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- Broad Institute, USA (1)
- Department Pharmazie - Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- Department of Hematology and Oncology, Sana Hospital Hof, Hof, Germany (1)
- Department of Laboratory Medicine and Medicine Huddinge, Karolinska Institutet and University Hospital, Stockholm, Sweden (1)
- Department of Medicine A, University Hospital of Münster, Münster, Germany (1)
- Instituto de Higiene, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay (1)
- Instituto de Hygiene Montevideo, Uruguay (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (Universitätsklinikum) (1)
- Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Hans-Knöll-Institut (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 2016 FGR 0053 (1)
- 278864 (1)
- 847507 (1)
Despite available diagnostic tests and recent advances, diagnosis of pulmonary invasive aspergillosis (IPA) remains challenging. We performed a longitudinal case-control pilot study to identify host-specific, novel, and immune-relevant molecular candidates indicating IPA in patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Supported by differential gene expression analysis of six relevant in vitro studies, we conducted RNA sequencing of three alloSCT patients categorized as probable IPA cases and their matched controls without Aspergillus infection (66 samples in total). We additionally performed immunoassay analysis for all patient samples to gain a multi-omics perspective. Profiling analysis suggested LGALS2, MMP1, IL-8, and caspase-3 as potential host molecular candidates indicating IPA in investigated alloSCT patients. MMP1, IL-8, and caspase-3 were evaluated further in alloSCT patients for their potential to differentiate possible IPA cases and patients suffering from COVID-19-associated pulmonary aspergillosis (CAPA) and appropriate control patients. Possible IPA cases showed differences in IL-8 and caspase-3 serum levels compared with matched controls. Furthermore, we observed significant differences in IL-8 and caspase-3 levels among CAPA patients compared with control patients. With our conceptual work, we demonstrate the potential value of considering the human immune response during Aspergillus infection to identify immune-relevant molecular candidates indicating IPA in alloSCT patients. These human host candidates together with already established fungal biomarkers might improve the accuracy of IPA diagnostic tools.
Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori
(2004)
Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori.
Mass critical care caused by the severe acute respiratory syndrome corona virus 2 pandemic poses an extreme challenge to hospitals. The primary goal of hospital disaster preparedness and response is to maintain conventional or contingency care for as long as possible. Crisis care must be delayed as long as possible by appropriate measures. Increasing the intensive care unit (ICU) capacities is essential. In order to adjust surge capacity, the reduction of planned, elective patient care is an adequate response. However, this involves numerous problems that must be solved with a sense of proportion. This paper summarises preparedness and response measures recommended to acute care hospitals.
Die Zahl invasiver Pilzinfektionen ausgelöst durch C. glabrata steigt zunehmend und auch die Ausbildung multipler Resistenzen wird immer häufiger registriert. In dieser Arbeit wurden zwei klinische MDR-C. glabrata-Stämme systematisch analysiert, um den Ursprung der Mehrfachresistenz zu finden. Aufgefallen waren jene Isolate in vorhergehenden Untersuchungen von Aldejohann et. al., die 176 Stämme, die dem Referenzzentrum NRZ-Myk zugesandt wurden, auf ihr Resistenzverhalten gegen Echinocandine analysierten und auf FKS-Mutationen untersuchten. Die Isolate CG22 und CG56 zeigten ein Resistenzverhalten gegen Anidulafungin ohne eine FKS-Mutation aufzuweisen. In Mehrfachtestungen wurde das einheitliche Verhalten von CG56 in zehn Einzelkolonien verifiziert, um Mischkulturen oder heterogenes Verhalten innerhalb des Isolates ausschließen zu können. Nach Analyse der gesamten Genomsequenz von CG56 zeigte sich eine Mutation kurz vor der HS-Region von FKS2, die eine Erklärung für das Resistenzverhalten zu liefern scheint. Neben der Mutation in FKS2 wurde ebenfalls eine Mutation in FKS1 und in ERG3 bestätigt. Die Mutation in ERG3 führt zu einer Verschiebung im Sterolsynthesepathway und zu einer Neuverteilung der Zellmembranbestandteile. Das klinische Isolat CG22 fällt mit Resistenzen gegen Azole, Echinocandine und Amphotericin B auf und zeigte ebenfalls eine Mutationen in ERG3. Zusätzlich dazu ergab sich eine Loss-of- Function-Mutation in ERG4 und damit verbunden einen massiv reduzierten Ergosterolgehalt der Zellmembran. Die seltene Kombination aus ERG3 und ERG4 Mutation scheint die Erklärung für die außergewöhnliche Amphotericin B-Resistenz von CG22 zu liefern und wird hier als erstmals bei einem C. glabrata Isolat beschrieben. Dieser besondere Stamm, der sogar als panresistent bezeichnet werden kann, sollte Bestandteil weiterer Forschung werden. Der Sterolsynthesepathway dient als Angriffspunkt vieler Antimykotika und kann durch seine vielen Intermediate und abweichenden Abläufen zu unterschiedlichen Stoffwechselendprodukten führen. Der Ergosterolgehalt der Zellmembran eines C. glabrata-Stammes kann weitere Rückschlüsse auf die Empfindlichkeit des Isolates geben und somit die Chancen des Therapieerfolges der Antimykotikagabe besser vorhersagen und könnte somit einen vielversprechenden Beitrag zur Behandlung lebensbedrohlicher Candidosen leisten.
C.dubliniensis kann, wie auch die nahe verwandte Spezies C.albicans, als Antwort auf eine Reihe von Umweltfaktoren von der Hefeform in echtes filamentöses Wachstum übergehen. Bei der Regulation des pH-abhängigen Dimorphismus von C.dubliniensis spielt, wie bei verschiedenen anderen Pilzspezies der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Rim101 eine zentrale Rolle. Dieser weist mit 85% zwar eine im Speziesvergleich geringe Aminosäure-identität zu C.albicans-Rim101 auf, zeigt jedoch die gleiche pH-abhängige Expression wie C.albicans-RIM101, ist in C.albicans funktionell aktiv und kann die typischen Defekte einer C.albicans-rim101-Nullmutante komplementieren. C.dubliniensis-Rim101 ist zudem beteiligt an der Regulation des Wachstums bei 45°C und der Koloniefärbung auf CHROM agar-Candida, zwei Eigenschaften, in denen sich C.albicans und C.dubliniensis unterscheiden. Ursache für diese speziesspezifische Merkmalsausprägung ist die bei C.dubliniensis deutlich stärkere Expression von RIM101. Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwischen C.albicans und C.dubliniensis betrifft mit der Fähigkeit zu Filamentierung und invasivem Wachstum zwei für C.albicans nachgewiesenermaßen wichtige Virulenzfaktoren. Auf Kochblutagar, nach 24 - 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2, bildet C.dubliniensis glatte, weiß-glänzende, scharf begrenzte halbkugelförmige Kolonien, während C.albicans-Kolonien eine rauhe, grau erscheinende Oberfläche aufweisen und mit Ausläufern in den umgebenden Agar einwachsen. Auslösend für die ausgeprägte Filamentierung von C.albicans ist das additive Zusammenwirken von erhöhtem CO2-Gehalt, erhöhter Temperatur und einem noch nicht endgültig identifizierten Bestandteil des Kochblutagars. Mit einer Sensitivität von 95,8% und einer Spezifität von 100% eignet sich dieses Verfahren auch als einfacher diagnostischer Test. Auf molekularer Ebene sind Efg1 und Cph1 an der Filamentierungsauslösung beteiligt, wobei Efg1 aber eine wesentlich größere Bedeutung zukommt. Rim101 scheint keinen Einfluss zu haben.
Psychosocial factors affect mental health and health-related quality of life (HRQL) in a complex manner, yet gender differences in these interactions remain poorly understood. We investigated whether psychosocial factors such as social support and personal and work-related concerns impact mental health and HRQL differentially in women and men during the first year of the COVID-19 pandemic. Between June and October 2020, the first part of a COVID-19-specific program was conducted within the “Characteristics and Course of Heart Failure Stages A-B and Determinants of Progression (STAAB)” cohort study, a representative age- and gender-stratified sample of the general population of Würzburg, Germany. Using psychometric networks, we first established the complex relations between personal social support, personal and work-related concerns, and their interactions with anxiety, depression, and HRQL. Second, we tested for gender differences by comparing expected influence, edge weight differences, and stability of the networks. The network comparison revealed a significant difference in the overall network structure. The male (N = 1370) but not the female network (N = 1520) showed a positive link between work-related concern and anxiety. In both networks, anxiety was the most central variable. These findings provide further evidence that the complex interplay of psychosocial factors with mental health and HRQL decisively depends on gender. Our results are relevant for the development of gender-specific interventions to increase resilience in times of pandemic crisis.
Delayed natural killer (NK) cell reconstitution after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) is associated with a higher risk of developing invasive aspergillosis. The interaction of NK cells with the human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is mediated by the fungal recognition receptor CD56, which is relocated to the fungal interface after contact. Blocking of CD56 signaling inhibits the fungal mediated chemokine secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES and reduces cell activation, indicating a functional role of CD56 in fungal recognition. We collected peripheral blood from recipients of an allograft at defined time points after alloSCT (day 60, 90, 120, 180). NK cells were isolated, directly challenged with live A. fumigatus germ tubes, and cell function was analyzed and compared to healthy age and gender-matched individuals. After alloSCT, NK cells displayed a higher percentage of CD56\(^{bright}\)CD16\(^{dim}\) cells throughout the time of blood collection. However, CD56 binding and relocalization to the fungal contact side were decreased. We were able to correlate this deficiency to the administration of corticosteroid therapy that further negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES. As a consequence, the treatment of healthy NK cells ex vivo with corticosteroids abrogated chemokine secretion measured by multiplex immunoassay. Furthermore, we analyzed NK cells regarding their actin cytoskeleton by Structured Illumination Microscopy (SIM) and flow cytometry and demonstrate an actin dysfunction of NK cells shown by reduced F-actin content after fungal co-cultivation early after alloSCT. This dysfunction remains until 180 days post-alloSCT, concluding that further actin-dependent cellular processes may be negatively influenced after alloSCT. To investigate the molecular pathomechansism, we compared CD56 receptor mobility on the plasma membrane of healthy and alloSCT primary NK cells by single-molecule tracking. The results were very robust and reproducible between tested conditions which point to a different molecular mechanism and emphasize the importance of proper CD56 mobility.
Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt.
Meningokokken sind nach wie vor eine wichtige Ursache für Gehirnhautentzündungen und Sepsen weltweit, vor allem bei Kindern und Jugendlichen. Weil viele Pathomechanismen dieses Erregers bislang noch unvollständig verstanden sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit populationsbiologische und pathogenetische Aspekte von Neisseria meningitidis untersucht. Die Kapsel ist der hauptsächliche Pathogenitätsfaktor von Meningokokken und wichtig für die Besiedelung von neuen Wirten. Isolate von symptomfreien Trägern sind allerdings häufig unbekapselt. Um Ursachen oder Mechanismen für den Verlust der Kapselexpression aufzudecken, wurden insgesamt 166 Isolate der Bayerischen Meningokokkenträgerstudie untersucht. Alle Isolate besaßen sämtliche zur Kapselsynthese notwendigen Gene, exprimierten aber keine Kapsel. Bei 39 Isolaten fanden sich Längenvariationen in homopolymeren Sequenzen (slipped strand mispairing, SSM) in den Genen siaA und siaD. 46 Isolate enthielten Insertionselemente (IS1301, IS1016 und IS1106) in den Genen der Kapselsynthese. Irreversible Mutationen (Deletionen, Insertionen, Basensubstitutionen) wurden bei 47 Isolaten gefunden. Veränderungen der Promotorregion schienen keine Rolle zu spielen. Es wurden bei insgesamt sechs Isolaten zwei nicht-synonyme Mutationen in unmittelbarer Nähe zum putativen aktiven Zentrum der UDP-N- Acetylglukosamin-2-Epimerase entdeckt, die einen Verlust der Kapselsynthese erklären könnten. Insgesamt wurden keine Akkumulationen von Mutationen in defekten Genen gefunden und es gab auch keine Korrelationen zwischen den verschieden Ursachen und bestimmten klonalen Linien. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der zur Blockierung der Kapselexpression führenden Ereignisse erst im aktuellen Wirt aufgetreten sind und dass zumindest bei bestimmten klonalen Linien die Verbreitung von der Expression einer Kapsel abhängig ist. Viele pathogene Bakterien nutzen zur Infektion des Menschen die ubiquitär im Körper vorkommende Protease Plasmin. Dazu binden diese Plasmin oder das Proenzym Plasminogen. Auch Meningokokken interagieren mit Plasmin und Plasminogen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten drei Rezeptormoleküle für Plasminogen identifiziert werden. Die drei Proteine Enolase, DnaK und Peroxiredoxin konnten mit verschiedenen Methoden auf der Oberfläche der Erreger nachgewiesen werden. Die Bindung des Plasminogens ist bei Meningokokken ausschließlich über Lysinreste der Rezeptoren vermittelt, die C-terminalen Lysinreste der hier identifizierten Rezeptormoleküle spielen aber, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die Bindung von Plasminogen war durch rekombinante Rezeptorproteine konzentrationsabhängig inhibierbar. Plasminogen konnte von Meningokokken auch aus dem Serum rekrutiert werden. Gebundenes Plasminogen war mit uPA (Urokinase Plasminogen Aktivator) aktivierbar und physiologisch aktiv, was durch die Degradation von Fibrinogen nachgewiesen wurde. Das gebundene Plasmin wurde durch die Bakterien vor der Desaktivierung durch α2- Antiplasmin geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Meningokokken auch mit weiteren Faktoren des Fibrinolyse-Systems (uPA) interagieren. Sie rekrutierten uPA an ihre Oberfläche und gebundenes uPA war physiologisch aktiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestärken die These, dass Meningokokken die Faktoren des Fibrinolyse-Systems für ihre Pathogenese nutzen.
Fungal eye infections can lead to loss of vision and blindness. The disease is most prevalent in the tropics, although case numbers in moderate climates are increasing as well. This study aimed to determine the dominating filamentous fungi causing eye infections in Germany and their antifungal susceptibility profiles in order to improve treatment, including cases with unidentified pathogenic fungi. As such, we studied all filamentous fungi isolated from the eye or associated materials that were sent to the NRZMyk between 2014 and 2020. All strains were molecularly identified and antifungal susceptibility testing according to the EUCAST protocol was performed for common species. In total, 242 strains of 66 species were received. Fusarium was the dominating genus, followed by Aspergillus, Purpureocillium, Alternaria, and Scedosporium. The most prevalent species in eye samples were Fusarium petroliphilum, F. keratoplasticum, and F. solani of the Fusarium solani species complex. The spectrum of species comprises less susceptible taxa for amphotericin B, natamycin, and azoles, including voriconazole. Natamycin is effective for most species but not for Aspergillus flavus or Purpureocillium spp. Some strains of F. solani show MICs higher than 16 mg/L. Our data underline the importance of species identification for correct treatment.
Fungi of the order Mucorales colonize all kinds of wet, organic materials and represent a permanent part of the human environment. They are economically important as fermenting agents of soybean products and producers of enzymes, but also as plant parasites and spoilage organisms. Several taxa cause life-threatening infections, predominantly in patients with impaired immunity. The order Mucorales has now been assigned to the phylum Mucoromycota and is comprised of 261 species in 55 genera. Of these accepted species, 38 have been reported to cause infections in humans, as a clinical entity known as mucormycosis. Due to molecular phylogenetic studies, the taxonomy of the order has changed widely during the last years. Characteristics such as homothallism, the shape of the suspensors, or the formation of sporangiola are shown to be not taxonomically relevant. Several genera including Absidia, Backusella, Circinella, Mucor, and Rhizomucor have been amended and their revisions are summarized in this review. Medically important species that have been affected by recent changes include Lichtheimia corymbifera, Mucor circinelloides, and Rhizopus microsporus. The species concept of Rhizopus arrhizus (syn. R. oryzae) is still a matter of debate. Currently, species identification of the Mucorales is best performed by sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) region. Ecologically, the Mucorales represent a diverse group but for the majority of taxa, the ecological role and the geographic distribution remain unknown. Understanding the biology of these opportunistic fungal pathogens is a prerequisite for the prevention of infections, and, consequently, studies on the ecology of the Mucorales are urgently needed.
Echinocandin antifungals represent one of the most important drug classes for the treatment of invasive fungal infections. The mode of action of the echinocandins relies on inhibition of the β-1,3-glucan synthase, an enzyme essentially required for the synthesis of the major fungal cell wall carbohydrate β-1,3-glucan. Depending on the species, echinocandins may exert fungicidal or fungistatic activity. Apparently independent of this differential activity, a surprising in vitro phenomenon called the “paradoxical effect” can be observed. The paradoxical effect is characterized by the ability of certain fungal isolates to reconstitute growth in the presence of higher echinocandin concentrations, while being fully susceptible at lower concentrations. The nature of the paradoxical effect is not fully understood and has been the focus of multiple studies in the last two decades. Here we concisely review the current literature and propose an updated model for the paradoxical effect, taking into account recent advances in the field.
Introduction: This study investigates the role of Wolbachia bacteria in the pathogenesis of O. volvulus keratitis in a mouse model. Wolbachia bacteria are essential symbionts of most filarial nematodes of importance for mankind. Methods: Using a mouse model for river blindness in which soluble extracts of filarial nematodes are injected in the corneal stroma, changes in stromal thickness and haze of the cornea are observed by in vivo confocal microscopy, followed by immunohistochemical staining for neutrophils and PECAM-1, as well as ELISA of corneal chemokines. Reactions to filarial extracts containing Wolbachia are compared to those without the endosymbiont. Results: The approach of characterizing Wolbachia’s role in river blindness in this study is threefold. Firstly, Wolbachia-depleted extracts from doxycycline treated onchocerciasis patients led to a diminished inflammatory response in corneas of C57BL/6 mice compared to untreated, i.e. Wolbachia containing antigen. The decreased cell recruitment observed with doxycycline treated extracts involved neutrophils, but not eosinophils. This finding demonstrated that the presence of Wolbachia increases neutrophil recruitment. Secondly, extracts from Wolbachia-containing B. malayi revealed markedly more pathology than endosymbiont-free A. viteae antigen. This again pointed at the role of Wolbachia in development of disease. Thirdly, Toll-like Receptor 4 (TLR4) dependence was shown to exist for the inflammatory response to Wolbachia harboring O. volvulus antigen by looking at the corneal pathology in TLR4-mutant C3H/HeJ mice, compared to the wild-type C3H/HeN strain. Investigating further Wolbachia mediated mechanisms of neutrophil recruitment to the cornea, this study also showed that expression of the adhesion molecule PECAM-1 in limbal vessels, as well as upregulation of the CXC chemokines KC and MIP-2 were dependent on the presence of functional TLR4 and Wolbachia respectively. Conclusions: This study indicates that the innate immune system and Wolbachia endobacteria play an important role in the inflammatory response associated with the pathogenesis of onchocerca keratitis, suggesting a complete alteration in our understanding of the immunopathology of filariasis.
Zahlreiche humanpathogene bakterielle Erreger können ihre Fähigkeit zur Kolonisation epithelialer Barrieren optimieren, indem sie mit dem Zellzyklus der infizierten Wirtszelle in Wechselwirkung treten und so die Abschilferung und Erneuerung des Epithels verzögern. Die hierbei wirksamen bakteriellen Effektoren sind als „Cyclomoduline“ bekannt und gelten als neue Klasse bakterieller Pathogenitätsfaktoren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob durch die Infektion menschlicher pharyngealer Epithelzellen mit N. meningitidis der Zellzyklus der Wirtszelle beeinflusst wird. Mit zwei verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass die Infektion der Epithelzelllinie Detroit 562 mit verschiedenen Meningokokkenisolaten zu einer signifikanten Akkumulation von Epithelzellen in der G1-Phase führte. Dieser Effekt wurde sowohl von pathogenen Meningokokkenstämmen als auch von Trägerstämmen ausgelöst, jedoch nur durch Isolate, die fähig zur Adhärenz und zur Invasion in die Epithelzelle waren. Durch Hitzebehandlung der Bakterien konnte der Zellzyklusarrest vollständig aufgehoben werden. Ebenso konnte der Effekt durch Inkubation der Epithelzellen mit bakteriellen Kulturüberständen und durch Infektion der Zellen mit E. coli-Stämmen, welche die Meningokokkenadhäsine Opa und Opc überexprimieren, nicht ausgelöst werden.
Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Infektion mit N. meningitidis in der Zielzelle zu einer signifikant gesteigerten Expression des CDK-Inhibitors p21WAF1/Cip1 führte, begleitet von einer vermehrten Lokalisation im Zellkern. Auch zeigte sich eine veränderte Proteinexpression der für die G1-Phase relevanten Cycline D und E. Diese scheint sich erst posttranslational zu ereignen, da die unterschiedliche Expression auf mRNA-Ebene nicht festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass die Infektion von Pharynxepithelzellen mit lebenden, zur Adhärenz und Invasion fähigen Meningokokkenstämmen in der menschlichen Zielzelle einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase verursacht, vermutlich durch veränderte Expression der Zellzyklusregulatoren p21WAF1/Cip1, Cyclin D und Cyclin E. Möglicherweise stellt die Induktion dieses Zellzyklusarrestes einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Kolonisation des oberen Atemwegsepithels durch N. meningitidis dar.
Meningokokken gehören zu den wichtigsten Erregern bakterieller Sepsis und Meningitis. Der Schweregrad des Krankheitsverlaufs bei Meningokokkenerkrankungen korreliert mit der Konzentration an proinflammatorischen Zytokinen im Serum. Dendritische Zellen (DZ) bilden die erste Abwehr am humanen Epithel des Nasopharynx, welches die Eingangspforte von Neisseria meningitidis darstellt und sind eine wichtige Quelle proinflammatorischer Zytokine. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bekapselte Meningokokken-Stämme bei DZ signifikant weniger proinflammatorische Zytokine als isogene Kapsel-defiziente Stämme oder obligat unbekapselte Stämme induzieren. Dieser Effekt ist unabhängig von der chemischen Zusammensetzung der Kapsel, da aufgereinigtes Kapselpolysaccharid der Serogruppe B nicht den reduzierenden Effekt der Zytokininduktion beeinflusste. Darüber hinaus spielt die Kapsel-O-Acetylierung bei Serogruppe C, W-135 und Y nur eine untergeordnete Rolle bei der Erkennung von Meningokokken durch DZ. Microarray Versuche zum Transkriptionsprofil von DZ, die mit dem konstitutiv unbekapselten Trägerisolat alpha 14, dem bekapselten MC58 oder dem isogenen unbekapselten Stamm MC58siaD durchgeführt wurden, zeigten nach 4 h ein identisches Profil von proinflammatorischen Zytokinen. Nur der phagozytierte unbekapselten Stamm MC58siaD zeigte eine differentielle Regulation von weiteren Zytokinen. Jedoch glich sich das Profil nach 18 h Infektion durch alle drei Stämme an. Der Scavenger Rezeptor der Klasse A (SR-A) wurde als Hauptrezeptor identifiziert, der die Erkennung und Phagozytose von Meningokokken durch DZ initialisiert. Eine Assoziation phagozytierter Meningokokken mit SR-A konnte mittels Elektronenmikroskopie bestätigt werden. Nach Infektion von THP-1 Makrophagen mit bekapselten Serogruppe B und C Stämmen, den isogenen Kapsel-defizienten Stämmen und dem obligat unbekapselten Stamm alpha 14 wurde auf Transkriptionsebene keine differentielle Regulation der SR-A nachgewiesen. Lediglich eine minimale Hochregulation des SR-A auf der zellulären Oberfläche konnte nach einer Stunde Infektion verzeichnet werden. Nach Infektion von DZ oder THP-1 Makrophagen mit MC58siaD kommt es zur Dephosphorylierung des SR-A. Unter Verwendung von globalen Phagozytose-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die maximale Induktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-1 Phagozytose von N. meningitidis benötigen wird, dies ist jedoch für die IL 8 Produktion nicht notwendig. Außerdem konnte gezeigt werden, dass mit dem spezifischen SR-A Inhibitor poly G eine Reduktion von TNF-alpha, IL-6, IL-1 und IL-8 zu verzeichnen war. Folglich ist die Phagozytose über SR-A nötig, um TNF-alpha, IL-6 und IL-1 zu induzieren, jedoch nur die Erkennung aber nicht die Phagozytose via SR-A die IL-8 Produktion initiiert. Die Aufnahme von Neisseria meningitidis über den SR-A durch DZ ist damit nicht nur für die Phagozytose und Abtötung verantwortlich sondern auch für die Zytokininduktion wichtig ist. Es gibt jedoch auch Meningokokken Stämme, die nicht vom SR-A erkannt werden. Mit alpha 14 konnte erstmals ein Meningokokken-Stamm identifiziert werden, der nicht an SR-A bindet. Die Induktion von Zytokinfreisetzung durch alpha 14 erfolgt dementsprechend unabhängig von SR-A und nach Kontakt von alpha 14 mit humanen DZ ist keine Veränderung der Phosphorylierungsstatus dieses Rezeptors zu beobachten. Die erhobenen Daten legen eine zentrale Rolle von SR-A in der Induktion von Immunität gegen N. meningitidis nahe.
Accumulating evidences have assigned a central role to parasite-derived proteins in immunomodulation. Here, we report on the proteomic identification and characterization of immunomodulatory excretory-secretory (ES) products from the metacestode larva (tetrathyridium) of the tapeworm Mesocestoides corti (syn. M. vogae). We demonstrate that ES products but not larval homogenates inhibit the stimuli-driven release of the pro-inflammatory, Th1-inducing cytokine IL-12p70 by murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Within the ES fraction, we biochemically narrowed down the immunosuppressive activity to glycoproteins since active components were lipid-free, but sensitive to heat- and carbohydrate-treatment. Finally, using bioassay-guided chromatographic analyses assisted by comparative proteomics of active and inactive fractions of the ES products, we defined a comprehensive list of candidate proteins released by M. corti tetrathyridia as potential suppressors of DC functions. Our study provides a comprehensive library of somatic and ES products and highlight some candidate parasite factors that might drive the subversion of DC functions to facilitate the persistence of M. corti tetrathyridia in their hosts.
Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.
Kurzfassung in deutsch Ziel dieser Studie war die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque bei einem Hypophosphatasiepatientenkollektiv durch Anwendung der 16S rRNA Technologie. Das Kollektiv bestand aus sieben männlichen Patienten mit einer infantil-juvenilen Hypophosphatasie. Es sollten mikrobiologische Evidenzen für oder gegen die Hypothese einer frühen Parodontitis bei Hypophosphatasiepatienten gewonnen werden. Subgingivale Plaqueproben wurden von jedem Patienten entnommen. Anschließend folgte die DNA Extraktion aus den Plaqueproben und die Amplifikation der 16S rRNA Gene mittels zweier verschiedener universeller Primer-Paare: 27f/519r; 515f/1525r. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Dann folgte ein Vergleich der Sequenzen mit der Genbank Database durch den BLAST-Server des National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA). Insgesamt wurden zwei verschiedene 16S rRNA Genbanken erstellt und 101 Klone pro Genbank identifiziert. Mit der 27f/519r PCR wurden 15 bakterielle Familien, mit der 515f/1525r PCR 10 bakterielle Familien identifiziert. 66 Phylotypen wurden in der 27f/519r Genbank identifiziert, 41 in der 515f/1525r Genbank. Der Coverage war 50% in der 27f/519r Genbank und 73% in der zweiten Genbank. In allgemeinen zeigte sich ein hoher Anzahl der Keime der physiologischen Plaqueflora (Streptococcus sp. und Actinomyces sp.), dagegen kamen putative Parodontalpathogene wie Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis, Campylobacter rectus niemals vor. Die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque erbrachte eine deutlich andere Zusammensetzung im Vergleich zu Padodontitispatienten. Es zeigte sich somit keine mikrobiologische Evidenz für eine Parodontitis bei dem Hypophosphatasiepatientenkollektiv.
Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen.
Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht.
Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität.
Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus.
Visceral pentastomiasis caused by Armillifer armillatus larvae was diagnosed in 2 dogs in The Gambia. Parasites were subjected to PCR; phylogenetic analysis confirmed relatedness with branchiurans/crustaceans. Our investigation highlights transmission of infective A. armillatus ova to dogs and, by serologic evidence, also to 1 human, demonstrating a public health concern.
Patients suffering from coronavirus disease-2019 (COVID-19) are susceptible to deadly secondary fungal infections such as COVID-19-associated pulmonary aspergillosis and COVID-19-associated mucormycosis. Despite this clinical observation, direct experimental evidence for severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2)-driven alterations of antifungal immunity is scarce. Using an ex-vivo whole blood stimulation assay, we challenged blood from twelve COVID-19 patients with Aspergillus fumigatus and Rhizopus arrhizus antigens and studied the expression of activation, maturation, and exhaustion markers, as well as cytokine secretion. Compared to healthy controls, T-helper cells from COVID-19 patients displayed increased expression levels of the exhaustion marker PD-1 and weakened A. fumigatus- and R. arrhizus-induced activation. While baseline secretion of proinflammatory cytokines was massively elevated, whole blood from COVID-19 patients elicited diminished release of T-cellular (e.g., IFN-γ, IL-2) and innate immune cell-derived (e.g., CXCL9, CXCL10) cytokines in response to A. fumigatus and R. arrhizus antigens. Additionally, samples from COVID-19 patients showed deficient granulocyte activation by mold antigens and reduced fungal killing capacity of neutrophils. These features of weakened anti-mold immune responses were largely decoupled from COVID-19 severity, the time elapsed since diagnosis of COVID-19, and recent corticosteroid uptake, suggesting that impaired anti-mold defense is a common denominator of the underlying SARS-CoV-2 infection. Taken together, these results expand our understanding of the immune predisposition to post-viral mold infections and could inform future studies of immunotherapeutic strategies to prevent and treat fungal superinfections in COVID-19 patients.
Meningococci spread via respiratory droplets, whereas the closely related gonococci are transmitted sexually. Several outbreaks of invasive meningococcal disease have been reported in Europe and the United States among men who have sex with men (MSM). We recently identified an outbreak of serogroup C meningococcal disease among MSM in Germany and France. In this study, genomic and proteomic techniques were used to analyze the outbreak isolates. In addition, genetically identical urethritis isolates were recovered from France and Germany and included in the analysis. Genome sequencing revealed that the isolates from the outbreak among MSM and from urethritis cases belonged to a clade within clonal complex 11. Proteome analysis showed they expressed nitrite reductase, enabling anaerobic growth as previously described for gonococci. Invasive isolates from MSM, but not urethritis isolates, further expressed functional human factor H binding protein associated with enhanced survival in a newly developed transgenic mouse model expressing human factor H, a complement regulatory protein. In conclusion, our data suggest that urethritis and outbreak isolates followed a joint adaptation route including adaption to the urogenital tract.
In the present thesis, two projects on the use of microarray technology for molecular epidemiology of Neisseria meningitidis have been followed. The first one evaluated microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design for typing of N. meningitidis adopting the multilocus sequence typing (MLST) concept. The number of oligonucleotides needed to cover all known polymorphisms was much lower compared to the number needed if a tiling strategy would have been chosen. Initial experiments using oligonucleotides 28-32 nucleotides in length, revealed that the applied hybridisation protocols were highly specific. However, despite of several optimisation steps, the rate of misidentification of oligonucleotides remained >1.8% in consecutive validation experiments using arrays representing the genetic diversity at three MLST loci. This finding led to the assumption that the high density of polymorphic sites and extensive GC-content variations at N. meningitidis MLST loci hindered the successful implementation of MLST microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design. In the 1980s, the ET-15 clone emerged within the ST-11 complex of N. meningitidis. This new clone was associated with severe meningococcal disease and outbreaks world-wide. Therefore, the goal of the second project was to identify genetic differences between ET-15 strains and other ST-11 strains using whole genome microarray technology. Three genes encoding hypothetical proteins were identified to be present in all ET-15 strains but absent in other ST-11 strains. This finding together with unpublished observation from our group suggested that several genome alterations occurred before the clonal expansion of the ET-15 clone started. The role that these three genes play in the pathogenicity of the ET-15 clone is unclear. The genome comparisons revealed furthermore that studies of the ET-15 clone displayed approximately two-fold less gene content variation than ST-11 strains not belonging to the ET-15 clone. This finding is in accordance with the recent emergence and clonal expansion of the ET-15 variant.
Background: The aim of this study was to assess the impact of antimicrobial stewardship interventions on surgical antibiotic prescription behavior in the management of non-elective surgical intra-abdominal infections, focusing on postoperative antibiotic use, including the appropriateness of indications. Methods: A single-center quality improvement study with retrospective evaluation of the impact of antimicrobial stewardship measures on optimizing antibacterial use in intra-abdominal infections requiring emergency surgery was performed. The study was conducted in a tertiary hospital in Germany from January 1, 2016, to January 30, 2020, three years after putting a set of antimicrobial stewardship standards into effect. Results: 767 patients were analyzed (n = 495 in 2016 and 2017, the baseline period; n = 272 in 2018, the antimicrobial stewardship period). The total days of therapy per 100 patient days declined from 47.0 to 42.2 days (p = 0.035). The rate of patients receiving postoperative therapy decreased from 56.8% to 45.2% (p = 0.002), comparing both periods. There was a significant decline in the rate of inappropriate indications (17.4% to 8.1 %, p = 0.015) as well as a significant change from broad-spectrum to narrow-spectrum antibiotic use (28.8% to 6.5%, p ≤ 0.001) for postoperative therapy. The significant decline in antibiotic use did not affect either clinical outcomes or the rate of postoperative wound complications. Conclusions: Postoperative antibiotic use for intra-abdominal infections could be significantly reduced by antimicrobial stewardship interventions. The identification of inappropriate indications remains a key target for antimicrobial stewardship programs.
Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte.
