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- whole genome sequence (1)
- whole-blood infection assay (1)
- whole-blood model (1)
- zerebrale Persistenz (1)
- zinc cluster transcription factor (1)
- zinc limitation (1)
- äußere Membranvesikel (1)
- γ-glutamyl cycle (1)
Institute
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (228) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Broad Institute, USA (1)
- Department Pharmazie - Zentrum für Pharmaforschung, Ludwig-Maximilians-Universität München (1)
- Department of Hematology and Oncology, Sana Hospital Hof, Hof, Germany (1)
- Department of Laboratory Medicine and Medicine Huddinge, Karolinska Institutet and University Hospital, Stockholm, Sweden (1)
- Department of Medicine A, University Hospital of Münster, Münster, Germany (1)
- Instituto de Higiene, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay (1)
- Instituto de Hygiene Montevideo, Uruguay (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (1)
- Krankenhaushygiene und Antimicrobial Stewardship (Universitätsklinikum) (1)
- Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Hans-Knöll-Institut (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 2016 FGR 0053 (1)
- 278864 (1)
- 847507 (1)
Delayed natural killer (NK) cell reconstitution after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) is associated with a higher risk of developing invasive aspergillosis. The interaction of NK cells with the human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is mediated by the fungal recognition receptor CD56, which is relocated to the fungal interface after contact. Blocking of CD56 signaling inhibits the fungal mediated chemokine secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES and reduces cell activation, indicating a functional role of CD56 in fungal recognition. We collected peripheral blood from recipients of an allograft at defined time points after alloSCT (day 60, 90, 120, 180). NK cells were isolated, directly challenged with live A. fumigatus germ tubes, and cell function was analyzed and compared to healthy age and gender-matched individuals. After alloSCT, NK cells displayed a higher percentage of CD56\(^{bright}\)CD16\(^{dim}\) cells throughout the time of blood collection. However, CD56 binding and relocalization to the fungal contact side were decreased. We were able to correlate this deficiency to the administration of corticosteroid therapy that further negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES. As a consequence, the treatment of healthy NK cells ex vivo with corticosteroids abrogated chemokine secretion measured by multiplex immunoassay. Furthermore, we analyzed NK cells regarding their actin cytoskeleton by Structured Illumination Microscopy (SIM) and flow cytometry and demonstrate an actin dysfunction of NK cells shown by reduced F-actin content after fungal co-cultivation early after alloSCT. This dysfunction remains until 180 days post-alloSCT, concluding that further actin-dependent cellular processes may be negatively influenced after alloSCT. To investigate the molecular pathomechansism, we compared CD56 receptor mobility on the plasma membrane of healthy and alloSCT primary NK cells by single-molecule tracking. The results were very robust and reproducible between tested conditions which point to a different molecular mechanism and emphasize the importance of proper CD56 mobility.
Echinocandin antifungals represent one of the most important drug classes for the treatment of invasive fungal infections. The mode of action of the echinocandins relies on inhibition of the β-1,3-glucan synthase, an enzyme essentially required for the synthesis of the major fungal cell wall carbohydrate β-1,3-glucan. Depending on the species, echinocandins may exert fungicidal or fungistatic activity. Apparently independent of this differential activity, a surprising in vitro phenomenon called the “paradoxical effect” can be observed. The paradoxical effect is characterized by the ability of certain fungal isolates to reconstitute growth in the presence of higher echinocandin concentrations, while being fully susceptible at lower concentrations. The nature of the paradoxical effect is not fully understood and has been the focus of multiple studies in the last two decades. Here we concisely review the current literature and propose an updated model for the paradoxical effect, taking into account recent advances in the field.
Accumulating evidences have assigned a central role to parasite-derived proteins in immunomodulation. Here, we report on the proteomic identification and characterization of immunomodulatory excretory-secretory (ES) products from the metacestode larva (tetrathyridium) of the tapeworm Mesocestoides corti (syn. M. vogae). We demonstrate that ES products but not larval homogenates inhibit the stimuli-driven release of the pro-inflammatory, Th1-inducing cytokine IL-12p70 by murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Within the ES fraction, we biochemically narrowed down the immunosuppressive activity to glycoproteins since active components were lipid-free, but sensitive to heat- and carbohydrate-treatment. Finally, using bioassay-guided chromatographic analyses assisted by comparative proteomics of active and inactive fractions of the ES products, we defined a comprehensive list of candidate proteins released by M. corti tetrathyridia as potential suppressors of DC functions. Our study provides a comprehensive library of somatic and ES products and highlight some candidate parasite factors that might drive the subversion of DC functions to facilitate the persistence of M. corti tetrathyridia in their hosts.
Alveolar echinococcosis (AE) of human being caused by Echinococcus multilocularis is a rare but important zoonosis especially in tempered zones of middle Europe and Northern America with endemic character in many countries. Due to the long incubation period, various clinical manifestations, critical prognosis, and outcome AE presents a serious and severe disease. The primary focus of infection is usually the liver. Although secondary affection of visceral organs is possible extrahepatic AE is highly uncommon. Moreover, the involvement of bone and muscle presents with an even lower incidence. In the literature numerous cases on hepatic AE have been reported. However, extrahepatic AE involving bones and/or muscles was described very rarely. We report a case of an 80-year-old man with primary extrahepatic alveolar Echinococcosis of the lumbar spine and the psoas muscle. The etiology, diagnosis, differential diagnoses, treatment options and outcome of this rare disease are discussed in context with the current literature.
Background
Haemophilus influenzae (Hi) is a Gram-negative bacterium that may cause sepsis or meningitis, treatment of which mainly includes β-lactam antibiotics. Since 2019 EUCAST breakpoints for piperacillin/tazobactam have been available. Little is known about the prevalence and mechanisms of piperacillin/tazobactam resistance in Hi.
Objectives
To provide reliable prevalence data for piperacillin/tazobactam resistance in Hi in Germany, to evaluate different antibiotic susceptibility testing methods and to examine possible resistance mechanisms.
Methods
According to EUCAST breakpoints, the MIC for piperacillin/tazobactam resistance is >0.25 mg/L. All invasive Hi in Germany from 2019 were examined by gradient agar diffusion (GAD) for piperacillin/tazobactam susceptibility. Piperacillin/tazobactam broth microdilution (BMD), piperacillin GAD on tazobactam-containing agar [piperacillin GAD on Mueller–Hinton agar with horse blood (MH-F)/tazobactam) and piperacillin/tazobactam agar dilution (AD) were used for confirmation. Phenotypic testing was complemented by ftsI sequencing.
Results
Piperacillin/tazobactam GAD resulted in 2.9% (21/726) resistant Hi. BMD did not confirm piperacillin/tazobactam resistance. Two strains were found resistant by AD, of which one was also resistant using piperacillin GAD on MH-F/tazobactam. Overall, we found two strains with a piperacillin/tazobactam MIC >0.25 mg/L in at least two different tests (0.3%). Both were β-lactamase-producing amoxicillin/clavulanate-resistant with PBP3 mutations characterized as group III-like+. Relevant PBP3 mutations occurred in six strains without phenotypic piperacillin/tazobactam resistance. These mutations suggest a reduced efficacy of β-lactam antibiotics in these isolates.
Conclusions
Piperacillin/tazobactam resistance prevalence in invasive Hi is low in Germany. Reduced susceptibility was correlated with PBP3 mutations, in particular with group III mutations.
The Indigenous tribe called the Wiwa lives retracted in the Sierra Nevada de Santa Marta, Colombia. Little is known about their health status and whether the health care system in place covers their needs. In 2017 and 2018, a permanent physician was in charge for the Wiwa. Diseases and complaints were registered, ranked, and classified with the ICD-10 coding. Datasets from the Indigenous health care provider Dusakawi, collected from local health points and health brigades travelling sporadically into the fields for short visits, were compared. Furthermore, a list of provided medication was evaluated regarding the recorded needs. The most common complaints found were respiratory, infectious and parasitic, and digestive diseases. The top ten diagnoses collected in the health points and in the health brigade datasets were similar, although with a different ranking. The available medication showed a basic coverage only, with a critical lack of treatment for many severe, chronic, and life-threatening diseases. Most of the detected diseases in the Indigenous population are avoidable by an improvement in health care access, an expansion of the provided medication, and an increase in knowledge, hygiene, and life standards.
Background
Published models predicting nasal colonization with Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among hospital admissions predominantly focus on separation of carriers from non-carriers and are frequently evaluated using measures of discrimination. In contrast, accurate estimation of carriage probability, which may inform decisions regarding treatment and infection control, is rarely assessed. Furthermore, no published models adjust for MRSA prevalence.
Methods
Using logistic regression, a scoring system (values from 0 to 200) predicting nasal carriage of MRSA was created using a derivation cohort of 3091 individuals admitted to a European tertiary referral center between July 2007 and March 2008. The expected positive predictive value of a rapid diagnostic test (GeneOhm, Becton & Dickinson Co.) was modeled using non-linear regression according to score. Models were validated on a second cohort from the same hospital consisting of 2043 patients admitted between August 2008 and January 2012. Our suggested correction score for prevalence was proportional to the log-transformed odds ratio between cohorts. Calibration before and after correction, i.e. accurate classification into arbitrary strata, was assessed with the Hosmer-Lemeshow-Test.
Results
Treating culture as reference, the rapid diagnostic test had positive predictive values of 64.8% and 54.0% in derivation and internal validation corhorts with prevalences of 2.3% and 1.7%, respectively. In addition to low prevalence, low positive predictive values were due to high proportion (> 66%) of mecA-negative Staphylococcus aureus among false positive results. Age, nursing home residence, admission through the medical emergency department, and ICD-10-GM admission diagnoses starting with “A” or “J” were associated with MRSA carriage and were thus included in the scoring system, which showed good calibration in predicting probability of carriage and the rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. Calibration for both probability of carriage and expected positive predictive value in the internal validation cohort was improved by applying the correction score.
Conclusions
Given a set of patient parameters, the presented models accurately predict a) probability of nasal carriage of MRSA and b) a rapid diagnostic test’s expected positive predictive value. While the former can inform decisions regarding empiric antibiotic treatment and infection control, the latter can influence choice of screening method.
BACKGROUND:
Campylobacteriosis, a zoonotic bacterial disease observed world-wide, is becoming the most commonly recognized cause of bacterial gastroenteritis in humans. This study was done to determine the prevalence and determinants of Campylobacter infection among under-fives with acute watery diarrhea in Mwanza City, Tanzania.
METHOD:
This cross-sectional hospital-based study was conducted at Bugando Medical Centre (BMC) and Sekou Toure Hospital in Mwanza City. All inpatients and outpatients under-fives who met the inclusion criteria from October 2012 to April 2013 were enrolled in the study. Demographic and clinical data were obtained using standardized data collection tools. Stool samples were collected for gram staining and culture for Campylobacter spp. on Preston selective agar media. In addition, blood slides for malaria and HIV tests were done to all patients.
RESULTS:
A total of 300 children were enrolled with a median age of 12 [interquartile range, 8-19] months. Of these, 169 (56.5%) were from BMC and 131 (43.7%) from Sekou-Toure hospital. One hundred and seventy (56.7%) of the participating children were male. Of 300 under-fives with acute watery diarrhea, 29 patients (9.7%) were found to have Campylobacter infection. A significant higher number of children with Campylobacter infection were found in Sekou Toure hospital compared to BMC [16.0% (21/29) versus 4.7% (8/29), p = 0.002)]. Age above 2 years was independently found to predict campylobacter infection (OR: 2.9, 95% CI 1.1-7.7, p = 0.0037). Of 30 patients with a positive blood slide for Plasmodium falciparum, 20.0% were also positive for Campylobacter infection (OR: 3.9, 95% CI 1.2-10.1, p = 0.021).
CONCLUSION:
Campylobacter infection shows a comparatively low prevalence in under-fives with acute watery diarrhea in Mwanza city and is independently associated with positive slides for malaria and an age above 2 years. Further studies are needed to type the most prevalent Campylobacter species and to determine their antibiotic susceptibility pattern.
Introduction: Although there has been a worldwide emergence and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), little is known about the molecular epidemiology of MRSA in Tanzania.
Methodology: In this study, we characterized MRSA strains isolated from clinical specimens at the Bugando Medical Centre, Tanzania, between January and December 2008. Of 160 S. aureus isolates from 600 clinical specimens, 24 (15%) were found to be MRSA. Besides molecular screening for the Panton Valentine leukocidin (PVL) genes by PCR, MRSA strains were further characterized by Multi-Locus Sequence Typing (MLST) and spa typing.
Results: Despite considerable genetic diversity, the spa types t690 (29.1%) and t7231 (41.6%), as well as the sequence types (ST) 88 (54.2%) and 1797 (29.1%), were dominant among clinical isolates. The PVL genes were detected in 4 isolates; of these, 3 were found in ST 88 and one in ST1820. Resistance to erythromycin, clindamicin, gentamicin, tetracycline and co-trimoxazole was found in 45.8%, 62.5%, 41.6%, 45.8% and 50% of the strains, respectively.
Conclusion: We present the first thorough typing of MRSA at a Tanzanian hospital. Despite considerable genetic diversity, ST88 was dominant among clinical isolates at the Bugando Medical Centre. Active and standardized surveillance of nosocomial MRSA infection should be conducted in the future to analyse the infection and transmission rates and implement effective control measures.
Bloodstream infections by the human-pathogenic fungi Candida albicans and Candida glabrata increasingly occur in hospitalized patients and are associated with high mortality rates. The early immune response against these fungi in human blood comprises a concerted action of humoral and cellular components of the innate immune system. Upon entering the blood, the majority of fungal cells will be eliminated by innate immune cells, i.e., neutrophils and monocytes. However, recent studies identified a population of fungal cells that can evade the immune response and thereby may disseminate and cause organ dissemination, which is frequently observed during candidemia. In this study, we investigate the so far unresolved mechanism of fungal immune evasion in human whole blood by testing hypotheses with the help of mathematical modeling. We use a previously established state-based virtual infection model for whole-blood infection with C. albicans to quantify the immune response and identified the fungal immune-evasion mechanism. While this process was assumed to be spontaneous in the previous model, we now hypothesize that the immune-evasion process is mediated by host factors and incorporate such a mechanism in the model. In particular, we propose, based on previous studies that the fungal immune-evasion mechanism could possibly arise through modification of the fungal surface by as of yet unknown proteins that are assumed to be secreted by activated neutrophils. To validate or reject any of the immune-evasion mechanisms, we compared the simulation of both immune-evasion models for different infection scenarios, i.e., infection of whole blood with either C. albicans or C. glabrata under non-neutropenic and neutropenic conditions. We found that under non-neutropenic conditions, both immune-evasion models fit the experimental data from whole-blood infection with C. albicans and C. glabrata. However, differences between the immune-evasion models could be observed for the infection outcome under neutropenic conditions with respect to the distribution of fungal cells across the immune cells. Based on these predictions, we suggested specific experimental studies that might allow for the validation or rejection of the proposed immune-evasion mechanism.
Introduction.
Tropheryma whipplei is the causative agent of Whipple’s disease. Gastrointestinal and lymphatic tissues are affected in the majority of cases, resulting in diarrhoea, malabsorption and fever. Here, we report a rare case of ocular manifestation in a patient lacking the typical Whipple symptoms.
Case presentation.
A 74-year-old Caucasian female presented with blurred vision in the right eye over a period of 1–2 months, accompanied by stinging pain and conjunctival hyperaemia for the last 2 days. Upon admission, visual acuity was hand motion in the affected eye. Ophthalmological examination showed typical signs of intraocular inflammation. Diagnostic and therapeutic pars plana vitrectomy including vitreous biopsy and intravitreal instillation of vancomycin and amikacin was performed within hours of initial presentation. Both microscopic analysis and microbial cultures of the vitreous biopsy remained negative for bacteria and fungi. The postoperative antibiotic regime included intravenous administration of ceftriaxone in combination with topical tobramycin and ofloxacin. Due to the empirical therapy the inflammation ceased and the patient was discharged after 5 days with cefpodoxime orally and local antibiotic and steroidal therapy. Meanwhile, the vitreous body had undergone testing by PCR for the eubacterial 16S rRNA gene, which was found to be positive. Analysis of the PCR product revealed a specific sequence of T. whipplei.
Conclusion.
In our patient, endophthalmitis was the first and only symptom of Morbus Whipple, while most patients with Whipple’s disease suffer from severe gastrointestinal symptoms. 16S rDNA PCR should be considered for any intraocular infection when microscopy and standard culture methods remain negative.
Meningokokken sind nach wie vor eine wichtige Ursache für Gehirnhautentzündungen und Sepsen weltweit, vor allem bei Kindern und Jugendlichen. Weil viele Pathomechanismen dieses Erregers bislang noch unvollständig verstanden sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit populationsbiologische und pathogenetische Aspekte von Neisseria meningitidis untersucht. Die Kapsel ist der hauptsächliche Pathogenitätsfaktor von Meningokokken und wichtig für die Besiedelung von neuen Wirten. Isolate von symptomfreien Trägern sind allerdings häufig unbekapselt. Um Ursachen oder Mechanismen für den Verlust der Kapselexpression aufzudecken, wurden insgesamt 166 Isolate der Bayerischen Meningokokkenträgerstudie untersucht. Alle Isolate besaßen sämtliche zur Kapselsynthese notwendigen Gene, exprimierten aber keine Kapsel. Bei 39 Isolaten fanden sich Längenvariationen in homopolymeren Sequenzen (slipped strand mispairing, SSM) in den Genen siaA und siaD. 46 Isolate enthielten Insertionselemente (IS1301, IS1016 und IS1106) in den Genen der Kapselsynthese. Irreversible Mutationen (Deletionen, Insertionen, Basensubstitutionen) wurden bei 47 Isolaten gefunden. Veränderungen der Promotorregion schienen keine Rolle zu spielen. Es wurden bei insgesamt sechs Isolaten zwei nicht-synonyme Mutationen in unmittelbarer Nähe zum putativen aktiven Zentrum der UDP-N- Acetylglukosamin-2-Epimerase entdeckt, die einen Verlust der Kapselsynthese erklären könnten. Insgesamt wurden keine Akkumulationen von Mutationen in defekten Genen gefunden und es gab auch keine Korrelationen zwischen den verschieden Ursachen und bestimmten klonalen Linien. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der zur Blockierung der Kapselexpression führenden Ereignisse erst im aktuellen Wirt aufgetreten sind und dass zumindest bei bestimmten klonalen Linien die Verbreitung von der Expression einer Kapsel abhängig ist. Viele pathogene Bakterien nutzen zur Infektion des Menschen die ubiquitär im Körper vorkommende Protease Plasmin. Dazu binden diese Plasmin oder das Proenzym Plasminogen. Auch Meningokokken interagieren mit Plasmin und Plasminogen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten drei Rezeptormoleküle für Plasminogen identifiziert werden. Die drei Proteine Enolase, DnaK und Peroxiredoxin konnten mit verschiedenen Methoden auf der Oberfläche der Erreger nachgewiesen werden. Die Bindung des Plasminogens ist bei Meningokokken ausschließlich über Lysinreste der Rezeptoren vermittelt, die C-terminalen Lysinreste der hier identifizierten Rezeptormoleküle spielen aber, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die Bindung von Plasminogen war durch rekombinante Rezeptorproteine konzentrationsabhängig inhibierbar. Plasminogen konnte von Meningokokken auch aus dem Serum rekrutiert werden. Gebundenes Plasminogen war mit uPA (Urokinase Plasminogen Aktivator) aktivierbar und physiologisch aktiv, was durch die Degradation von Fibrinogen nachgewiesen wurde. Das gebundene Plasmin wurde durch die Bakterien vor der Desaktivierung durch α2- Antiplasmin geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Meningokokken auch mit weiteren Faktoren des Fibrinolyse-Systems (uPA) interagieren. Sie rekrutierten uPA an ihre Oberfläche und gebundenes uPA war physiologisch aktiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestärken die These, dass Meningokokken die Faktoren des Fibrinolyse-Systems für ihre Pathogenese nutzen.
Acute bacterial meningitis is a life-threatening disease in humans. Discussed as entry sites for pathogens into the brain are the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). Although human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) constitute a well established human in vitro model for the blood-brain barrier, until now no reliable human system presenting the BCSFB has been developed. Here, we describe for the first time a functional human BCSFB model based on human choroid plexus papilloma cells (HIBCPP), which display typical hallmarks of a BCSFB as the expression of junctional proteins and formation of tight junctions, a high electrical resistance and minimal levels of macromolecular flux when grown on transwell filters. Importantly, when challenged with the zoonotic pathogen Streptococcus suis or the human pathogenic bacterium Neisseria meningitidis the HIBCPP show polar bacterial invasion only from the physiologically relevant basolateral side. Meningococcal invasion is attenuated by the presence of a capsule and translocated N. meningitidis form microcolonies on the apical side of HIBCPP opposite of sites of entry. As a functionally relevant human model of the BCSFB the HIBCPP offer a wide range of options for analysis of disease-related mechanisms at the choroid plexus epithelium, especially involving human pathogens.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte.
Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Stämme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich phänotypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfläche, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.
Background
Occupational exposure to live meningococci can potentially cause invasive meningococcal disease in laboratory staff. While, until recently, immunization with quadrivalent polysaccharide vaccine represented one cornerstone of protection, data on long-term persistence of antibodies in adults remain scarce.
Methods
We analyzed the relationship of antibody levels and time following quadrivalent polysaccharide vaccination (Mencevax® ACWY, GlaxoSmithKline) in a cross-sectional sample of 20 laboratory workers vaccinated at ages between 16.4 to 40.7 years from Germany. Sera were obtained 0.4 to 158.5 (median 35.3) months after vaccination. At the time of sampling, laboratory workers had been regularly exposed to meningococci for periods between 3.2 to 163.8 (median 41.2) months. Serum bactericidal assay (SBA) with rabbit complement and a microsphere-based flow analysis method were used to determine bactericidal titers and concentrations of IgG, respectively, against serogroups A, C, W135, and Y. Decay of antibodies was modeled using linear regression. Protective levels were defined as SBA titers ≥ 8.
Results
Half-lives of SBA titers against serogroups A, C, W135, and Y were estimated at 27.4, 21.9, 18.8, and 28.0 months, respectively. Average durations of protection were estimated at 183.9, 182.0, 114.6, and 216.4 months, respectively. Inter-individual variation was high; using lower margins of 95% prediction intervals, minimal durations of protection against serogroups A, C, W135 and Y were estimated at 33.5, 24.6, 0.0, and 55.1 months, respectively. The proportion of staff with protective SBA titers against W135 (65.0%) was significantly lower than proportions protected against A (95.0%), C (94.7%), and Y (95.0%). Consistently, geometric mean titer (97.0) and geometric mean concentration of IgG (2.1 μg/ml) was lowest against serogroup W135. SBA titers in a subset of individuals with incomplete protection rose to ≥ 128 (≥ 8 fold) after reimmunization with a quadrivalent glycoconjugate vaccine.
Conclusions
The average duration of protection following immunization with a quadrivalent polysaccharide vaccine in adults was ≥ 115 months regardless of serogroup. A substantial proportion (approximately 23% according to our decay model) of adult vaccinees may not retain protection against serogroup W135 for five years, the time suggested for reimmunization.
Anamnestic screening of symptoms and contact history is applied to identify coronavirus disease 2019 (COVID‐19) patients on admission. However, asymptomatic and presymptomatic patients remain undetected although the viral load may be high. In this retrospective cohort study, all hospitalized patients who received polymerase chain reaction (PCR) admission testing from March 26th until May 24th, 2020 were included. Data on COVID‐19‐specific symptoms and contact history to COVID‐19 cases were retrospectively extracted from patient files and from contact tracing notes. The compliance to the universal testing protocol was high with 90%. Out of 6940 tested patients, 27 new severe acute respiratory syndrome coronavirus‐2 infections (0.4%) were detected. Seven of those COVID‐19 cases (26% of all new cases) were asymptomatic and had no positive contact history, but were identified through a positive PCR test. The number needed to identify an asymptomatic patient was 425 in the first wave of the epidemic, 1218 in the low incidence phase. The specificity of the method was above 99.9%. Universal PCR testing was highly accepted by staff as demonstrated by high compliance. The costs to detect one asymptomatic case in future studies need to be traded off against the costs and damage caused by potential outbreaks of COVID‐19.
Pathogen-specific innate immune response patterns are distinctly affected by genetic diversity
(2023)
Innate immune responses vary by pathogen and host genetics. We analyze quantitative trait loci (eQTLs) and transcriptomes of monocytes from 215 individuals stimulated by fungal, Gram-negative or Gram-positive bacterial pathogens. We identify conserved monocyte responses to bacterial pathogens and a distinct antifungal response. These include 745 response eQTLs (reQTLs) and corresponding genes with pathogen-specific effects, which we find first in samples of male donors and subsequently confirm for selected reQTLs in females. reQTLs affect predominantly upregulated genes that regulate immune response via e.g., NOD-like, C-type lectin, Toll-like and complement receptor-signaling pathways. Hence, reQTLs provide a functional explanation for individual differences in innate response patterns. Our identified reQTLs are also associated with cancer, autoimmunity, inflammatory and infectious diseases as shown by external genome-wide association studies. Thus, reQTLs help to explain interindividual variation in immune response to infection and provide candidate genes for variants associated with a range of diseases.
The central nervous system (CNS) barriers are highly specialized cellular barriers that promote brain homeostasis while restricting pathogen and toxin entry. The primary cellular constituent regulating pathogen entry in most of these brain barriers is the brain endothelial cell (BEC) that exhibits properties that allow for tight regulation of CNS entry. Bacterial meningoencephalitis is a serious infection of the CNS and occurs when bacteria can cross specialized brain barriers and cause inflammation. Models have been developed to understand the bacterial – BEC interaction that lead to pathogen crossing into the CNS, however, these have been met with challenges due to these highly specialized BEC phenotypes. This perspective provides a brief overview and outlook of the in vivo and in vitro models currently being used to study bacterial brain penetration, and opinion on improved models for the future.
Neisseria meningitidis employs polysaccharides and outer membrane proteins to cope with human serum complement attack. To screen for factors influencing serum resistance, an assay was developed based on a colorimetric serum bactericidal assay. The screening used a genetically modified sequence type (ST)-41/44 clonal complex (cc) strain lacking LPS sialylation, polysaccharide capsule, the factor H binding protein (fHbp) and MutS, a protein of the DNA repair mechanism. After killing of >99.9% of the bacterial cells by serum treatment, the colorimetric assay was used to screen 1000 colonies, of which 35 showed enhanced serum resistance. Three mutant classes were identified. In the first class of mutants, enhanced expression of Opc was identified. Opc expression was associated with vitronectin binding and reduced membrane attack complex deposition confirming recent observations. Lipopolysaccharide (LPS) immunotype switch from immunotype L3 to L8/L1 by lgtA and lgtC phase variation represented the second class. Isogenic mutant analysis demonstrated that in ST-41/44 cc strains the L8/L1 immunotype was more serum resistant than the L3 immunotype. Consecutive analysis revealed that the immunotypes L8 and L1 were frequently observed in ST-41/44 cc isolates from both carriage and disease. Immunotype switch to L8/L1 is therefore suggested to contribute to the adaptive capacity of this meningococcal lineage. The third mutant class displayed a pilE allelic exchange associated with enhanced autoaggregation. The mutation of the C terminal hypervariable region D of PilE included a residue previously associated with increased pilus bundle formation. We suggest that autoaggregation reduced the surface area accessible to serum complement and protected from killing. The study highlights the ability of meningococci to adapt to environmental stress by phase variation and intrachromosomal recombination affecting subcapsular antigens.
