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Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt.
Viren durchliefen eine gemeinsame Evolution mit ihren Wirtsorganismen, die zu einer spezifischen Anpassung der Viren an ihren jeweiligen Wirt führte. Als Folge dessen verfügen viele Viren über ein eng begrenztes Wirtsspektrum. Gelegentlich machen Viren Veränderungen durch, die es ihnen erlauben, einen neuen Wirt zu infizieren und in ihm zu replizieren, wie dies in jüngster Vergangenheit beim humanen Immundefizienz-Virus oder beim Grippevirus geschehen ist. Spezies-übergreifende Infektionen sind für die meisten neuen und wiederauftauchenden Viruserkrankungen verantwortlich. Allerdings ist bisher wenig über die Mechanismen bekannt, die Viren auf einen bestimmten Wirt beschränken, und welche Faktoren Viren zur Überwindung der Spezies-Barriere und zur Vermehrung in einer neuen Wirtsspezies benötigen. Cytomegaloviren sind Prototypen der beta-Herpesvirus Unterfamilie und verfügen über eine ausgeprägte Spezies-Spezifität. Sie vermehren sich nur in Zellen der eigenen oder einer eng verwandten Wirtsspezies. Der molekulare Mechanismus, der dieser Spezies-Spezifität zugrunde liegt, ist noch weitgehend unbekannt und stellt deshalb das Thema dieser Arbeit dar. Initiale Beobachtungen zeigten, dass sich das Maus-Cytomegalovirus (MCMV) ausschließlich in menschlichen 293 und 911 Zellen, aber keiner anderen getesteten menschlichen Zelle vermehren ließ. Diese beiden Zelllinien sind mit Adenovirus E1-Genen transformiert, die den Transkriptions-Transaktivator E1A sowie zwei Apoptose-Inhibitoren (E1B-55k und E1B-19k) kodieren. Daher lag die Hypothese nahe, dass diese Funktionen benötigt werden, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass normale menschliche Zellen nach Infektion rapide absterben, und zwar durch eine Caspase-9-vermittelte Apoptose. Die Induktion der Apoptose durch MCMV lässt sich durch Caspase-Inhibitoren unterdrücken, wodurch die virale Replikation wiederhergestellt wird. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion der Caspasen für diesen Prozess hin. Durch Überexpression eines mitochondrialen Apoptose-Inhibitors, d.h. eines Bcl-2-ähnlichen Proteins, in menschlichen Zellen ließ sich die Virus-induzierte Apoptose verhindern. Diese Zellen erlaubten ebenfalls eine effiziente MCMV-Replikation. Die Bedeutung Bcl-2-ähnlicher Proteine für die Spezies-übergreifende Cytomegalovirus-Infektion wurde sowohl durch die Integration korrespondierender Gene, alsauch durch die Integration anderer Inhibitioren der Apoptose oder von Kontroll-Genen in das MCMV Genom bestätigt. Nur rekombinante Viren, die ein Bcl-2-ähnliches Protein kodieren, konnten in menschlichen Zellen vermehrt werden. Ein einziges Gen des humanen Cytomegalovirus, das einen mitochondrialen Apoptose-Inhibitor kodiert, reichte aus, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieselben Prinzipien für eine Replikation des Ratten-Cytomegalovirus in menschlichen Zellen gelten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Induktion der Apoptose eine Spezies-übergreifende Infektion bei den Nagetier-Cytomegaloviren einschränkt.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus für die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zurückzuführen. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm für die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der für mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molekülen in den Darm eingesetzt werden könnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilitätsregion enthält, während das Plasmid pMUT2 ein ColE2-ähnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem für den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll für auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivität von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifität und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems bestätigt. Darüber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine mögliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor für rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zusätzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Erkenntnisse über Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufklärung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen könnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adhäsine von humanpathogenen enterohämorrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in Mäusen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adhäsine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivität von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen Mäusen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage für den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und für in vivo Untersuchungen, die zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen könnten.