Azole resistance of the fungal pathogen Aspergillus fumigatus is an emerging problem. To identify novel mechanisms that could mediate azole resistance in A. fumigatus, we analyzed the transcriptome of a mitochondrial fission/fusion mutant that exhibits increased azole tolerance. Approximately 12% of the annotated genes are differentially regulated in this strain. This comprises upregulation of Cyp51A, the azole target structure, upregulation of ATP-binding cassette (ABC) superfamily and major facilitator superfamily (MFS) transporters and differential regulation of transcription factors. To study their impact on azole tolerance, conditional mutants were constructed of seven ABC transporters and 17 transcription factors. Under repressed conditions, growth rates and azole susceptibility of the mutants were similar to wild type. Under induced conditions, several transcription factor mutants showed growth phenotypes. In addition, four ABC transporter mutants and seven transcription factor mutants exhibited altered azole susceptibility. However, deletion of individual identified ABC transporters and transcription factors did not affect the increased azole tolerance of the fission/fusion mutant. Our results revealed the ability of multiple ABC transporters and transcription factors to modulate the azole susceptibility of A. fumigatus and support a model where mitochondrial dysfunctions trigger a drug resistance network that mediates azole tolerance of this mold.
Neisseria meningitidis (meningococcus) causes invasive diseases such as meningitis or septicaemia. Ex vivo infection of human whole blood is a valuable tool to study meningococcal virulence factors and the host innate immune responses. In order to consider effects of cellular mediators, the coagulation cascade must be inhibited to avoid clotting. There is considerable variation in the anticoagulants used among studies of N. meningitidis whole blood infections, featuring citrate, heparin or derivatives of hirudin, a polypeptide from leech saliva. Here, we compare the influence of these three different anticoagulants, and additionally Mg/EGTA, on host innate immune responses as well as on viability of N. meningitidis strains isolated from healthy carriers and disease cases, reflecting different sequence types and capsule phenotypes. We found that the anticoagulants significantly impact on cellular responses and, strain-dependently, also on bacterial survival. Hirudin does not inhibit complement and is therefore superior over the other anticoagulants; indeed hirudin-plasma most closely reflects the characteristics of serum during N. meningitidis infection. We further demonstrate the impact of heparin on complement activation on N. meningitidis and its consequences on meningococcal survival in immune sera, which appears to be independent of the heparin binding antigens Opc and NHBA.
Diagnosis and therapy of Mycobacterium marinum: a single-center 21-year retrospective analysis
(2022)
Background and Objectives
In Europe, infections with Mycobacterium (M.) marinum are rare. We conducted a retrospective single-center study to assess the clinical spectrum of M. marinum infection and its diagnosis, treatment and outcome under real-world conditions.
Patients and Methods
Eighteen patients presenting with M. marinum infections between 1998 and 2018 were identified in the data warehouse of the University Hospital Würzburg and considered for detailed analysis.
Results
Twelve patients reported aquatic exposure. In 16/18 cases the upper extremities were affected. No invasive infections were detected. Mean time to diagnosis was 15 weeks. Histology revealed granulomatous inflammation in 14 patients while mycobacterial cultures were positive for M. marinum in 16 cases. Most patients received antibiotic monotherapy (14/18) while combination therapy was administered in four cases. Treatment (with a median duration of 10 weeks) was successful in 13 patients. Five patients were lost to follow-up.
Conclusions
Our retrospective analysis of M. marinum infections at a German tertiary referral center revealed a considerable diagnostic delay and the relevance of microbiological culture, PCR and histology for diagnosis. Monotherapy with clarithromycin (rather than doxycycline) appeared as a reasonable treatment option while immunosuppressed or -compromised patients and those with extended disease received combination therapy.
Background: The diagnosis of periprosthetic shoulder infection (PSI) requires a thorough diagnostic workup. Synovial fluid aspiration has been proven to be a reliable tool in the diagnosis of joint infections of the lower extremity, but shoulder specific data is limited. This study defines a threshold for synovial fluid white blood cell count (WBC) and assesses the reliability of microbiological cultures. Methods: Retrospective study of preoperative and intraoperative fluid aspiration of 31 patients who underwent a revision of a shoulder arthroplasty (15 with PSI defined by IDSA criteria, 16 without infection). The threshold for WBC was calculated by ROC/AUC analysis. Results: WBC was significantly higher in patients with PSI than in other patients. A threshold of 2800 leucocytes/mm\(^3\) showed a sensitivity of 87% and a specificity of 88% (AUROC 0.92). Microbiological cultures showed a sensitivity of 76% and a specificity of 100%. Conclusions: A threshold of 2800 leucocytes/mm\(^3\) in synovial fluid can be recommended to predict PSI. Microbiological culture has an excellent specificity and allows for targeted antibiotic therapy. Joint aspiration presents an important pillar to diagnose PSI.
Background
Joint aspiration with analysis of synovial fluid white blood cell count (WBC) and microbiological culture is a widely established aspect in the diagnosis of shoulder joint infections (SJI). In case of a two stage revision for SJI, joint aspiration before re−/implantation of a total shoulder arthroplasty (TSA) was used to rule out persistent infection for years but its value is under debate. Shoulder specific data on all aspects is rare. The current study aims to answer the following research questions: Does joint aspiration have an insufficient predictive value in the diagnosis of SJI in (1) initial workup and (2) before definite arthroplasty with polymethylmethacrylate (PMMA)-Spacer in place?
Methods
This retrospective evaluation investigates 35 patients that were treated for SJI with a two staged implantation of a TSA after debridement and implantation of an PMMA-Spacer. Joint aspirations were performed preoperatively (PA) and before re−/implantation of the prosthesis while spacer was in place (interstage aspiration, IA). Samples were taken for microbiological culture and analysis of WBC. Sensitivity and specificity were calculated with reference to intraoperative microbiological samples. Receiver Operating Characteristic (ROC), Area-Under-Curve analysis (AUC) and calculation of the Youden index were performed to find optimum cut-off for WBC.
Results
The sensitivity of microbiological cultures from PA was 58.3% and the specificity was 88.9%. The mean WBC was 27,800 leucocytes/mm3 (range 400-96,300). The maximum Youden index (0.857) was a cut-off of 2600 leucocytes/mm3 with a sensitivity of 85.7% and a specificity of 100.0%. The sensitivity and specificity of IA were 0.0% and 88.5%, respectively.
Conclusions
Preoperative aspiration is likely to miss Cutibacteria spp. and CoNS and cannot rule out infection for sure. However, we recommend it for its advantages of targeted antibiotic therapy in case of germ identification. Empiric antibiotic therapy should cover Cutibacteria and CoNS even if aspiration showed negative microbiological cultures. In contrast, the diagnostic value of interstage aspiration does not qualify for its routine use.
Objectives
Mechanisms of wound healing are often impaired in patients with osteonecrosis of the jaw (ONJ). According to the guidelines for the treatment of this disease, early surgical intervention is indicated. However, surgery often faces complications such as wound healing disorders. The application of platelet-rich fibrin (PRF) after necrosectomy between bone and mucosa may constitute a promising approach to improve surgical results. An aspect that was not investigated until now is that PRF acts as a “bio-carrier” for antibiotics previously applied intravenously.
Materials and methods
We investigated the antimicrobial properties of PRF in 24 patients presenting ONJ undergoing systemic antibiosis with ampicillin/sulbactam. We measured the concentration of ampicillin/sulbactam in plasma and PRF and performed agar diffusion tests. Ampicillin/sulbactam was applied intravenously to the patient 10 minutes for blood sampling for PRF. No further incorporation of patients’ blood or PRF product with antibiotic drugs was obtained. Four healthy patients served as controls.
Results
Our results revealed that PRF is highly enriched with ampicillin/sulbactam that is released to the environment. The antibiotic concentration in PRF was comparable to the plasma concentration of ampicillin/sulbactam. The inhibition zone (IZ) of PRF was comparable to the standard ampicillin/sulbactam discs used in sensitivity testing.
Conclusions
The results of our study demonstrated that PRF is a reliable bio-carrier for systemic applied antibiotics and exhibits a large antimicrobial effect.
Clinical relevance
We describe a clinically useful feature of PRF as a bio-carrier for antibiotics. Especially when applied to poorly perfused tissues and bone such as in ONJ, the local release of antibiotics can reduce wound healing disorders like infections.
