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Genetic foundation of unrivaled survival strategies - Of water bears and carnivorous plants -
(2018)
All living organisms leverage mechanisms and response systems to optimize reproduction, defense, survival, and competitiveness within their natural habitat. Evolutionary theories such as the universal adaptive strategy theory (UAST) developed by John Philip Grime (1979) attempt to describe how these systems are limited by the trade-off between growth, maintenance and regeneration; known as the universal three-way trade-off. Grime introduced three adaptive strategies that enable organisms to coop with either high or low intensities of stress (e.g., nutrient deficiency) and environmental disturbance (e.g., seasons). The competitor is able to outcompete other organisms by efficiently tapping available resources in environments of low intensity stress and disturbance (e.g., rapid growers). A ruderal specism is able to rapidly complete the life cycle especially during high intensity disturbance and low intensity stress (e.g., annual colonizers). The stress tolerator is able to respond to high intensity stress with physiological variability but is limited to low intensity disturbance environments. Carnivorous plants like D. muscipula and tardigrades like M. tardigradum are two extreme examples for such stress tolerators. D. muscipula traps insects in its native habitat (green swamps in North and South Carolina) with specialized leaves and thereby is able to tolerate nutrient deficient soils. M. tardigradum on the other side, is able to escape desiccation of its terrestrial habitat like mosses and lichens which are usually covered by a water film but regularly fall completely dry. The stress tolerance of the two species is the central study object of this thesis. In both cases, high througput sequencing data and methods were used to test for transcriptomic (D. muscipula) or genomic adaptations (M. tardigradum) which underly the stress tolerance. A new hardware resource including computing cluster and high availability storage system was implemented in the first months of the thesis work to effectively analyze the vast amounts of data generated for both projects. Side-by-side, the data management resource TBro [14] was established together with students to intuitively approach complex biological questions and enhance collaboration between researchers of several different disciplines. Thereafter, the unique trapping abilities of D. muscipula were studied using a whole transcriptome approach. Prey-dependent changes of the transcriptional landscape as well as individual tissue-specific aspects of the whole plant were studied. The analysis revealed that non-stimulated traps of D. muscipula exhibit the expected hallmarks of any typical leaf but operates evolutionary conserved stress-related pathways including defense-associated responses when digesting prey. An integrative approach, combining proteome and transcriptome data further enabled the detailed description of the digestive cocktail and the potential nutrient uptake machinery of the plant. The published work [25] as well as a accompanying video material (https://www.eurekalert.org/pub_releases/ 2016-05/cshl-fgr042816.php; Video credit: Sönke Scherzer) gained global press coverage and successfully underlined the advantages of D. muscipula as experimental system to understand the carnivorous syndrome. The analysis of the peculiar stress tolerance of M. tardigradum during cryptobiosis was carried out using a genomic approach. First, the genome size of M. tardigradum was estimated, the genome sequenced, assembled and annotated. The first draft of M. tardigradum and the workflow used to established its genome draft helped scrutinizing the first ever released tardigrade genome (Hypsibius dujardini) and demonstrated how (bacterial) contamination can influence whole genome analysis efforts [27]. Finally, the
M. tardigradum genome was compared to two other tardigrades and all species present in the current release of the Ensembl Metazoa database. The analysis revealed that tardigrade genomes are not that different from those of other Ecdysozoa. The availability of the three genomes allowed the delineation of their phylogenetic position within the Ecdysozoa and placed them as sister taxa to the nematodes. Thereby, the comparative analysis helped to identify evolutionary trends within this metazoan lineage. Surprisingly, the analysis did not reveal general mechanisms (shared by all available tardigrade genomes) behind the arguably most peculiar feature of tardigrades; their enormous stress tolerance. The lack of molecular evidence for individual tardigrade species (e.g., gene expression data for M. tardigradum) and the non-existence of a universal experimental framework which enables hypothesis testing withing the whole phylum Tardigrada, made it nearly impossible to link footprints of genomic adaptations to the unusual physiological capabilities. Nevertheless, the (comparative) genomic framework established during this project will help to understand how evolution tinkered, rewired and modified existing molecular systems to shape the remarkable phenotypic features of tardigrades.
Viral infections induce a significant impact on various functional categories of biological processes in the host. The understanding of this complex modification of the infected host immune system requires a global and detailed overview on the infection process. Therefore it is essential to apply a powerful approach which identifies the involved components conferring the capacity to recognize and respond to specific pathogens, which in general are defeated in so-called compatible virus-plant infections. Comparative and integrated systems biology of plant-virus interaction progression may open a novel framework for a systemic picture on the modulation of plant immunity during different infections and understanding pathogenesis mechanisms. In this thesis these approaches were applied to study plant-virus infections during two main viral pathogens of cassava: Cassava brown streak virus and African cassava mosaic virus.
Here, the infection process was reconstructed by a combination of omics data-based analyses and metabolic network modelling, to understand the major metabolic pathways and elements underlying viral infection responses in different time series, as well as the flux activity distribution to gain more insights into the metabolic flow and mechanism of regulation; this resulted in simultaneous investigations on a broad spectrum of changes in several levels including the gene expression, primary metabolites, and enzymatic flux associated with the characteristic disease development process induced in Nicotiana benthamiana plants due to infection with CBSV or ACMV.
Firstly, the transcriptome dynamics of the infected plant was analysed by using mRNA-sequencing, in order to investigate the differential expression profile according the symptom developmental stage. The spreading pattern and different levels of biological functions of these genes were analysed associated with the infection stage and virus entity. A next step was the Real-Time expression modification of selected key pathway genes followed by their linear regression model. Subsequently, the functional loss of regulatory genes which trigger R-mediated resistance was observed. Substantial differences were observed between infected mutants/transgenic lines and wild-types and characterized in detail. In addition, we detected a massive localized accumulation of ROS and quantified the scavenging genes expression in the infected wild-type plants relative to mock infected controls.
Moreover, we found coordinated regulated metabolites in response to viral infection measured by using LC-MS/MS and HPLC-UV-MS. This includes the profile of the phytohormones, carbohydrates, amino acids, and phenolics at different time points of infection with the RNA and DNA viruses. This was influenced by differentially regulated enzymatic activities along the salicylate, jasmonate, and chorismate biosynthesis, glycolysis, tricarboxylic acid cycle, and pentose phosphate pathways, as well as photosynthesis, photorespiration, transporting, amino acid and fatty acid biosynthesis. We calculated the flux redistribution considering a gradient of modulation for enzymes along different infection stages, ranging from pre-symptoms towards infection stability.
Collectively, our reverse-engineering study consisting of the generation of experimental data and modelling supports the general insight with comparative and integrated systems biology into a model plant-virus interaction system. We refine the cross talk between transcriptome modification, metabolites modulation and enzymatic flux redistribution during compatible infection progression. The results highlight the global alteration in a susceptible host, correlation between symptoms severity and the alteration level. In addition we identify the detailed corresponding general and specific responses to RNA and DNA viruses at different stages of infection. To sum up, all the findings in this study strengthen the necessity of considering the timing of treatment, which greatly affects plant defence against viral infection, and might result in more efficient or combined targeting of a wider range of plant pathogens.
Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.
Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt.