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Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii gehört zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine (Typ1-Rhodopsine). ChR2 besteht aus einem extrazellulär gelegenen N-Terminus, 7 Transmembranhelices und einem zytosolisch gelegenen C-Terminus. Der lichtreaktive Bestandteil (Chromophor) all-trans-Retinal ist via Schiff´ Base kovalent an ein Lysinrest der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei Applikation von Blaulicht isomerisiert all-trans- zu 13-cis-Retinal, was in einer Konformationsänderung und dem Öffnen des Kanals resultiert. Abhängig vom elektrochemischen Gradienten können ein- und zweiwertige Kationen in die Zelle ein- oder aus der Zelle herausströmen.
Eine retinalabhängige Stabilität konnte bereits für Bakteriorhodopsin (BR) bestätigt werden (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), bezüglich ChR2 waren bisher nur wenige Daten verfügbar (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Die heterologe Expression von wildtypischem und modifiziertem ChR2 in Oozyten von X. laevis erlaubte einen detaillierteren Einblick in die retinalabhängige Stabilität und pH-abhängige Dunkelleitfähigkeit von Guanidinium.
Wildtypisches Chop2 zeigte bei Zugabe von Retinal zum Inkubationsmedium, direkt nach RNA-Injektion, Stromamplituden im µA-Bereich und deutliche Fluoreszenzintensitäten. Ausschließlich endogen vorhandenes Retinal hatte verminderten Fluoreszenzen und Stromamplituden zur Folge, was auf ein geringes Vorhandensein von Chop2-Proteinen in der Plasmamembran hindeutete. Da die Inkubation über Nacht in retinalsupplementierter Lösung nur eine minimale Erhöhung des resultierenden Stromes erbrachte, deuten die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stark auf eine verminderte Stabilität des Proteins bei fehlender Bindung des Kofaktors Retinal.
Das Einfügen einer aromatischen Aminosäure (Y/F/W) an Position 159 führte zu einer, von der Retinalsupplementation unabhängigen, in beiden Ansätzen gleichwertigen Expressionsstärke. Diese äusserte sich in äquivalenten Fluoreszenzintensitäten. Die erhaltenen Stromamplituden wiesen eine starke Differenz auf: ohne Zugabe zusätzlichen Chromophors lag die Stromstärke bei nur wenigen Nanoampere, die bei Inkubation in einer retinalhaltigen Lösung über Nacht auf das Niveau von retinalsupplementierten Oozyten anstieg. Des Weiteren konnte die Zunahme der Stromamplitude innerhalb von 15 Minuten beobachtet werden, wenn die vermessenen Oozyten mit einer retinalhaltigen Lösung perfundiert wurden. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse auf eine Stabilisierung des aromatisch substituierten Proteins hin. Bei der von Berndt et al. (2011) beschriebenen Mutante T159C konnten diese Eigenschaften nicht nachgewiesen werden.
Die Modifikation der Retinalbindestelle (K257) in Verbindung mit einer aromatischen Substitution an Position 159 resultierte in deutlichen Fluoreszenzintensitäten, unabhängig von der Retinalverfügbarkeit bei, in beiden Fällen, fehlenden lichtaktivierten Strömen. Diese und die gleichwertigen Bandenstärken des Proteinimmunoblots von aromatisch substituierten ChR2-Varianten unterstützen die Hypothese der retinalunabhängigen Stabilität zusätzlich.
Die Ergebnisse legen, im Falle von Chop2-WT, eine Degradation des Apoproteins nahe. Bei Einfügen einer aromatischen AS an Position 159 ist das Apoprotein davor geschützt (siehe Abb. 75). Infolge der strukturellen Similarität, dem Vorhandensein delokalisierter π-Elektronen und der räumlichen Größe der aromatischen AS ist eine strukturelle Veränderung des Apoproteins denkbar, die eine Degradation aufgrund von nunmehr unzugänglichen Ubiquitinierungsstellen verhindert.
Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass sich bei fehlender Bindung des Kofaktors Wassermoleküle in der Nähe der Bindetasche befinden, welche von umliegenden Aminosäuren (u.a. T159, D156) unter großem Energieaufwand koordiniert werden und die strukturelle Integrität bis hin zur Degradation beeinträchtigen können. Dies könnte durch eine Erhöhung der Hydrophobizität bei Einfügen einer aromatischen Aminosäure verhindert werden.
Bei Substitutionen durch eine aromatische AS (Y/W/F) an Position 159 zeigte sich ein weiteres, bisher nicht beschriebenes, Charakteristikum. Bei Perfusion der Oozyten mit einer guanidiniumhaltigen Lösung, konnten in Abhängigkeit des pH-Wertes ohne die Applikation von Licht Stöme im µA Bereich aufgezeichnet werden. Die Größe der Stromamplitude korreliert hierbei mit dem Anstieg des pH-Wertes und der Konzentration an Guanidiniumionen der perfundierten Lösung und kann durch das Hinzufügen von 1mM Lanthan reversibel geblockt werden. Des Weiteren konnten die vorgenommenen Messungen die Ergebnisse der retinalabhängigen Degradation verifizieren, da der Einstrom von Gua+ sowohl bei retinalsupplementierter Inkubation, als auch bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal zu beobachten war. Des Weiteren zeigte auch die Doppelmutante T159Y/K257R trotz ihres Unvermögens Retinal zu binden, die beschriebenen lichtunabhängigen Ströme.
Die Ergebnisse bei Substitution durch Phenylalanin (F) stellen eine Abweichung des Musters dar. Bei Inkubation von T159F-injizierten Zellen bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal konnte eine stark erhöhte Guanidiniumleitfähigkeit festgestellt werden, diese kam jedoch bei retinalsupplementierter Inkubation nicht zum Tragen. Dies könnte ein Hinweis auf eine sterische Hinderung durch das gebundene Chromophor sein, die bei den Substitutionen durch Tyrosin und Tryptophan, möglicherweise durch unterschiedliche chemische Eigenschaften der AS, nicht auftreten.
Die hervorgerufene pH-Abhängigkeit kann in zwei möglichen Ursachen begründet liegen:
• Vorhandensein einer (de)protonierbaren Gruppe wie Histidin, Arginin oder Lysin, die als pH-Sensor dienen könnte
• Deprotonierung der Schiff´ Base durch Guandininium
Das Vorhandensein eines pH-Sensors konnte durch die vorgenommenen Modifikationen von H114, R115, R120 und H249 nicht bestätigt werden.
Bei Substitution von K257 (in Verbindung mit T159Y) zu Arginin (R) konnte weiterhin ein pH-abhängiger Gua+-Dunkelstrom festgestellt werden. Die Modifikation zu Alanin (A) oder Glutamin (Q) hingegen resultierte im Ausbleiben der Ströme. Der Austausch einer basischen zu einer neutralen Gruppe ohne protonierbaren Rest deutet auf die Beteiligung der Schiff´ Base bzw. der Aminosäure an Position 257 am Mechanismus der Dunkelleitfähigkeit hin.
Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations.
In ihrer Evolution mussten Pflanzen Strategien entwickeln um sich sowohl gegen Pathogene aus der Luft als auch solche im Boden zu verteidigen. Diese Resistenzmechanismen der Pflanzen zu verstehen ist von höchster Wichtigkeit für die moderne Gesellschaft. Die Weltbevölkerung wächst schnell, was zu der Notwendigkeit führt, die landwirtschaftlichen Flächen möglichst optimal zu nutzen. Ohne die Weiterentwicklung der landwirtschaftlichen Methoden wird eine ausreichende Versorgung mit Grundnahrungsmitteln nicht möglich sein. Obwohl nicht viele Daten zu diesem Thema vorliegen, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein hoher Prozentsatz der jährlichen Ernteverluste auf Pflanzenkrankheiten zurückzuführen ist (Orke et al. 1994, Pinstrup-Andersen; 2001). Der Ernteverlust ist nicht ausschließlich auf den Tod der infizierten Pflanze zurückzuführen, sondern vielmehr auf die sogenannten Resistenzkosten Walters und Heil; 2007). Um sich gegen das Pathogen zu schützen müssen Ressourcen genutzt werden, die sonst für die korrekte Entwicklung der Pflanze, sowie der Samen und Früchte verwendet würden. Die pflanzliche Cuticula, welche die Blattoberfläche bedeckt, ist die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Microorganismen, die durch die Luft verbreitet werden. Um diese Barriere zu umgehen nutzen Bakterien und einige Pilze die Stomata als Eingang in den Apoplasten der Blätter. Dies kann durch die Pflanze allerdings verhindert werden, indem diese Poren geschlossen werden. Diese Schließzellantwort wurde zunächst als Teil der Immunantwort auf Bakterien angesehen (Melotto et al. 2006). Nichtsdestotrotz konnte beobachtet werden, dass die Stomata auch während der Infektion des Mehltaupilzes schließen, obwohl dieser nicht durch die Stomata in das Blatt eindringen. Daher haben wir Einzelzellstudien an intakten Gerstenpflanzen vorgenommen um zu klären, wie die Signale erkannt und weitergeleitet werden, die schließlich zum pathogen-induzierten Stomaschluss führen (Koers et al. 2011). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass der Stomaschluss ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Immunantwort ist. Innerhalb dieser Antwort der Stomata auf durch Wind übertragene Pathogene, spielt die Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle eine entscheidende Rolle. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Immunantwort die Licht-induzierte Inhibierung dieser Anionenkanäle außer Kraft setzt. S-Typ Anionenkanäle sind aber nicht allein in der Pathogenabwehr von Bedeutung, sondern auch in der Reaktion der Pflanzen auf Trockenstress. Es ist jedoch nicht bekannt, in wie weit sich die beiden Signalwege überschneiden. Zusammen mit den neuen mutierten Gerstenlinien, werden die in dieser Arbeit beschriebenen Techniken zur Messung von Einzelzellen tiefere Einsichten in das Zusammenspiel zwischen Trockenstress und Pathogenabwehr in Pflanzen ermöglichen. Die daraus resultierenden Ergebnisse können zur Optimierung von Getreide für die moderne Landwirtschaft genutzt werden. Dies wird einer der wichtigsten Ansätze sein, um die Menschheit auch in Zukunft mit ausreichend Nahrung versorgen zu können.