Bone concentration of ampicillin/sulbactam: a pilot study in patients with osteonecrosis of the jaw
(2022)
Osteonecrosis of the jaw (ONJ) occurs typically after irradiation of the head and neck area or after the intake of antiresorptive agents. Both interventions can lead to compromised bone perfusion and can ultimately result in infection and necrosis. Treatment usually consists of surgical necrosectomy and prolonged antibiotic therapy, usually through beta-lactams such as ampicillin/sulbactam. The poor blood supply in particular raises the question as to whether this form of antibiosis can achieve sufficient concentrations in the bone. Therefore, we investigated the antibiotic concentration in plasma and bone samples in a prospective study. Bone samples were collected from the necrosis core and in the vital surrounding bone. The measured concentrations in plasma for ampicillin and sulbactam were 126.3 ± 77.6 and 60.2 ± 35.0 µg/mL, respectively. In vital bone and necrotic bone samples, the ampicillin/sulbactam concentrations were 6.3 ± 7.8/1.8 ± 2.0 µg/g and 4.9 ± 7.0/1.7 ± 1.7 µg/g, respectively. These concentrations are substantially lower than described in the literature. However, the concentration seems sufficient to kill most bacteria, such as Streptococci and Staphylococci, which are mostly present in the biofilm of ONJ. We, therefore, conclude that intravenous administration of ampicillin/sulbactam remains a valuable treatment in the therapy of ONJ. Nevertheless, increasing resistance of Escherichia coli towards beta-lactam antibiotics have been reported and should be considered.
Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten.
128 Meningokokkenstämme unterschiedlicher klonaler Linien und Serogruppen aus verschiedenen Ländern wurden im Rahmen eines Screenings auf die Präsenz von Plasmiden untersucht. Aus 66% der Stämme konnten Plasmide isoliert werden. Diese waren innerhalb der verschiedenen klonalen Linien spezifisch verteilt. Das 1,986 kb große Plasmid pJS-A (EMBL Accession Number AJ238491) fand sich ausschließlich in Serogruppe A Stämmen der Subgruppe VI. Das 7,245 kb große Plasmid pJS-B (EMBL Accession Number AJ277475) wurde in 91% der untersuchten ET-37 Stämme und in 67% der nahe verwandten Cluster A4 Stämme gefunden. Es ist ein hochspezifischer Marker für diese klonalen Linien. Aus Vertretern des ET-5 Komplexes konnten keine Plasmide isoliert werden. Die Plasmide pJS-A und pJS-B wurden vollständig sequenziert. Beide zeichnen sich durch einen für Meningokokken untypisch hohen AT-Gehalt aus (pJS-A: 55,4%, pJS-B: 57,9%). Auf pJS-A befinden sich zwei, auf pJS-B acht offene Leseraster. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab für beide Plasmide keine signifikanten Homologien zu Datenbankeinträgen. Für pJS-B wurde an Position 20 bis 307 eine 93%ige Identität mit einer für das Genom des Gonokokkenstammes MS11-A beschriebenen Region festgestellt, welche die beiden Inverted Repeats IR1 und IR2 enthält und dem Gen pivNG benachbart ist, das für eine Rekombinase kodiert. Bei der Repeat-Region des Gonokokkenstammes MS11-A handelt es sich nach Carrick et al. möglicherweise um eine Rekombinationsstelle. Es konnte gezeigt werden, dass pJS-B über seine homologe Repeat-Region chromosomal integriert. Ob es jedoch als wirkliches Plasmid eigenständig replizieren kann, bleibt zweifelhaft. pJS-A und pJS-B stellen Beispiele für die spezifische und stabile Verteilung von DNA-Elementen in einer Bakterienpopulation dar, die sich grundsätzlich durch genetische Vielfalt und regen Austausch von DNA auszeichnet. pJS-B ist eines von vielen DNA-Elementen, die für den ET-37 Komplex und den Cluster A4 spezifisch sind. Dies unterstützt das Konzept der genetischen Isolierung dieser hypervirulenten Linien.
Background
This study presents the results of a multidisciplinary, nosocomial MRSA outbreak investigation in an 8-bed medical intensive care unit (ICU). The identification of seven MRSA positive patients in the beginning of 2014 led to the closure of the ward for several weeks. A multidisciplinary, retrospective investigation was initiated in order to identify the reason and the source for the outbreak, describe MRSA transmission in the department and identify limitations in infection control.
Methods
The investigation comprised an epidemiological description of MRSA cases from 2012 to 2014 and a characterization of MRSA isolates, including phage-, spa- and PFGE-typing. Additionally, MRSA screening was performed from the hospital staff and the environment. To identify the reason for the outbreak, work-related, psychological and behavioral factors were investigated by impartial audits and staff interviews.
Results
Thirty-one MRSA cases were registered during the study period, and 36 isolates were investigated. Molecular typing determined the outbreak strain (phage type 54/812, PFGE type A4, spa type t003) and identified the probable index case. Nasal carriage in one employee and a high environmental contamination with the outbreak strain was documented. Important gaps in nursing procedures and general management were identified. Elevated stress levels and communication problems preceded the outbreak. Compliance with hand hygiene and isolation procedures was evaluated as appropriate.
Conclusion
This study demonstrates the complexity of controlling hospital-associated infections. The combined use of different typing methods is beneficial for outbreak investigations. Psychological, behavioral and other work-related factors have an important impact on the spread of nosocomial pathogens. These factors should be addressed and integrated in routine infection control practice.
Candida Spezies gehören als kommensale Organismen zur normalen menschlichen Mikroflora, können allerdings unter bestimmten Bedingungen Krankheitswert erlangen. Limitationen in der Behandlung durch immer mehr resistente Candida Spezies und die wachsende Zahl immunsupprimierter Patienten gelten als Hauptursachen für die steigende Häufigkeit invasiver Candidosen und systemischer Candidämien. Die 2009 entdeckte Spezies C. auris stellt durch ihre zahlreichen Resistenzen, das Potential zur Auslösung nosokomialer Ausbrüche in Krankenhäusern und die schnelle Verbreitung über mehrere Kontinente eine neue Herausforderung dar. Der Bedarf an neuen Antimykotika mit anderen Wirkmechanismen und neuen Zielstrukturen ist größer denn je. Die fungale Sphingolipid-Biosynthese wurde bereits mehrfach als potenzielles Ziel antimykotischer Therapie diskutiert, allerdings bezieht sich die meiste Forschung hierzu auf C. albicans]. In vorliegender Arbeit wurden die Auswirkungen der Inhibition der Sphingolipid Biosynthese durch Myriocin auf C. auris und sein Resistenzverhalten untersucht und mit denen auf andere Candida Spezies verglichen.
Sowohl die Mikrodilution als auch die Plattentropftests zeigten, dass C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies besonders sensitiv auf die Anwesenheit von Myriocin reagierte und stärker im Wachstum gehemmt wurde. Der Survival Assay ergab für alle drei Spezies ein Absenken der CFU durch Myriocin, die Abweichungen zwischen den Stämmen waren jedoch unwesentlich. Unterschiede konnten in Vitalität und Vermehrung der verschiedenen Spezies unter Myriocineinfluss festgestellt werden.
Aus der Lebend/Tot-Färbung ging hervor, dass Myriocin bei allen Stämmen zum Absterben von Candida Zellen führte, C. albicans und C. glabrata allerdings signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu den C. auris Isolaten aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte mithilfe der FITC-Mikroskopie gezeigt werden, dass Candida Zellen unter Zugabe von Myriocin weniger Tochterzellen ausbildeten, was auf eine erschwerte oder zumindest verlangsamte Zellvermehrung hindeutet. Dabei schien das Wachstum der C. auris Stämme durch Myriocin deutlich eingeschränkter zu sein als das von C. albicans und C. glabrata. Durch weitere Mikroskopie und die Kombination aus Lebend/Tot Färbung mittels PI und FITC Färbung, sollte die Verteilung der toten Zellen auf Mutter- und Tochterzellen evaluiert werden. Hier konnte ein Trend zu einem vermehrten Zellsterben der Tochterzellen, vor allem für C. auris, festgestellt werden. Abschließende E-Tests für Amphotericin B, Anidulafungin und Fluconazol ergaben eine signifikante Herabsetzung der MHK für alle C. auris Isolate durch Myriocin. Die hier vorgestellten Ergebnisse und die durch mehrere Studien festgestellten Differenzen in der Sphingolipidkomposition von C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies geben Hinweis darauf, dass Sphingolipide für Vitalität, Zellteilung und vor allem für die Wirkung einiger Antimykotika auf C. auris eine besondere, wenn nicht übergestellte Bedeutung haben könnten. Zwar wurde die Sphingolipidsynthese bereits mehrfach als potenzieller Angriffspunkt für die antifungale Therapie diskutiert, allerdings lediglich am Beispiel anderer Candida Spezies. Der Sphingolipidstoffwechsel könnte somit ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung des sonst so therapieresistenten und lebensbedrohlichen Pilzes C. auris sein.
Untersuchungen zur Pathogenität von Helicobacter hepaticus : genomische und funktionelle Aspekte
(2006)
Helicobacter hepaticus stellt den Prototyp der enterohepatischen Helicobacter dar und führt zu einer persistenten Infektion von Mäusen. In immundefizienten Tieren kann er eine chronische Entzündung des Darmtraktes auslösen, welche den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen, Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa, ähnelt. Deshalb wird H. hepaticus bevorzugt als Modellorganismus zur Untersuchung der immunologischen Ursachen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Tiermodell eingesetzt. Ebenfalls kann eine Infektion mit H. hepaticus in suszeptiblen Mäusestämmen (z.B. Balb/c, C3H/An) zu Entzündungen der Leber und Gallengänge führen, welche sich bis zu einer Hepatitis und Leberkarzinomen ausweiten können. In den meisten Studien wurde H. hepaticus bisher aber hauptsächlich als Auslöser dieser Erkrankungen eingesetzt, während die bakterielle Seite kaum betrachtet wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in einer Kooperation mit MWG Biotech, GeneData und dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) die Gesamtgenomsequenz des H. hepaticus Referenzstammes ATCC 51449 bestimmt und annotiert. Das Genom hat eine Größe von 1.799.146 bp und kodiert für 1.875 Proteine. Die globale Ähnlichkeit des Genoms von H. hepaticus ist etwa gleich groß zu den sequenzierten Genomen von H. pylori und C. jejuni. Es fehlen H. hepaticus aber die meisten Virulenzfaktoren von H. pylori wie Adhäsine (SabA, BabA, AlpA), VacA und die meisten Proteine der cag-Pathogenitätsinsel, während Homologe zu Pathogenitätsfaktoren von C. jejuni wie CDT und Peb1 vorhanden sind. Das Genom von H. hepaticus enthält neben vielen kleineren genomischen Inseln eine Genominsel mit einer Größe von 71 kb, welche als HHGI1 benannt wurde. Sie kodiert mutmaßlich für ein TypIV-Sekretionssystem und enthält weitere Virulenzfaktoren. In Microarray- basierten Gesamtgenomvergleichen konnte gezeigt werden, dass die Insel in sieben von 13 untersuchten Stämmen großteils oder komplett fehlt. Während Mäuse, aus denen HHGI1-positive Stämme isoliert wurden, pathologische Veränderungen der Leber aufwiesen, wies keine von den Mäusen, aus denen HHGI1-negative Stämme isoliert wurden, Auffälligkeiten in der Leber oder dem Gallentrakt auf. In einem Tiermodell wurde in Kooperation mit dem MIT gezeigt, dass zwei Insel-negative Stämme zu einer geringeren Besiedlung und einer schwächeren Entzündung der Leber als der Insel-positive Referenzstamm ATCC 51449 führen. Durch die Genomvergleiche konnte auch gezeigt werden, dass verschiedene H. hepaticus-Stämme trotz einer niedrigen Sequenzvariabilität eine hohe Variation des Genomgehalts aufweisen und dass neben der HHGI1-Insel weitere kleinere Inseln in einzelnen Stämmen fehlen. Es wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals verschiedene isogene Mutanten von H. hepaticus in der HHGI-1-Insel hergestellt, die in vitro eine verringerte Immunstimulation in Makrophagen zeigten. Der Mechanismus dieser Immunsuppression konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden, sie werden jedoch derzeit in Mausmodellen weiter auf ihre krankheitsauslösenden Eigenschaften untersucht. Da bisher keine gut charakterisierten Zellkulturmodelle für die in vitro-Untersuchung von H. hepaticus vorlagen, wurden solche im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Dazu wurden die intestinale murine epitheliale Zelllinie m-ICcl2, welche das primäre Habitat von H. hepaticus (Krypten im Dünndarm) imitiert, die murine Hepatozytenzelllinie NCTC Klon 1469, welche ein mögliches sekundäres Habitat (Lebercanaliculi) imitiert und die murine Makrophagenzelllinie J774 benutzt. Während J774 und NCTC Klon 1469 durch die meisten Liganden für Mustererkennungsrezeptoren stimuliert werden konnten, reagierten m-ICcl2- Zellen substantiell nur auf den TLR4-Liganden E. coli-LPS. Dementsprechend induzierte H. hepaticus in J774 und NCTC Klon 1469 eine starke proinflammatorische Antwort, während m-ICcl2 trotz guter Adhärenz nur schwach von H. hepaticus stimuliert wurde. Es wurde gezeigt, dass LPS und Flagelline von H. hepaticus nur eine geringe immunstimulatorische Wirkung besitzen, während Lipoproteine und vermutlich auch Peptidoglykan die wichtigsten PAMPs von H. hepaticus darstellen. Durch die Analyse der durch H. hepaticus ausgelösten globalen Genregulation in J774 und NCTC Klon 1469 wurde nachgewiesen, dass H. hepaticus nicht primär über NF-κB, sondern über MAP-Kinasen eine proinflammatorische Antwort auslöst. Außerdem wurde gezeigt, dass H. hepaticus untypisch für extrazelluläre Bakterien eher eine Wirtsantwort auslöst, welche der durch intrazelluläre Bakterien ähnelt. In diesen Modellen führten HHGI1-negative Stämme oder Mutanten der HHGI1-Insel zu einer leicht verringerten proinflammatorischen Antwort. Dies spiegelte sich auch in der transkriptionellen Regulation von Schlüsselfaktoren der angeborenen Immunantwort wie TLR2, IL-12, NOD2 oder Tollip wieder. In m-ICcl2-Zellen führte eine Koinkubation mit lebenden H. hepaticus oder Lysaten zu einer verringerten durch E. coli-LPS ausgelösten Induktion von MIP-2. Darauf basierend wurde gezeigt, dass LPS von H. hepaticus einen wesentlichen Faktor für diese Inhibierung der proinflammatorischen Antwort darstellt, nicht jedoch die HHGI-1-Insel oder andere vermutete Virulenzfaktoren. Zumindest auf mRNA-Ebene wurde durch H. hepaticus auch die Induktion anderer Cytokine wie TNF-α oder MIP-1α gehemmt. Eine primäre Koinkubation von m-ICcl2 mit E. coli-LPS führte zu einer Toleranzinduktion gegenüber einer zweiten Stimulation. Diese Toleranzinduktion wurde durch eine Inkubation mit H. hepaticus ebenfalls gehemmt. Die Hemmung der proinflammatorischen Antwort durch H. hepaticus-LPS konnte auch in NCTC Klon 1469 und unter serumfreien Bedingungen für die durch S. typhimurium- Flagellin induzierte IL-8 Sekretion in der humanen Kolonkarzinomzelllinie Caco2 nachgewiesen werden. Damit war diese Hemmung weder zellspezifisch noch spezifisch für die TLR4-abhängige Stimulation. Basierend auf dieser Arbeit wurde ein Modell für die Entstehung einer chronischen Entzündung im Intestinaltrakt entwickelt, welches Erklärungsansätze für die Entwicklung einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung im Menschen liefern könnte.
Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren.
The mold Fusarium is a ubiquitous fungus causing plant, animal and human infections. In humans, Fusarium spp. are the major cause of eye infections in patients wearing contact lenses or after local trauma. Systemic infections by Fusarium spp. mainly occur in immunosuppressed patients and can disseminate throughout the human body. Due to high levels of resistance to antifungals a fast identification of the causative agent is an urgent need. By using a probe-based real-time PCR assay specific for the genus Fusarium we analysed several different clinical specimens detecting Fusarium spp. commonly found in clinical samples in Germany. Also, a large collection of lung fluid samples of haematological patients was analysed (n = 243). In these, two samples (0.8%) were reproducibly positive, but only one could be confirmed by sequencing. For this case of probable invasive fungal disease (IFD) culture was positive for Fusarium species. Here we describe a rapid, probe-based real-time PCR assay to specifically detect DNA from a broad range of Fusarium species and its application to clinically relevant specimens.
Data on biomarker-assisted diagnosis of invasive aspergillosis (IA) in pediatric patients is scarce. Therefore, we conducted a cohort study over two years including 404 serum specimens of 26 pediatric patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloSCT). Sera were tested prospectively twice weekly for Aspergillus-specific DNA, galactomannan (GM), and retrospectively for (1→3)-β-D-glucan (BDG). Three probable IA and two possible invasive fungal disease (IFD) cases were identified using the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group (EORTC/MSGERC) 2019 consensus definitions. Sensitivity and specificity for diagnosis of probable IA and possible IFD was 80% (95% confidential interval (CI): 28–99%) and 55% (95% CI: 32–77%) for BDG, 40% (95% CI: 5–85%) and 100% (95% CI: 83–100%) for GM, and 60% (95% CI: 15–95%) and 95% (95% CI: 75–100%) for Aspergillus-specific real-time PCR. However, sensitivities have to be interpreted with great caution due to the limited number of IA cases. Interestingly, the low specificity of BDG was largely caused by false-positive BDG results that clustered around the date of alloSCT. The following strategies were able to increase BDG specificity: two consecutive positive BDG tests for diagnosis (specificity 80% (95% CI: 56–94%)); using an optimized cutoff value of 306 pg/mL (specificity 90% (95% CI: 68–99%)) and testing BDG only after the acute posttransplant phase. In summary, BDG can help to diagnose IA in pediatric alloSCT recipients. However, due to the poor specificity either an increased cutoff value should be utilized or BDG results should be confirmed by an alternative Aspergillus assay.
Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.
OatC ist die O-Acetyltransferase von Serogruppe C Meningokokken. Sie katalysiert die O-Acetylierung der Sialinsäurekapsel. Das Enzym konnte vor Beginn dieser Arbeit keiner bekannten Gruppe von Enzymen zugeordnet werden. Durch in vivo-Versuche und in vitro-Studien sollten weitere Erkenntnisse zu Lage und Struktur des aktiven Zentrums von OatC gewonnen werden. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen: 1. Es sollte eine Meningokokken-Mutante mit einer Deletion des oatC -Gens hergestellt werden. 2. Das oatC -Gen sollte schrittweise verkürzt und in trans auf dem pAP1His Vektor in die oatC-Deletionsmutante eingebracht werden. 3. Gerichtete Mutagenese von Histidinresten, Serin 286 und Aspartat 376 sollte Aussagen über die in vivo-Relevanz der Aminosäuren ermöglichen. Die Mutanten wurden im ELISA auf Ihren O-Acetylierungsstatus hin überprüft. Die oatC -Deletionsmutante war erwartungsgemäß negativ. Bereits die erste Verkürzung von OatC um 16 Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der O-Acetylierung, der Austausch der Aminosäuren Histidin 399, Serin 286 und Aspartat 376 durch gerichtete Mutagenese ebenfalls. Wir spekulieren, dass der Verlust des C-Terminus zu einer veränderten Proteinfaltung führt oder eine katalytische Funktion des Histidin 456 eliminiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass OatC der Gruppe der α/β-Hydrolasen zugeordnet werden kann (s. a. Bergfeld et al. 2009). Das katalytische Zentrum besteht aus Serin 286, Aspartat 376 und Histidin 399. Der Bereich um Histidin 456 beeinflusst die Funktion erheblich.
Neisseria meningitidis, Auslöser der Meningokokken-Meningitis und Sepsis, trägt auch heute noch zur hohen Kindersterblichkeit in Entwicklungsländern bei und sorgt, vor allem im afrikanischen Meningitis-Gürtel, immer wieder für Epidemien mit gravierenden Folgen für die Betroffenen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei an der Pathogenität von N. meningitidis beteiligte Proteine, der Transkriptionsregulator FarR und der Transportkanal HrpB, näher charakterisiert, um weitere Einblicke in die immer noch nicht vollständig entschlüsselte Pathogenese der Meningokokken-Meningitis zu erhalten. Das Neisseria adhesin A NadA ist Bestandteil der sich aktuell in der Entwicklung befindenden Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe B. Im dem bekapselten B-Stamm MC58 wurde gezeigt, dass nadA unter der negativen Kontrolle des Transkriptionsregulators FarR steht (Schielke et al., 2009). In den ebenfalls zur Gattung Neisseria gehörenden Neisseria gonorrhoeae (Ng) wurde bereits 2001 ein FarR-Homolog beschrieben (Shafer et al., 2001). NgFarR ist an der Resistenz gegenüber antimikrobiellen, langkettigen Fettsäuren beteiligt, indem es die Expression des FarABEffluxpumpen-Systems reguliert, welches eingedrungene Fettsäuren wieder nach extrazellulär befördert. Dagegen zeigten Palmitinsäure-Resistenztests, dass FarR nicht an der intrinsischen Fettsäure-Resistenz der Meningokokken beteiligt ist. Die Deletion und die Komplementierung von farR hatten weder in bekapselten noch in unbekapselten Meningokokken Einfluss auf das normale Wachstumsverhalten. Ein Western Blot- Nachweis des FarR-Proteins in der frühen, mittleren und späten exponentiellen Wachstumsphase von Wildtyp, Kapsel-Deletionsmutante und farR-Komplementante zeigte, dass die Menge an FarR im zeitlichen Verlauf kontinuierlich zunimmt und FarR damit Wachstumsphasen-abhängig exprimiert wird. Dabei scheint es einer posttranskriptionalen oder posttranslationalen Regulation zu unterliegen, da auch in dem farRkomplementierten Stamm unabhängig vom farR-Promotor eine entsprechende Hochregulation stattfindet. In Infektionsversuchen wurde die Interaktion zwischen Meningokokken und humanen polymorphkernigen Granulozyten untersucht. In den Infektionsassays wurde die farRDeletionsmutante innerhalb des dreistündigen Versuchsrahmens deutlich stärker durch die Granulozyten abgetötet als der Serogruppe B-Wildtyp. Als Mitglied der in Bakterien und Archaeen weit verbreiteten Familie der MarR-Transkriptionsregulatoren (Multiple antibiotic resistance Regulator, MarR) bindet FarR mit hoher Wahrscheinlichkeit auch als Homodimer an seine Bindesequenz auf der DNA. FarR erkennt eine 16 bp lange, palindromische Sequenz in der Promotorregion von nadA (NMB1994), wodurch die nadA-Expression verhindert wird. Außerdem erkennt FarR eine ähnliche Bindesequenz im Promotorbereich von farAB (NMB0318/0319), wobei es aber keinen regulatorischen Einfluss ausübt. Mit einer aus diesen beiden Bindestellen berechneten minimalen Bindesequenz wurde im Genom von MC58 weitere mögliche Bindepartner detektiert. Eine Auswahl dieser möglichen Bindestellen wurde in Electrophoretic Mobility Shift Assays auf eine direkte Interaktion mit dem FarR-Protein hin untersucht, wobei sich allerdings keine direkte Bindung nachweisen ließ. Diese Ergebnisse darauf hin, dass der Transkriptionsregulator FarR hoch spezifisch bestimmte DNA-Bindesequenzen erkennt und die entsprechenden Gene reguliert. In der Promotorregion des TpsB-Proteins HrpB wurde in den sequenzierten Referenzstämmen Z2491, MC58, FAM18 und α14 eine mit der minimalen FarR-Bindesequenz kompatible Sequenz gefunden. In Electrophoretic Mobility Shift Assays konnte allerdings gezeigt werden, dass FarR nicht direkt daran bindet. Um das Transport-Protein HrpB näher zu charakterisieren, wurde das entsprechende Gen in 22 N. meningitidis-Isolaten sequenziert. Dabei zeigte sich, dass das Transportprotein hrpB in allen untersuchten invasiven und nicht-invasiven Stämmen vorhanden ist. Dieses äußerst konservierte Protein weist nur im seinem C-terminalen Bereich eine relativ variable Region auf, was vermutlich auf Rekombinationsereignisse zurückzuführen ist. Ein Alignment der Aminosäure-Sequenz des Serogruppe C-Stamms FAM18 mit der des homologen Bordetella pertussis TpsB-Proteins FhaC zeigte, dass die dreidimensionale Struktur des HrpB ebenfalls eine α-Helix, eine transmembranöse Domäne und variable extrazelluläre Loops enthält. Zusammengenommen erfüllt HrpB somit wichtige Bedingungen, um als Vakzine-Bestandteil in Betracht gezogen zu werden.
Non-aureus staphylococci (NAS) are ubiquitous bacteria in livestock-associated environments where they may act as reservoirs of antimicrobial resistance (AMR) genes for pathogens such as Staphylococcus aureus. Here, we tested whether housing conditions in pig farms could influence the overall AMR-NAS burden. Two hundred and forty porcine commensal and environmental NAS isolates from three different farm types (conventional, alternative, and organic) were tested for phenotypic antimicrobial susceptibility and subjected to whole genome sequencing. Genomic data were analysed regarding species identity and AMR gene carriage. Seventeen different NAS species were identified across all farm types. In contrast to conventional farms, no AMR genes were detectable towards methicillin, aminoglycosides, and phenicols in organic farms. Additionally, AMR genes to macrolides and tetracycline were rare among NAS in organic farms, while such genes were common in conventional husbandries. No differences in AMR detection existed between farm types regarding fosfomycin, lincosamides, fusidic acid, and heavy metal resistance gene presence. The combined data show that husbandry conditions influence the occurrence of resistant and multidrug-resistant bacteria in livestock, suggesting that changing husbandry practices may be an appropriate means of limiting the spread of AMR bacteria on farms.