The life-threatening diseases alveolar and cystic echinococcoses are caused by larvae of the tapeworms Echinococcus multilocularis and E. granulosus, respectively. In both cases, intermediate hosts, such as humans, are infected by oral uptake of oncosphere larvae, followed by asexual multiplication and almost unrestricted growth of the metacestode within host organs. Besides surgery, echinococcosis treatment relies on benzimidazole-based chemotherapy, directed against parasite beta-tubulin. However, since beta-tubulins are highly similar between cestodes and humans, benzimidazoles can only be applied at parasitostatic doses and are associated with adverse side effects. Mostly aiming at identifying alternative drug targets, the nuclear genome sequences of E. multilocularis and E. granulosus have recently been characterized, revealing a large number of druggable targets that are expressed by the metacestode. Furthermore, recent cell biological investigations have demonstrated that E. multilocularis employs pluripotent stem cells, called germinative cells, which are the only parasite cells capable of proliferation and which give rise to all differentiated cells. Hence, the germinative cells are the crucial cell type mediating proliferation of E. multilocularis, and most likely also E. granulosus, within host organs and should also be responsible for parasite recurrence upon discontinuation of chemotherapy. Interestingly, recent investigations have also indicated that germinative cells might be less sensitive to chemotherapy because they express a beta-tubulin isoform with limited affinity to benzimidazoles. In this article, we briefly review the recent findings concerning Echinococcus genomics and stem cell research and propose that future research into anti-echinococcosis drugs should also focus on the parasite’s stem cell population.
Background:
Atypical chemokine receptor 3 (ACKR3, synonym CXCR7) is increasingly considered relevant in neuroinflammatory conditions, in which its upregulation contributes to compromised endothelial barrier function and may ultimately allow inflammatory brain injury. While an impact of ACKR3 has been recognized in several neurological autoimmune diseases, neuroinflammation may also result from infectious agents, including Ureaplasma species (spp.). Although commonly regarded as commensals of the adult urogenital tract, Ureaplasma spp. may cause invasive infections in immunocompromised adults as well as in neonates and appear to be relevant pathogens in neonatal meningitis. Nonetheless, clinical and in vitro data on Ureaplasma-induced inflammation are scarce.
Methods:
We established a cell culture model of Ureaplasma meningitis, aiming to analyze ACKR3 variances as a possible pathomechanism in Ureaplasma-associated neuroinflammation. Non-immortalized human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) were exposed to bacterial lipopolysaccharide (LPS) or tumor necrosis factor-α (TNF-α), and native as well as LPS-primed HBMEC were cultured with Ureaplasma urealyticum serovar 8 (Uu8) and U. parvum serovar 3 (Up3). ACKR3 responses were assessed via qRT-PCR, RNA sequencing, flow cytometry, and immunocytochemistry.
Results:
LPS, TNF-α, and Ureaplasma spp. influenced ACKR3 expression in HBMEC. LPS and TNF-α significantly induced ACKR3 mRNA expression (p < 0.001, vs. control), whereas Ureaplasma spp. enhanced ACKR3 protein expression in HBMEC (p < 0.01, vs. broth control). Co-stimulation with LPS and either Ureaplasma isolate intensified ACKR3 responses (p < 0.05, vs. LPS). Furthermore, stimulation wielded a differential influence on the receptor’s ligands.
Conclusions:
We introduce an in vitro model of Ureaplasma meningitis. We are able to demonstrate a pro-inflammatory capacity of Ureaplasma spp. in native and, even more so, in LPS-primed HBMEC, underlining their clinical relevance particularly in a setting of co-infection. Furthermore, our data may indicate a novel role for ACKR3, with an impact not limited to auto-inflammatory diseases, but extending to infection-related neuroinflammation as well. AKCR3-induced blood-brain barrier breakdown might constitute a potential common pathomechanism.
Disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a hallmark event in the pathophysiology of bacterial meningitis. Several inflammatory mediators, such as tumor necrosis factor alpha (TNF-a), nitric oxide and matrix metalloproteinases (MMPs), contribute to this disruption. Here we show that infection of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) with Neisseria meningitidis induced an increase of permeability at prolonged time of infection. This was paralleled by an increase in MMP-8 activity in supernatants collected from infected cells. A detailed analysis revealed that MMP-8 was involved in the proteolytic cleavage of the tight junction protein occludin, resulting in its disappearance from the cell periphery and cleavage to a lower-sized 50-kDa protein in infected HBMEC. Abrogation of MMP-8 activity by specific inhibitors as well as transfection with MMP-8 siRNA abolished production of the cleavage fragment and occludin remained attached to the cell periphery. In addition, MMP-8 affected cell adherence to the underlying matrix. A similar temporal relationship was observed for MMP activity and cell detachment. Injury of the HBMEC monolayer suggested the requirement of direct cell contact because no detachment was observed when bacteria were placed above a transwell membrane or when bacterial supernatant was directly added to cells. Inhibition of MMP-8 partially prevented detachment of infected HBMEC and restored BBB permeability. Together, we established that MMP-8 activity plays a crucial role in disassembly of cell junction components and cell adhesion during meningococcal infection.
Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente Hämin- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. Während Hämin für aerobes Wachstum benötigt wird, ist NAD+ sowohl für aerobes, als auch für anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abhängiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme für die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorläufermolekülen, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabhängige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, können auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten können aber zusätzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgeklärt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8% Identität zu Escherichia coli pnuC und 43,6% Identität zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung geführt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7% Identität zu pnuCEc und 71,4% Identität zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteriämie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend für eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteriämie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, würde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein bestätigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgeklärt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandomänen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminosäuren (AS) toleriert, während die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur mäsig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifität von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifität wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren können, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten können, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters näher zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivität genauer charakterisiert. Die Suche nach möglichen Inhibitoren von PnuC führte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellulären Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert.
OatC ist die O-Acetyltransferase von Serogruppe C Meningokokken. Sie katalysiert die O-Acetylierung der Sialinsäurekapsel. Das Enzym konnte vor Beginn dieser Arbeit keiner bekannten Gruppe von Enzymen zugeordnet werden. Durch in vivo-Versuche und in vitro-Studien sollten weitere Erkenntnisse zu Lage und Struktur des aktiven Zentrums von OatC gewonnen werden. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen: 1. Es sollte eine Meningokokken-Mutante mit einer Deletion des oatC -Gens hergestellt werden. 2. Das oatC -Gen sollte schrittweise verkürzt und in trans auf dem pAP1His Vektor in die oatC-Deletionsmutante eingebracht werden. 3. Gerichtete Mutagenese von Histidinresten, Serin 286 und Aspartat 376 sollte Aussagen über die in vivo-Relevanz der Aminosäuren ermöglichen. Die Mutanten wurden im ELISA auf Ihren O-Acetylierungsstatus hin überprüft. Die oatC -Deletionsmutante war erwartungsgemäß negativ. Bereits die erste Verkürzung von OatC um 16 Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der O-Acetylierung, der Austausch der Aminosäuren Histidin 399, Serin 286 und Aspartat 376 durch gerichtete Mutagenese ebenfalls. Wir spekulieren, dass der Verlust des C-Terminus zu einer veränderten Proteinfaltung führt oder eine katalytische Funktion des Histidin 456 eliminiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass OatC der Gruppe der α/β-Hydrolasen zugeordnet werden kann (s. a. Bergfeld et al. 2009). Das katalytische Zentrum besteht aus Serin 286, Aspartat 376 und Histidin 399. Der Bereich um Histidin 456 beeinflusst die Funktion erheblich.
Die Zahl invasiver Pilzinfektionen ausgelöst durch C. glabrata steigt zunehmend und auch die Ausbildung multipler Resistenzen wird immer häufiger registriert. In dieser Arbeit wurden zwei klinische MDR-C. glabrata-Stämme systematisch analysiert, um den Ursprung der Mehrfachresistenz zu finden. Aufgefallen waren jene Isolate in vorhergehenden Untersuchungen von Aldejohann et. al., die 176 Stämme, die dem Referenzzentrum NRZ-Myk zugesandt wurden, auf ihr Resistenzverhalten gegen Echinocandine analysierten und auf FKS-Mutationen untersuchten. Die Isolate CG22 und CG56 zeigten ein Resistenzverhalten gegen Anidulafungin ohne eine FKS-Mutation aufzuweisen. In Mehrfachtestungen wurde das einheitliche Verhalten von CG56 in zehn Einzelkolonien verifiziert, um Mischkulturen oder heterogenes Verhalten innerhalb des Isolates ausschließen zu können. Nach Analyse der gesamten Genomsequenz von CG56 zeigte sich eine Mutation kurz vor der HS-Region von FKS2, die eine Erklärung für das Resistenzverhalten zu liefern scheint. Neben der Mutation in FKS2 wurde ebenfalls eine Mutation in FKS1 und in ERG3 bestätigt. Die Mutation in ERG3 führt zu einer Verschiebung im Sterolsynthesepathway und zu einer Neuverteilung der Zellmembranbestandteile. Das klinische Isolat CG22 fällt mit Resistenzen gegen Azole, Echinocandine und Amphotericin B auf und zeigte ebenfalls eine Mutationen in ERG3. Zusätzlich dazu ergab sich eine Loss-of- Function-Mutation in ERG4 und damit verbunden einen massiv reduzierten Ergosterolgehalt der Zellmembran. Die seltene Kombination aus ERG3 und ERG4 Mutation scheint die Erklärung für die außergewöhnliche Amphotericin B-Resistenz von CG22 zu liefern und wird hier als erstmals bei einem C. glabrata Isolat beschrieben. Dieser besondere Stamm, der sogar als panresistent bezeichnet werden kann, sollte Bestandteil weiterer Forschung werden. Der Sterolsynthesepathway dient als Angriffspunkt vieler Antimykotika und kann durch seine vielen Intermediate und abweichenden Abläufen zu unterschiedlichen Stoffwechselendprodukten führen. Der Ergosterolgehalt der Zellmembran eines C. glabrata-Stammes kann weitere Rückschlüsse auf die Empfindlichkeit des Isolates geben und somit die Chancen des Therapieerfolges der Antimykotikagabe besser vorhersagen und könnte somit einen vielversprechenden Beitrag zur Behandlung lebensbedrohlicher Candidosen leisten.
1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Background
Ureaplasma species (spp.) are commonly regarded as low-virulent commensals but may cause invasive diseases in immunocompromised adults and in neonates, including neonatal meningitis. The interactions of Ureaplasma spp. with host defense mechanisms are poorly understood. This study addressed Ureaplasma-driven cell death, concentrating on apoptosis as well as inflammatory cell death.
Methods
Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) were exposed to Ureaplasma (U.) urealyticum serovar 8 (Uu8) and U. parvum serovar 3 (Up3). Resulting numbers of dead cells as well as mRNA levels and enzyme activity of key agents in programmed cell death were assessed by flow cytometry, RNA sequencing, and qRT-PCR, respectively. xCELLigence data were used for real-time monitoring of changes in cell adhesion properties.
Results
Both Ureaplasma isolates induced cell death (p < 0.05, vs. broth). Furthermore, Ureaplasma spp. enhanced mRNA levels for genes in apoptosis, including caspase 3 (Up3 p < 0.05, vs. broth), caspase 7 (p < 0.01), and caspase 9 (Up3 p < 0.01). Caspase 3 activity was increased upon Uu8 exposure (p < 0.01). Vice versa, Ureaplasma isolates downregulated mRNA levels for proteins involved in inflammatory cell death, namely caspase 1 (Uu8 p < 0.01, Up3 p < 0.001), caspase 4 (Uu8 p < 0.05, Up3 p < 0.01), NOD-like receptor pyrin domain-containing 3 (Uu8 p < 0.05), and receptor-interacting protein kinase 3 (p < 0.05).
Conclusions
By inducing apoptosis in HBMEC as main constituents of the blood-brain barrier, Ureaplasma spp. may provoke barrier breakdown. Simultaneous suppression of inflammatory cell death may additionally attenuate host defense strategies. Ultimate consequence could be invasive and long-term CNS infections by Ureaplasma spp.
Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Die vorliegende Untersuchung konnte die Hypothese einer klonalen Entwicklung von EHEC O103:H2 bestätigen. Die in Clustern angeordnete Übereinstimmungsrate der RAPD-Fragmentierungsmuster und der Plasmidrestriktionen zeigen diese Ähnlichkeit innerhalb der Serogruppe auf, während Gemeinsamkeiten mit dem O157-Referenzstamm sich auf das Vorhandensein ähnlicher Virulenzfaktoren beschränken. Diese Varianz der phänotypischen und genotypischen Eigenschaften zeigte bei der Untersuchung hinsichtlich ihrer Bedeutung für diagnostische, phylogenetische und epidemiologische Fragestellungen unterschiedliche Wertigkeiten. Die ständig fortschreitende Differenzierung der Virulenzdeterminanten kann dabei nicht nur Ansätze zur Diagnostik sondern auch zur Therapie liefern und muss daher weiter verfolgt werden. Dennoch ist weiterhin der Nachweis des krankheitsauslösenden Shiga Toxins in der Routinediagnostik vermuteter EHEC-Erkrankungen erforderlich, mittels differenzierter Multiplex-PCR-Methoden können dabei auch Kombinationen relevanter Pathogenitätsfaktoren in einem Arbeitsgang erfasst werden. EHEC O103 traten mehrere Jahre nach E. coli O157:H7 als HUS-Erreger in Erscheinung und haben wahrscheinlich die dazu erforderliche Kombination von Pathogenitätsfaktoren erst später erworben. EHEC-Erkrankungen weisen eine steigende Inzidenz auf, können beim Menschen zu lebensbedrohlichen Krankheitsbildern führen, besitzen aber auch in der Veterinärmedizin eine hohe Relevanz. Da bisher kausale Therapien klinisch noch nicht verfügbar sind, muß aktuell vor allem die Prävention durch Infektionsprophylaxe und rasche Erkennung von Erkrankungsfällen im Vordergrund stehen.
Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden.
Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren.
In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten.
Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen.
Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus.
Molekulare Identifizierung von Neisseriaceae und Moraxellaceae mittels ribosomaler DNA-Sequenzierung
(2005)
Die schnelle und verlässliche Identifizierung mikrobiologischer Isolate ist ein fundamentales Ziel der klinischen Mikrobiologie. Bei einigen gram–negativen Spezies ist die klassische phänotypische Identifizierung, basierend auf metabolischen, enzymatischen oder serologischen Methoden erschwert, zeitraubend oder nicht suffizient. Durch die Sequenzierung partieller Abschnitte der 16S- oder 23S-rDNA können Bakterien meist exakt spezifiziert werden. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, hypervariable rDNA Abschnitte zu finden, die von stark konservierten Regionen flankiert werden, um auf molekularer Ebene Mitglieder der Familie Neisseriaceae und Moraxellaceae zu diskriminieren. Die inter- und intragenetischen Beziehungen von insgesamt 94 Stämmen wurden untersucht. Im Vergleich zu den Referenzstämmen der Genera waren bei der partiellen 16S-rDNA (E. coli Position 54 – 510) je Spezies durchschnittlich 30 polymorphe Positionen vorhanden. Die partiellen 23S-rDNA Abschnitte (E. coli Position 1400 – 1600) zeigten durchschnittlich 11 polymorphe Positionen. Neisseria macacae und N. mucosa subsp. mucosa (ATCC 19696) zeigten identische 16S- und 23S-rDNA Sequenzen. Die Gruppierung verschiedener Isolate war bei Acinetobacter lwoffii, Moraxella lacunata und Neisseria mucosa an beiden untersuchten Genabschnitten heterogen. Im Fall von N. meningitidis konnte mit Hilfe der 23S-rDNA Daten nicht suffizient gruppiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine Überlegenheit der untersuchten partiellen 16S-rDNA zur Diagnostik der Neisseriaceae und Moraxellaceae. Eine Referenzdatenbank zur Diagnostik von Mikroorganismen sollte mehr als ein Isolat einer Spezies enthalten und zudem einen polyphasischen Ansatz verfolgen. Die Sequenz–Chromatogramme und weitere diagnostisch relevante Informationen wurden mit der „offline“-Datenbank RIDOM_Tool gesammelt und sind ein Teil des Internet-basierenden Service von RIDOM (www.ridom-rdna.de). Eine eingegebene Sequenzfolge kann online eingefügt und damit ein direkter Vergleich mit den in der RIDOM Referenzdatenbank existierenden Datensätzen initiiert werden.
Die Differenzierung von Mykobakterien auf Speziesebene mithilfe von herkömmlichen biochemischen Testverfahren ist langwierig, was zu signifikanten Verzögerungen in der Diagnostik führt. Molekulare Identifizierung hingegen weist, verglichen mit der phänotypischen Identifizierung, zwei entscheidende Vorteile auf: es kommt dabei zu einem Geschwindigkeitszuwachs und zu einer höheren Genauigkeit des Diagnoseerfahrens. Der Informationsgehalt des 5’-Endes des 16S-rRNA-Gens ist ausreichend für die Identifizierung der meisten bakteriellen Spezies. Wegen der vielen fehlerhaften Datenbestände können öffentliche Sequenzdatenbanken die benötigten Referenzsequenzen jedoch nicht zur Verfügung stellen. Es wurde deshalb eigens eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Sequenzen geschaffen. Die Sequenzen beinhalten beide Stränge der 5’-16S-rDNA (E. coli-Position 54-510) von 125 Stammsammlungisolaten. Dabei wurden alle bis zum 31.03.2000 valide beschriebenen Arten (n=89) und einige weitere, bereits veröffentlichte Sequevare-Varianten eingeschlossen. Konnten Stämme anhand der 16S-Sequenzen nicht unterschieden werden, wurde zusätzlich die Sequenz der „Internal Transcribed Spacer Region“ bestimmt (n=45). Insgesamt existierten von den Stämmen, die anhand ihrer 16S-rDNA-Sequenz nicht eindeutig zu identifizieren waren, 77 Isolate in der öffentlichen Datenbank Genbank. Den neu analysierten Sequenzen gegenübergestellt weisen diese im paarweisen Vergleich eine durchschnittliche Diskrepanz von 4,31 Basen auf. Durch die vergleichende 5‘-16S-rDNA-Sequenzanalyse war es möglich 64 der 89 validen Spezies zu identifizieren (71.9%). Nach Hinzunahme der ITS-Sequenz war es möglich, weitere 15 Spezies zu differenzieren. Nur die Arten des M. tuberculosis complex, M. marinum und M. ulcerans und die M. avium Subspezies konnten weder durch 5‘16S-rDNA-Sequenzanalyse noch anhand der ITS-Sequenz differenziert werden. Die Sequenzen aller Stämme sind abrufbar in der Datenbank des RIDOM-Projekts (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Weiterführende Informationen (z.B. taxonomischer oder medizinischer Art) vervollständigen zusammen mit einem Algorithmus zur genotypischen Identifizierung aller valide beschriebenen Mykobakterien dieses Angebot. Nach ausführlicher Analyse verschiedener Mykobakterien Spezies ist es nun in der Tat möglich, die meisten Mykobakterien Arten anhand der vergleichenden Seqenzanalyse der 16S-rDNA und ITS zu unterscheiden. Voraussetzung hierfür ist eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Referenzsequenzen. Bereits in naher Zukunft ist die Anwendung dieses Verfahrens im Routinebetrieb, v.a. in Referenzlaboratorien, denkbar.
Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen.
Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht.
Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität.
Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus.
Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten.
Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
Molekulare Charakterisierung eines Tropomodulin-Homologen des Fuchsbandwurms E. multilocularis
(2002)
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Tropomodulin- homologer Faktor aus einem Plathelminthen auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Zudem wurde die Interaktion des kodierten Faktors mit einem kürzlich isolierten Tropomyosin- Homologen aus E. multilocularis nachgewiesen. Basierend auf diesen Daten ist es nun möglich, die biologische Signifikanz der Interaktion von Elp mit EmTY weiterführend zu untersuchen. Sollte sich in diesen Studien herausstellen, daß der ERM- Faktor Elp in der Tat mit dem Tropomodulin- Tropomyosin- System der E. multilocularis- Zelle interferiert, könnte dies ein wichtiger Beitrag zu unserem Verständnis des signaltransduktorischen Geschehens zwischen der Plasmamembran und dem Zytoskelett bei E. multilocularis sein.
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe.
Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Despite available diagnostic tests and recent advances, diagnosis of pulmonary invasive aspergillosis (IPA) remains challenging. We performed a longitudinal case-control pilot study to identify host-specific, novel, and immune-relevant molecular candidates indicating IPA in patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Supported by differential gene expression analysis of six relevant in vitro studies, we conducted RNA sequencing of three alloSCT patients categorized as probable IPA cases and their matched controls without Aspergillus infection (66 samples in total). We additionally performed immunoassay analysis for all patient samples to gain a multi-omics perspective. Profiling analysis suggested LGALS2, MMP1, IL-8, and caspase-3 as potential host molecular candidates indicating IPA in investigated alloSCT patients. MMP1, IL-8, and caspase-3 were evaluated further in alloSCT patients for their potential to differentiate possible IPA cases and patients suffering from COVID-19-associated pulmonary aspergillosis (CAPA) and appropriate control patients. Possible IPA cases showed differences in IL-8 and caspase-3 serum levels compared with matched controls. Furthermore, we observed significant differences in IL-8 and caspase-3 levels among CAPA patients compared with control patients. With our conceptual work, we demonstrate the potential value of considering the human immune response during Aspergillus infection to identify immune-relevant molecular candidates indicating IPA in alloSCT patients. These human host candidates together with already established fungal biomarkers might improve the accuracy of IPA diagnostic tools.
Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus
granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment
options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite
material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment
option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic
and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently
needed.
Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite
cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they
represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of
the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied.
Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in
serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus
genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving
serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development
was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation
from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin
transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from
primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it
could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates.
Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport
are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components
of the serotonin pathway represent potential drug targets.
In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein
coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including
members of all major families were identified in the E. multilocularis genome.
Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis
genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused
no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate
cyclase inhibitor 2’, 5’ didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation
from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes.
It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A
substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes.
These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in
Echinococcus development and survival.
To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS
prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation
and development.
Taken together, this work provided important insights into developmental processes
in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy.
Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.
Echinococcosis is an important zoonosis. The causative agent of Alveolar Echinococcosis (AE) is Echinococcus multilocularis. The treatment of human AE is limited to surgery and chemotherapy with albendazole (ABZ). However, ABZ works only parasitostatically and it needs to be taken for long periods, although it causes adverse side effects. Thus, development of new, parasiticidal drug with selective toxicity is required. Because undifferentiated stem cells of E. multilocularis play key role in its longevity and regenerative capacity, targeting stem cells is especially important.
In vitro screening of protein kinases inhibitors demonstrated that human PIM kinases inhibitors have detrimental effects on E. multilocularis. Through yeast two hybrid assay, the interaction of parasite PIM kinase (EmPIM) and its CDC25 (EmCDC25) was indicated. Through in situ hybridization, expression of EmPIM in the stem cells was observed. Therefore, EmPim is likely to be a positive regulator of cell cycle progression, the same as human Pim1. In addition, 20 compounds against EmPIM were selected through in silico screening and synthesized. One of them has a detrimental effect on E.multilocularis comparable to human pan-PIM inhibitors, but has much weaker toxicity on human cell lines.
Furthermore, triclabendazole (TCBZ) and its metabolite TCBZSX, which are approved for another flatworm disease, Fascioliasis were tried on E. multilocularis. With two stem cell markers, damage to stem cells by TCBZSX was shown. In addition, primary cells from treated vesicles never regenerated and the damage to stem cells proved to be irreversible.
Our in silico screening method used in EmPIM research has potential to identify compounds which overcome the side effect problem in ABZ-based chemotherapy. On the other hand, it is expected that my research of TCBZ can lead to development of a practical parasiticidal chemotherapy by combining TCBZ, which damages stem cells, and ABZ, which damages differentiated cells.
The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite’s metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite’s Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite’s insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species.
The host's defense against invasive mold infections relies on diverse antimicrobial activities of innate immune cells. However, studying these mechanisms in vitro is complicated by the filamentous nature of such pathogens that typically form long, branched, multinucleated and compartmentalized hyphae. Here we describe a novel method that allows for the visualization and quantification of the antifungal killing activity exerted by human granulocytes against hyphae of the opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus. The approach relies on the distinct impact of fungal cell death on the morphology of mitochondria that were visualized with green fluorescent protein (GFP). We show that oxidative stress induces complete fragmentation of the tubular mitochondrial network which correlates with cell death of affected hyphae. Live cell microscopy revealed a similar and non-reversible disruption of the mitochondrial morphology followed by fading of fluorescence in Aspergillus hyphae that were killed by human granulocytes. Quantitative microscopic analysis of fixed samples was subsequently used to estimate the antifungal activity. By utilizing this assay, we demonstrate that lipopolysaccharides as well as human serum significantly increase the killing efficacy of the granulocytes. Our results demonstrate that evaluation of the mitochondrial morphology can be utilized to assess the fungicidal activity of granulocytes against A. fumigatus hyphae.
A longstanding question in infection biology addresses the genetic basis for invasive behavior in commensal pathogens. A prime example for such a pathogen is Neisseria meningitidis. On the one hand it is a harmless commensal bacterium exquisitely adapted to humans, and on the other hand it sometimes behaves like a ferocious pathogen causing potentially lethal disease such as sepsis and acute bacterial meningitis. Despite the lack of a classical repertoire of virulence genes in N. meningitidis separating commensal from invasive strains, molecular epidemiology suggests that carriage and invasive strains belong to genetically distinct populations. In recent years, it has become increasingly clear that metabolic adaptation enables meningococci to exploit host resources, supporting the concept of nutritional virulence as a crucial determinant of invasive capability. Here, we discuss the contribution of core metabolic pathways in the context of colonization and invasion with special emphasis on results from genome-wide surveys. The metabolism of lactate, the oxidative stress response, and, in particular, glutathione metabolism as well as the denitrification pathway provide examples of how meningococcal metabolism is intimately linked to pathogenesis. We further discuss evidence from genome-wide approaches regarding potential metabolic differences between strains from hyperinvasive and carriage lineages and present new data assessing in vitro growth differences of strains from these two populations. We hypothesize that strains from carriage and hyperinvasive lineages differ in the expression of regulatory genes involved particularly in stress responses and amino acid metabolism under infection conditions.