Ausschaltung eines Fühlers führt demnach erwartungsgemäß zu einer Verdopplung der Drehkommandowirkung. Daraus und aus der Sinusförmigkeit der Drehtendenzstärkenkurve ergibt sich, daß Drehkommandogrößen, die beim intakten Käfer die Einhaltung von Menotaxiswinkeln von > 30° zur Folge haben, von der halbierten Drehtendenz nicht mehr kompensiert werden können. Die Käfer können dann Dauerrotationen vermeiden, indem sie das Drehkommando soweit abschwächen, daß es von der halbierten Drehtendenz wieder kompensiert wird (Abb. 8). 5. Standardabweichung und mittlere Laufwinkelgröße sind miteinander korreliert. Die Korrelation gilt in gleicher Weise für das intakte und das einseitig antennenamputierte Versuchstier. 6. Nach einer einseitigen Fühlerausschaltung bevorzugen Tenebrio molitor und Scaurus dubius anfänglich Laufrichtungen zur Seite der intakten Antenne hin. Bei allen VT-Arten nimmt die Neigung zum intramodalen Winkeltransponieren nach Fühlerausschaltung sehr stark zu (Abb. 12). 7. Den Grundorientierungen - positive und negative Anemotaxis - liegt, wie auch der Menotaxis, kein tropotaktischer Mechanismus der Fühlerverschaltung zugrunde. Anemotaxis und Anemomenotaxis unterscheiden sich lediglich dadurch, daß bei letzterer ein efferentes Drehkommando die Sollrichtung verstellt. 8. Die experimentellen Befunde werden im Hinblick auf den, der Anemomenotaxis zugrunde liegenden, physiologischen Mechanismus diskutiert: Sie lassen sich alle widerspruchslos mit einem Kompensationsmechanismus vereinen.
In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht.
In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte.
Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie.
Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen.
Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist.
Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten.
Die Diffusion von Membranproteinen spielt bei einer Vielzahl von zellbiologischen Prozessen eine zentrale Rolle. So hat die Beweglichkeit von Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-(GPI-) verankerten Proteinen zum Beispiel eine tragende Funktion bei der Alzheimer Krankheit, der Creutzfeldt-Jacob Krankheit und der Afrikanischen Schlafkrankheit. Der Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei spec., präsentiert auf
seiner Zelloberfläche einen dichten Mantel aus identischen GPI-verankerten Proteinen. Diese sogenannten Variant Surface Glycoproteins (VSGs) stellen den zentralen Pathogenitätsfaktor der Trypanosomen im Blutstrom des Wirtes dar und ermöglichen dem Parasiten die Antigene Variation. Während der Antigenen Variation wird der VSGMantel durch einen immunologisch distinkten Mantel ersetzt. Hierfür ist die Diffusion der VSG essentiell. In der vorliegenden Arbeit wird die Diffusion des VSG in lebenden Trypanosomen und in artifiziellen Membranen systematisch untersucht. Auf diese Weise werden der Einfluss der lateralen Proteindichte, der N-Glykosylierung und der Proteingröße auf die Diffusion der GPI-verankerten Proteine charakterisiert. Die Mobilität des VSG auf lebenden Trypanosomen ist an der Grenze zu einem Diffusionsschwellenwert, dieser wird allerdings nicht überschritten. Die Mobilität des VSG in der Nähe des Diffusionsschwellenwertes wird durch die N-Glykosylierung der VSG ermöglicht. Außerdem kann gezeigt werden, dass die Größe der Proteine einen entscheidenden Einfluss auf den Diffusionskoeffizienten der GPI-verankerten Proteine ausübt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deutlich, dass der VSG-Mantel der Trypanosomen ein, an seine Anforderungen, hoch-adaptiertes System darstellt. Würde entweder die laterale Dichte, die N-Glykosylierung oder die Größe der Proteine beeinträchtigt werden, so wäre die Funktion der Antigenen Variation gestört und die Pathogenität des Parasiten gefährdet. Da die lokale Verteilung von GPI-verankerten Proteinen in biologischen Membranen ein wichtiges funktionelles Konzept darstellt, ist der Einfluss der untersuchten Faktoren nicht nur für den VSG-Mantel relevant, sondern kann auch für das generelle Verständnis
der Dynamik von Proteinen in zellulären Membranen dienen.
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In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert.
Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt.