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Malaria is a vector-borne disease caused by the protozoan parasite of the genus Plasmodium and it is transmitted from human to human by female Anopheles mosquitoes during a blood meal. For malaria transmission to occur, the malaria parasite must undergo a crucial developmental sexual phase inside the mosquito midgut. In this study, we sought to investigate the interplay of the malaria parasite in the mosquito midgut with regard to the identification of novel types of transmission blocking intervention strategies. These strategies are aimed at reducing the spread of malaria by blocking the development of the mosquito midgut-specific stages of Plasmodium. We focused on three aspects. The first aspect was to investigate the interplay between mosquito midgut bacteria and malaria parasites in order to determine the potential influence of malaria parasites on the composition of the mosquito gut microbiota and also determine midgut bacteria which could be exploited as vehicles for the generation of paratransgenic Anopheles mosquitoes. We analyzed the microbial diversity of gut bacteria of the Asian malaria vector Anopheles stephensi during development and under different feeding regimes, including feeds on malaria parasite-infected blood, using the human pathogenic P. falciparum as well as the rodent malaria model P. berghei. 16S rRNA and DGGE analyses demonstrated a reduction in the microbial diversity during mosquito development from egg to adult and identified the gram-negative bacterium Elizabethkingia meningoseptica as the dominant species in the midgut of laboratory-reared male and female mosquitoes. E. meningoseptica is transmitted between generations and its predominance in the mosquito midgut was not altered by diet, when the gut microbiota was compared between sugar-fed and blood-fed female mosquitoes. Furthermore, feeds on blood infected with malaria parasites did not impact the presence of E. men-ingoseptica in the gut. Interestingly, extracts from E. meningoseptica exhibited antibacterial, antifungal and antiplasmodial activities, which may account for its dominance in the midgut of the malaria vector. Isolates of E. meningoseptica were cultivable, making the bacterium a potential candidate vehicle for the generation of paratransgenic Anopheles mosquitoes. The second aspect of this thesis was to determine transcriptome changes that occur during the first half hour following transmission of P. falciparum to the mosquito vector in order to better understand gene regulation mechanisms important for the change of hosts and determine novel proteins which could be exploited in malaria transmission blocking interventions. We initially used suppression subtractive hybridization (SSH) to compare mRNA levels of P. falciparum gametocytes before and 30 min fol-lowing activation. We identified a total of 126 genes for which transcript expression changed during gametogenesis. Among these, 17.5% had putative functions in signaling, 14.3% were assigned to cell cycle and gene expression, 8.7% were linked to the cytoskeleton or motor complex, 7.9% were involved in proteostasis and 6.4% in metabolism, 12.7% were genes encoding for cell surface associated proteins, 11.9% were assigned to other functions, and 20.6% represented genes of unknown function. For 40% of the identified genes there has as yet not been any protein evidence. We further selected a subset of 34 genes from all the above ontology groups and analyzed the transcript changes during gametogenesis in detail by quantitative realtime RT-PCR. Of these, 29 genes were expressed in gametocytes, and for 20 genes transcript expres-sion in gametocytes was increased compared to asexual blood stage parasites. Transcript levels of eight genes were particularly high in activated gametocytes, pointing at functions downstream of gametocyte transmission to the mosquito which could be exploited in malaria transmission blocking strategies. The last aspect of this thesis was to determine the transmission blocking effect of a range of antimicrobial molecules as transmission blocking agents. The molecules were either isolated from insect hemolymph or recombinantly expressed in tobacco and designed to act either directly on the mosquito midgut stages or cover receptors on mosquito tissues like the midgut epithelium which the parasite would need for transit. We were able to show an antiplasmodial and transmission blocking effect of the anti-microbial molecule harmonine, a defense compound isolated from the hemolymph of the Asian ladybug Harmonia axyridis. Harmonine thus represents a potential lead structure for the development of novel antimalarials.
Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria
(2008)
In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie.
Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann.