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Proteasen als Peptid hydrolysierende Enzyme spielen eine essenzielle Rolle im Verlauf verschiedenster Erkrankungen, wie z.B. SARS, Malaria oder Alzheimer. Die irreversible Hemmung dieser Proteasen gilt somit als neues Konzept in der Wirkstoffentwicklung. Dabei ist es von immenser Bedeutung, die Interaktion der beteiligten Proteine zu kennen, um einen geeigneten Wirkstoff zu entwickeln. Ein Ziel dieser Arbeit war es, kleine elektrophile Bausteine wie Aziridine, Epoxide oder Akzetor-substituierte Olefine zu synthetisieren und zu kristallisieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Luger (FU Berlin) konnten mittels hochauflösender Röntgenstrukturanalyse bei ulta-niedrigen Temperaturen die Elektronendichten von mehreren Protease-Inhibitor-Modell-Verbindungen bestimmt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war ausgehend von bekannten aktiven Aziridinen, Epoxiden oder Michael-Systemen, azapeptidische Analoga darzustellen, welche durch ihre Hydrazid-Verknüpfung eine bessere Hydrolysebeständigkeit gegenüber enzymatischem Abbau bieten. Alle synthetisierten Verbindungen wurden in fluorimetrischen Enzym-Assays an acht Protesen (Cathepsin B, Cathepsin L, Falcipain 2, Rhodesain, SARS-CoV-Mpro, SARS-COV-plpro, SAP2 and Cathepsin D)getestet und die Hemmkonstanten bestimmt
Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tatsächlichen Beleg hierfür konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gewählt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellulären Schleife des α2a-adrenergen Rezeptors (α2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellulären Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellulären Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp α2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es möglich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor für den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die Änderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgelöst wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein ähnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schwächeres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine Änderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signaländerung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandomäne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandomäne VI, und bestätigt damit ein auf Röntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken für die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgelöste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. Für das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellulären Schleife spezifische Konformationen auslösen können. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es möglich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierfür wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gewählt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdrängungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH für beide Motive eine dreifach höhere Affinität besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach höhere Affinität zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinitätsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es möglich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zunächst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdrängt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalität dieses Protokolls zu überprüfen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein β-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gemäß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte β-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte β-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden.
Aussagekräftige Methoden zur Authentizitätsbewertung sind unerlässlich, um so-wohl einen fairen Handel als auch das Vertrauen der Verbraucher in die Qualität von Lebensmitteln zu gewährleisten. Das Ziel dieser Arbeit war es, anhand der Parameter 'Enantioselektivität' und 'Iso-topendiskriminierung' Methoden zur Authentizitätskontrolle von Schaumweinen und Erdbeeren, beides Produkte mit einem vergleichsweise hohen Handelswert, zur Verfügung zu stellen. Um unmittelbare Anwendbarkeit in der Praxis zu ermög-lichen, sollten dabei Untersuchungsmethoden zur Anwendung kommen, wie sie in Speziallaboratorien der Lebensmittelkontrolle gängig sind. Die Methoden der Wahl waren Gaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS), Multidimensionale Gaschromatographie an achiraler/chiraler Phase (enantio-MDGC-MS) und Isoto-penverhältnismassenspektrometrie (IRMS), letztere sowohl in der Anwendung mittels Elementaranalysatoren (EA) als auch in der Kopplung mit der Gaschroma-tographie (HRGC-IRMS). Zur Echtheitsprüfung von Schaumweinen wurde 1,2-Propandiol als mögliche neue Markerkomponente ausgewählt und eine Methode zu dessen Extraktion und Enantiomerenanalytik erarbeitet. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass weder der Gehalt noch das Enantiomerenverhältnis für sich alleine eine Aussage über Her-kunft oder Produktionsmethode ermöglichen. Eine Kombination beider Parameter kann jedoch als Ausgangspunkt für die Authentifizierung von Schaumweinen die-nen. Die Untersuchung von Erdbeer-Aromaprofilen mittels HRGC-MS ergab, dass die Aromastoffzusammensetzung von Erdbeeren maßgebend von der jeweiligen Erd-beersorte beinflusst wird. Es zeigte sich, dass alle Erdbeer-Aromaprofile einem von zwei möglichen Aromaprofiltypen von Kulturerdbeeren zuzuordnen sind. Im Hinblick auf eine Authentizitätsbewertung anhand von Aromastoffprofilen ermög-licht dies den Nachweis einer höheren Menge von nicht aus der Erdbeerfrucht stammendem Aroma zu Erdbeerprodukten. Ein wesentlicher Ansatz zur Überprüfung der Authentizität von Erdbeeraromastof-fen war die Messung des Stabilisotopenverhältnisses von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (Furaneol®), welcher als "Schlüsselaromastoff" bei Erdbeeren (und Ananas) gilt. Die Ergebnisse zeigten, dass lediglich das Sauerstoffstabilisotopen-verhältnis 18O/16O als Grundlage für eine aussagekräftige Methode dienen kann. IV Eine Unterscheidung von natürlichem Erdbeeraroma aus Erdbeerfrüchten und aus anderen natürlichen Materialien ließ sich hierbei nicht erreichen, jedoch war die synthetische Herkunft einddeutig identifizierbar. Der Einsatz geplanter Multiele-mentanalytik scheiterte an unzureichender Reproduzierbarkeit sowohl bei 2H/1H-, als auch bei 13C/12C-Analysen, wobei die Ursache bei erstgenannten in Aus-tauschreaktionen liegt.
Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Erfassung von Pyrrolizidinalkaloiden in Honig und Pollen
(2009)
In jüngster Vergangenheit hat die potentielle Belastung von Lebens- und Futtermitteln mit PA wiederholt Aufmerksamkeit erregt. Eine Exposition des Menschen mit PA kann über den Genuss von Tees, Phytopharmaka, pflanzlichen Lebensmitteln (z.B. Salatmischungen) oder, im Fall einer Verfütterung von PA-Pflanzen an Tiere, als sekundäre Kontamination über tierische Lebensmittel erfolgen. Im ‚International Programme on Chemical Safety (IPCS)’ der WHO ist die grundsätzliche Gefährdung der menschlichen Gesundheit durch PA dokumentiert. Aus Gründen des vorbeugenden Verbraucherschutzes gibt es demzufolge Rechtsvorschriften zur Regulierung PA-haltiger Phytopharmaka. Für diese gilt in Deutschland seit 1992 ein Grenzwert von 1 µg PA/Tag für 1,2-ungesättigte PA und deren N-Oxide bei oraler Aufnahme und einer Anwendungsdauer von max. 6 Wochen. Geht die Anwendung darüber hinaus, beträgt der Grenzwert 0,1 µg PA/Tag. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine robuste, reproduzierbare und selektive analytische Methode basierend auf Zink-Staub-Reduktion, Festphasenextraktion (SCX-SPE), LiAlH4 Reduktion mit anschließender Silylierung sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS)-Analytik erarbeitet. Durch ein solches Vorgehen werden die PA-N-Oxide in tertiäre PA überführt, so dass alle PA in ihrer tertiären Form vorliegen. Durch die anschließende chemische Reduktion werden alle Mono- und Diester-PA in die jeweiligen Necinbasen überführt. Durch die anschließende Derivatisierung zum di-TMS-Derivat, konnten über den Summenparameter Retronecin PA-Kontaminationen mit 1,2-ungesättigten PA-Strukturen verlässlich detektiert und hochselektiv mittels HRGC-MS im SIM-Modus angezeigt werden. Die Validierung der Methode erfolgte durch die Verwendung von Senecio vernalis-Extrakt sowie authentischen PA-Standards und deren N-Oxiden. Unter Modifikationen der Probenaufarbeitung war diese Methode sowohl für Honig und Pollen, als auch für honighaltige Lebensmittel einsetzbar. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Methode durch die Synthese des deuterierten Standards di-Butyroyl-[9,9-2H2]-Retronecin zur Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse (SIVA) erweitert und optimiert. Die entwickelte Methode erlaubt erstmals, anders als bei bereits vorliegenden Arbeiten zur Bestimmung von PA in Pflanzenteilen, eine exakte und selektive Bestimmung von PA im Spurenbereich, unabhängig von deren botanischem Ursprung oder chemischer Struktur (tertiäres PA, N-Oxide). In einem breit aufgestellten Screening von 216 Honighandelsproben und 35 Forschungshonigen – letztere umfassten 27 Senecio- und 8 Echium-Honige - konnten zum Teil erhebliche Mengen an PA nachgewiesen werden. Die Belastungsrate der einzelnen Probensets reichte von 9 bis zu 100%. Die hierbei ermittelten Gehalte lagen, berechnet als Retronecin-Äquivalente, zwischen 0,019 µg/g und 4,66 µg/g. Ergänzt wurden die analytischen Daten durch die Erhebung von mellisopalynologischen Daten. Hierbei zeigte sich, dass eine Bestimmung von PA-Pflanzenpollen über die relative Pollenhäufigkeit nach DIN 10760 nur eine geringe Aussagekraft bei der Riskioabschätzung besitzt. Zwar war die Anwesenheit von PA-Pflanzenpollen immer ein Indikator für das Vorkommen von PA, jedoch konnten über den relativen Pollengehalt keine Aussagen über die Höhe der PA-Belastung getroffen werden. In einer weiteren Studie zu PA-Gehalten in Pollen und Pollenerzeugnissen sind in den nativen Pollen die erwartet hohen PA-Gehalte bestätigt worden. Aber auch die in Vollsortimentsupermärkten und Reformhäusern häufig vertretenen Pollenprodukte wiesen PA-Gehalte auf, die im Mittel weit über den bei Honig festgestellten Werten lagen. So ergaben sich für die nativen Pollen aller bedeutenden, PA-produzierenden Pflanzenfamilien PA-Gehalte von 0,57-4,07 mg/g, während sich für die Pollenprodukte Gehalte von 1,08-16,35 µg/g feststellen ließen. Eine zusätzliche Erhebung von mellisopalynologischen Daten bestätigte deren bereits bei den Honigproben festgestellte, eingeschränkte Aussagekraft hinsichtlich des PA-Gehaltes. Durch ein Screening von 60 honighaltigen Lebensmitteln mit unterschiedlichen Honiganteilen konnte eine potentielle Downstream-Kontamination durch den Einsatz von hoch PA-belasteten Honigen im Herstellungsprozess nachgewiesen werden. Bei einer Belastungshäufigkeit von 13% lagen die hierbei ermittelten PA-Gehalte, berechnet als Retronecin-Äquivalente, bei 0,010-0,484 µg/g. Abschließend ist in modellhaft durchgeführten Filtrationsversuchen gezeigt worden, dass PA-Pflanzenpollen erheblichen Einfluss auf den PA-Gehalt des Honigs ausüben. Dennoch stellt eine Honigfiltration, wie sie in Anlage 1 der Honigverordnung zulässig ist, keine Möglichkeit dar, hoch mit PA belasteten Honig im PA-Gehalt zu senken. Vielmehr ließ sich mit den durchgeführten Versuchen eine Diffusion der PA aus Pollen in den Honig nachweisen.
Der ‚Liber de arte distillandi de simplicibus’, genannt das ‚Kleine Destillierbuch’ des Straßburger Chirurgen Hieronymus Brunschwig (ca. 1450 bis 1512/13) wurde im Jahr 1500 erstmals veröffentlicht. In der vorliegenden Untersuchung sollen die darin genannten humoralpathologischen medizinischen Indikationen der destillierten Pflanzenwässer mit den nach derzeitigem wissenschaftlichem Erkenntnisstand belegten Indikationen verglichen werden und auf Übereinstimmungen und Abweichungen hin untersucht werden. Das ‚Kleine Destillierbuch’ befasst sich mit der Destillation von Arzneimitteln vorwiegend pflanzlicher Herkunft und den medizinischen Anwendungsbereichen dieser Destillate. Das erfolgreiche Werk, das in schriftlicher Form die damalige gängige Praxis der Medizinkundigen in Straßburg fixiert, entwickelte sich zum heilkundlichen Volksbuch des 16. Jahrhunderts, galt aber auch bei Berufs-Destillierern als wichtiges Technik-Lehrbuch für Destillationsverfahren. Daneben waren Brunschwigs Pflanzenbeobachtungen im ‚Kleinen Destillierbuch’ eine wertvolle Grundlage für die ältere deutsche Botanik. Für die Untersuchung wurden Druckausgaben aus den Jahren 1528 und 1610 verwendet. In einem ersten Schritt wurde durch Klärung heute ungebräuchlicher Begriffe der frühneuzeitliche Text erschlossen. Im zweiten Schritt wurden die Zutaten identifiziert, die Brunschwig zur Destillation der 269 pflanzlichen und 36 nicht-pflanzlichen, meist tierischen gebrannten Wässer verwendet. Im dritten Schritt wurden alle Indikationen der Destillate, die Brunschwig in seinen Planzenmonographien nennt, gesammelt und verschiedenen Körperregionen zugeordnet. Anschließend wurden den historischen Indikationsbezeichnungen heute gebräuchliche Bezeichnungen gegenübergestellt, um einen direkten Vergleich der Daten, die zwei grundsätzlich verschiedenen Wissenschaftsystemen entspringen, zu ermöglichen. Im vierten Schritt wurden alle von Brunschwig genannten Anwendungsbereiche der einzelnen „Wässer“-Monographien jeweils in Tabellenform aufgenommen. Diesen historischen Anwendungsbereichen wurden heutige naturwissenschaftlich belegte Indikationen gegenübergestellt. Hierfür wurde v.a. auf W. Blaschek, S. Ebel, E. Hackenthal u. a., Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe, HagerROM 2004, Programmversion 5.1, Berlin, Heidelberg 2005 zurückgegriffen. Ein Vergleich der historischen mit den aktuellen Anwendungen erfolgte anhand abgestufter Kategorien (I, II, III, IV). Für eine Interpretation der untersuchten Daten wurden diejenigen von Brunschwig verwendeten Pflanzen ausgewählt, die ein nach heutigem Wissensstand belegtes Anwendungsgebiet besitzen. Diese wurden zunächst nach den für ihre Wirkung relevanten Inhaltsstoffen geordnet. Die Übereinstimmungen bzw. Abweichungen der Brunschwigschen Anwendungsgebiete von den heute definierten Anwendungsgebieten der untersuchten Pflanzen wurden diskutiert. Die relativen Trefferhäufigkeiten wurden ermittelt. Sie liegen zwischen 33 % und 100 %, im Durchschnitt bei 65 %. Für eine weitere Diskussion wurden die gleichen Daten bezüglich der Destillat-Anwendung in den oben genannten Körperregionen geordnet. Die relativen Trefferhäufigkeiten liegen hier in einem Bereich zwischen 43 % und 86 %, im Durchschnitt bei 57 %. Die vorliegende Untersuchung ist Teil eines größeren Forschungsvorhabens. In gleicher Weise sollen mehrere Kräuterbücher des Mittelalters bzw. der frühen Neuzeit untersucht und anschließend mittels eines statistischen Verfahrens einzeln und im Vergleich umfassend ausgewertet werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine im Arbeitskreis entwickelte Methode zur Darstellung von unterschiedlich substituierten -Aminopiperidinen zu etablieren und zu verifizieren, indem unser Konzept einer Tandemreaktion zum Einsatz kommen sollte. Diese Reaktionssequenz sollte anschließend zur Totalsynthese von Microconin, einem aus Microcos paniculata isoliertem Alkaloid, genutzt werden. Den ersten Schritt in Richtung -Aminopiperidinderivate machte die Veresterung von L-Pyroglutaminsäure. Nach der Reduktion des Methylesters erfolgte die Aktivierung der Hydroxyfunktion des Alkohols in Form des Tosylats. Die Azideinführung resultierte aus einer nucleophilen Substitutionsreaktion, anschließend daran wurde der Lactam-Stickstoff mit Boc2O und einer katalytischen Menge DMAP geschützt. Das Lactam ist durch den Elektronenakzeptor aktiviert, so dass die Ringöffnung zum Methylester unter sehr milden Bedingungen und ohne weiteren Reinigungsschritt erfolgen konnte. Die Aminofunktion musste mit einer zweiten Schutzgruppe blockiert werden, die anschließende selektive Reduktion mit DiBAl-H in trockenem Ether verlief problemlos und lieferte mit dem Aldehyd das Edukt für Olefinierungen mittels verschiedener Wittig-Reaktionen. Dafür wurden stabilisierte Phosphonate hergestellt und in einer HWE-Reaktion mit dem Aldehyd umgesetzt. Die resultierenden elektronenarmen Olefine gingen dann die intramolekulare Cycloaddition mit dem Azidsubstituenten ein und bauten so den Grundkörper der -Aminopiperidinderivate in einer Reaktionssequenz auf, die wir als Tandem Wittig-[3+2]-Cycloaddition bezeichnen. Die Bildung der primären Triazoline erfolgte stereoselektiv, die Geschwindigkeit der Cycloaddition hing sowohl vom konjugierten Olefinsubstituenten als auch vom vicinalen Substituenten der Azidfunktion ab. Die Konfigurationsbestimmung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie durch Analyse der Kopplungskonstanten und NOE-Messungen. Die asymmetrische Induktion der Cycloaddition konnte direkt für die Stereochemie am Piperidinring genutzt werden, indem, nach basischer Triazolin/Diazoamin Isomerisierung, gleich das Diazoamin hydriert wurde. Die Hydrierung der vinylogen Urethane, den Produkten aus der rhodiumkatalysierten Stickstoffextrusion, lieferte ein Diastereomerengemisch, wobei das Verhältnis der Diastereomere hauptsächlich vom Substitutionsgrad des exocyclischen Amins abhängig war. Überraschenderweise fand beim Sulfontriazolin keine Isomerisierung zum Diazoamin statt, daher musste für die Darstellung der Sulfonylmethyl--aminopiperidine eine alternative Route über ein Ketosulfon beschritten werden. Die Synthese von Microconin begann mit der Desoxygenierung von L-Rhamnose durch die sog. Fischer-Zach-Reaktion. Das Rhamnal wurde in einer drei Stufen Eintopfreaktion erhalten und mittels Perlinhydrolyse in den offenkettigen Aldehyd umgewandelt. Die Aktivierung der Hydroxyfunktion als Mesylat resultierte in einer äußerst empfindlichen Verbindung, die nur durch Verwendung des Lindlar-Katalysators mit zufrieden stellenden Ergebnis zum aliphatischen Aldehyd reduziert werden konnte. Eine bimolekulare nucleophile Substitutionsreaktion lieferte bei der Azideinführung zur Schlüsselverbindung sowohl die benötigte funktionelle Gruppe als auch die benötigte Inversion der Konfiguration. Die Tandem HWE-[3+2]-Cycloadditions-Reaktion führte auch bei dem Sulfontriazolin in eine Sackgasse, weshalb wieder eine alternative Syntheseroute eingeschlagen werden musste. Ausgehend von derselben Schlüsselverbindung gelang dies durch eine zinnkatalysierte Umsetzung mit stabilisierten Diazomethan zum Ketosulfon. Der Aufbau des Piperidin-Heterocyclus konnte dann wieder über eine intramolekulare Imin-Bildung des intermediären Amins mit dem Keton erzielt werden. Die diastereoselektive Hydrierung verlief unter Wasserstoffaddition von der sterisch weniger gehinderten -Seite und Ausbildung des all cis Substitutionsmusters. Nach dem erfolgreichen Aufbau des Heterocyclus mussten noch die beiden Heteroatome methyliert werden. Dabei wurden die besten Ergebnisse am Ringstickstoff mit der reduktiven Aminierung erzielt. Bei der anschließenden Abspaltung der Acetylgruppe zeigte sich erstmals, dass das Substitutionsmuster am Piperidinring nicht konfigurationsstabil war, da neben dem erwarteten Alkohol auch das Diastereomer isoliert wurde. Die genaue Ursache für die Epimerisierung nach der N-Methylierung konnte nicht geklärt werden. Die Einführung des Methoxy-Substituenten am Grundkörper erfolgte über eine Williamsonschen Ethersynthese. Bei den Versuchen zur Kupplung des Grundkörpers mit der Seitenkette 2,4-Nonadienal erwies sich der Zusatz von HMPT als förderlich. Weiterhin konnte die Ausbeute an -Hydroxysulfonen durch das Erwärmen der Reaktionsmischung gesteigert werden. In den Folgeschritten der Julia-Olefinierung blieben die Versuche zur Ausbildung der dreifach ungesättigten Struktureinheit in der Seitenkette des isolierten Naturstoffs jedoch erfolglos.
Die Pseudodistomine gehören zu den ersten Piperidinalkaloiden marinen Ursprungs, die 1987 von Ishibashi et al. aus der Tunikate (Ascidie) Pseudodistoma kanoko isoliert wurden. Aus der gleichen Tunikate wurde 1995 das Pseudodistomin C isoliert. Die amphiphilen Piperidinalkaloide zeigen eine Antitumor-Aktivität gegen bestimmte Mäuseleukämiezellen, wobei Pseudodistomin C auch eine Cytotoxizität gegen menschliche HeLa-abgeleitete Krebszellen KB aufweist. In der Einleitung wird ausführlich auf Vorkommen, Struktur, Biogenese, pharmakologische Perspektiven und literaturbekannten Synthesen dieser amphiphilen Piperidin-Alkaloide eingegangen. Im Hauptteil wird zunächst eine gescheiterte Synthese ausgehend von D-Ribose über das Konzept einer Tandem Wittig-[3+2]-Cycloaddition beschrieben. Daraufhin wird ein völlig neuer Syntheseweg vorgestellt, welcher den formalen Aufbau des Pseudodistomin C über einen bekannten Piperidin-Grundkörper ermöglich. Des weiteren konnte das vollständig geschützte Pseudodistomin E synthetisiert werden.
The Exploration of whitening and sun screening compounds in bengkoang roots (Pachyrhizus erosus)
(2009)
Die Wurzeln der Bengkoang (Phacyrhizus erosus) werden im Bereich der Kosmetik, speziell zum Schutz vor UV-Strahlung und zum Bleichen der Haut, verwendet. Indonesien ist ein tropisches Land, in dem täglich die Sonne scheint. Die Sonnenstrahlung, insbesondere die UV-Strahlung hat negative Auswirkungen, wie z. B. Sonnenbrand, Krebserzeugung und Hyperpigmentation. Deshalb brauchen die Menschen in Indonesien „sunscreen and whitening“-Kosmetik zum Schutz der Haut vor der Sonneneinstrahlung. Bis heute gibt es keine wissenschaftlichen Beweise, ob Bengkoang Wirkstoffe enthält, die die UV-Strahlung absorbieren und die Haut bleichen können. Ziel der Arbeit war die Suche nach Substanzen mit diesem Eigenschaften. Deshalb stand die Isolierung und Strukturaufklärung von Inhaltstoffen aus Bengkoang-Wurzeln sowie die Analyse der UV-Absorptionsfähigkeit und Analyse der Hautbleichungs-Fähigkeit der gefundenen Verbindungen im Mittelpunkt der Arbeit. Die Hautbleichungs-Fähigkeit wurde durch die Analyse der antioxidativen Aktivität und Tyrosinase-Inhibitor-Aktivität getestet. Aus Extrakten unterschiedlicher Polarität wurden Sekundärstoffe durch unterschiedliche chromatographische Trenn-Methoden (Säulenchromatographie mit verschiedenen stationären Phasen) isoliert, deren Struktur mittels Massen-spektrometrie und ein- und zweidimensionalen Kernresonanz-Spektroskopie-Experimente aufgeklärt würde. Insgesamt wurden 13 Naturstoffe isoliert, von denen 11 die antioxidative Aktivität haben. Nur ß-Sitosterol und Stigmasterol zeigten keine die antioxidative Aktivität. Drei Verbindungen der Isoflavonoid-Gruppe, nämlich Daidzein, Daidzein-7-O-ß-glucopyranose, 5-hydroxy-daidzein-7-O-ß-glucopyranose und eine Verbindung der Pterocarpan-Gruppe, nämlich (8,9)-Furanyl-pterocarpan-3-ol, wurde aus dem Essigsäureethylacetat-Extrakt isoliert. Alle haben starke Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität mit IC50-Werten von 4.38 mM bis 22.20 mM. Die andere Verbindungen, nämlich 2-Butoxy-2,5-bis(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran aus dem Butanol-Extrakt und 4-(2-(Furan-2-nyl)ethyl)-2-methyl-2,5-dihydrofuran-3-carbaldehyd aus dem Essigsäureethylacetat-Extrakt-nach- Hydrolyse, haben eine Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität mit IC50-Werten von 1.21 mM und 0.20 mM. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Bengkoang viele aktive Verbindungen im Bereich der UV Absorption, antioxidative Aktivität und Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität haben. Deshalb kann Bengkoang für Kosmetik, speziell als Material, das vor UV-Strahlung schützt und die Haut bleicht, verwendet werden.
Candida albicans gehört zu den für den Menschen fakultativ pathogenen Hefepilzen. Der normalerweise harmlose Begleiter der humanen Mikroflora findet sich hauptsächlich auf Schleimhäuten der Mundhöhle und des Magen-Darm-Trakt sowie in der vaginalen Flora. Menschen, deren Immunsystem geschwächt ist, sind jedoch besonders anfällig für Infektionen, die durch den Pilz hervorgerufen werden können. Neben oberflächlichen kann es dabei auch zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen kommen, die nicht selten zum Tod des Patienten führen. Durch ein zunehmendes Auftreten von Resistenzen gegen gebräuchliche Pharmaka besteht aktuell ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen gegen Candida. Die zehn vom Hefepilz exprimierten sekretorischen Aspartatproteasen (SAP1-10), die als wichtige Virulenzfaktoren gelten, stellten sich dabei zunehmend als vielversprechende Targets heraus. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der literaturbekannten cis-konfigurierten 3-Phenylaziridin-2-carboxylate A-07 und A-08 als irreversible Inhibitoren der SAP-Isoenzyme. Die Variation der Substituenten am Aziridinstickstoff für die Adressierung der S3-Tasche im Enzym erfolgte durch Alkyl-, Aryl- und Acylreste. Die Aminosäureester wurden in Konfiguration und Art der Seitenkette modifiziert, um eine Verbesserung der Anpassung an die S1‘-Tasche zu ermöglichen. Die cis-3-Phenylaziridin-2-carboxylate wurden durch Cromwell-Synthese als Racemate erhalten. Aminosäure- und Peptidkupplungen erfolgten mit gängigen Kupplungsreagenzien (PPA, DPPA). Die stereoselektive Synthese des methylenverbrückten Aziridin-2-carboxylats A-10 erfolgte durch Redoxkondensation nach Mukaiyama. Die synthetisierten Verbindungen wurden in einem fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre inhibitorische Wirkung gegen SAP2 getestet. Dabei war das im FRET-Assay bislang an SAP2 verwendete Substrat Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH auch für Testungen an SAP1, 3 & 8 sowie Cathepsin D geeignet. Neben den jeweiligen Km-Werten konnten für diese Enzyme auch die zugehörigen kcat-Werte bestimmt werden. Zur Bestimmung der Hemmkonstanten wurde für die aktiven Verbindungen ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt. 20 der 46 Aziridin-2-carboxylate erreichten SAP2 k2nd-Werte von mindestens 7880 M-1min-1. Die mit k2nd-Werten von 60608 bis 118582 M-1min-1 potentesten Verbindungen wurden durch (R)-Aminosäuresubstitution (A-28, A-31) bzw. durch Cyclohexylmethyl-Verknüpfung am Aziridinstickstoff (A-43, A-45) erhalten. Für die einzelnen Diastereomere von A-31, A-31a und A-31b, wurde eine signifikant unterschiedliche Hemmwirkung festgestellt. Die Inhibitoren zeigten eine zeitabhängige Hemmung, die nach ca. 30 min Inkubationszeit jedoch wieder schwächer wurde. LC-MS- und NMR-Studien lassen einen pseudo-irreversiblen Hemmmechanismus vermuten: Der Inhibitor bindet zunächst irreversibel unter Ringöffnung des Aziridins an das Enzym. Der entstehende Ester wird danach unter den sauren Assaybedingungen wieder hydrolysiert. Der resultierende Aminoalkohol bindet anschließend als Übergangszustandsanalogon reversibel an das Enzym. Selektivitätsstudien an Cathepsin D zeigten für 36 der 46 Aziridin-2-carboxylate k2nd-Werte von 10350 bis 936544 M-1min-1. Damit sind die Verbindungen an CathD aktiver als an SAP2. Die 1-Cyclohexylmethyl-verknüpften Aziridine wiesen auch an CathD die höchsten k2nd-Werte auf, wenngleich sich dabei die (R)-Konfiguration der Aminosäurereste (A-57, A-59) als die aktivere Variante herausstellte. Mit dem (R)-Phe-substituierten 1-tert-Butylaziridin A-58 erreichte der potenteste Vertreter der Reihe bereits einen Ki-Wert im dreistelligen nano-molaren Bereich. Ebenso wurden für die (R)-Aminosäure-Analoga von A-07 und A-08 (A-28, A-31) erhöhte Hemmkonstanten erhalten. Wie SAP2 wird auch CathD durch die (an)getrennten Diastereomere A-31a und A-31b signifikant unterschiedlich stark inhibiert. Mit den (R)-Valin-verknüpften Aziridinen A-81, A-82 und A-85 fanden sich aktive verzweigt-Alkyl-substituierte CathD-Inhibitoren.
Etacrynsäure – ein langjährig eingesetztes Diuretikum – und verschiedene ihrer Derivate sind als nichtpeptidische Inhibitoren von Cystein-Proteasen bekannt. Einige Amid-Derivate besitzen bezüglich des SARS-CoV sowohl enzymhemmende (SARS-CoV-Mpro) als auch antivirale Wirkung. Das elektrophile Strukturfragment des Moleküls, das als Michael-Akzeptor eine Reaktion mit dem active-site Cystein-Rest der Protease eingehen kann, ist die a,b-ungesättigte Carbonyleinheit in der Acyl-Seitenkette. Ausgehend von der Etacrynsäure als Leitstruktur wurden durch Strukturvariationen neue Etacrynsäure-Derivate, bevorzugt Amid-Derivate, dargestellt. Zusätzlich zu diesen Verbindungen wurden außerdem weitere Etacrynsäure-Derivate synthetisiert, die durch Biotin- und Deuterium-Markierung als Modellsubstanzen zum In-vitro-Nachweis des Wirkstoffes in biochemischen und spektroskopischen Assays dienen. Als deuterierte Spezies wurde mit der d9-Etacrynsäure ein hochdeuteriertes Wirkstoff-Analogon dargestellt. Der Grad der Deuterium-Markierung konnte durch Kupplung von d13-n-Hexylamin an die d9-Etacrynsäure noch auf ein d22-Amid-Derivat erweitert werden. Insgesamt konnten neben dem direkten d9-Analogon des Wirkstoffes drei weitere Amid-Derivate erhalten werden. Zur Testung der erhaltenen Substanzen an der SARS-CoV-Mpro war die Synthese eines FRET-Substrats erforderlich. Dafür wurde mittels automatisierter SPPS ein Dekapeptid mit dem FRET-Donor-Akzeptor-Paar Anthranilsäure – Nitrotyrosin hergestellt. Das Substrat besitzt die Sequenz H2N-Abz-Ser-Val-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Tyr(NO2)-Arg(Mts)-COOH. Der Km-Wert für die SARS-CoV-Mpro wurde unter Berücksichtigung des inner filter effect zu 190 ± 23 µM bestimmt. Zur Evaluation der enzymhemmenden Aktivität wurden die synthetisierten Inhibitoren an den drei Enzymen SARS-CoV-Mpro, SARS-CoV-PLpro und Cathepsin L getestet. Als potenteste Inhibitoren wurden das Bromanisol MS07 (Ki = 52.7 µM, SARS-CoV-Mpro) sowie das Norethyl-Derivat der Etacrynsäure MS21 (Ki = 22.8 µM, Cathepsin L) identifiziert. Alle getesteten Verbindungen zeigten an der SARS-CoV-PLpro keine Aktivität. Im Rahmen des SFB 630 wurden mit den synthetisierten Verbindungen weitere Testungen an Bakterien, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei sowie an Makrophagen durchgeführt. Dabei zeigten die Verbindungen MS38, MS40 und MS41 eine besondere Wirksamkeit. Es konnten zwar im Wachstumstest sowie im Biofilmtest Aktivitäten gegen den Bakterienstamm Staphylococcus epidermidis sowie die Hemmung der Biofilmbildung von S. epidermidis festgestellt werden. Die zur Hemmung notwendigen Mindestkonzentrationen lagen oberhalb der Konzentrationen, die auch cytotoxisch auf Makrophagen wirkt. Ähnliches gilt für die Aktivität an L. major. Bezüglich T. b. brucei zeigen diese drei Verbindungen jedoch eine erhöhte Aktivität mit MHK-Werten von < 1 µM. Das bedeutet, dass für eine Hemmung eine Konzentration erforderlich ist, die um Faktor 4 bis 11 unterhalb der cytotoxischen Konzentration liegt. Dieser Wert konnte nur noch durch das Biotin-markierte Derivat MS57 (IC50 T. b. brucei: 0.69 µM; IC50 Makrophagen: 33.8 µM) übertroffen werden. Weitere Untersuchungen mit der Biotin-markierten Verbindung MS57 zeigten zudem eine Hemmung von Falcipain-2 und -3 sowie von Plasmodium falciparum mit IC50-Werten von 3.0 µM (FP-2) 11.9 µM (FP-3) und 9.0 µM (P.f.). Weiterhin konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie eine Bindung von MS57 an FP-2 nachgewiesen werden. Diese findet aber offensichtlich nicht im aktiven Zentrum des Enzyms statt. Die deuterierten Derivate der Etacrynsäure kamen als Modellsubstanzen zur Etablierung eines CARS-Mikroskopie-Assays zur spektroskopischen Wirkstoffdetektion zum Einsatz. Dabei war es bisher möglich, das CARS-Signal der d9-Etacrynsäure in DMSO-Lösung bis zu einer Konzentration von 500 µM zu erfassen. Quantenchemische Berechnungen zur Simulation des Reaktionsmechanismus des active-site-Cystein-Restes der SARS-CoV-Mpro mit Michael-Systemen als elektrophilem warhead zeigten, dass es sich dabei um einen zweistufigen Prozess handelt, bei dem nach erfolgter Deprotonierung des Thiols der Angriff an der Doppelbindung erfolgt. Zudem ergaben die Berechnungen, dass sowohl Halogenarylsubstituenten am Carbonylkohlenstoff sowie exo-konfigurierte Systeme sich energetisch günstig auswirken. Diese Trends konnten durch kinetische NMR-Experimente durch Umsetzung einer Reihe von Modellsubstanzen mit p-Methoxythiophenolat bestätigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass für die betrachteten Systeme die Umsetzung innerhalb von wenigen Minuten, spätestens aber innerhalb von 90 Minuten zu 99 % erfolgt ist.