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This thesis explores the influence of social and environmental cues on the nest building behavior of leaf-cutting ants. Especially, the investigations are aimed at evaluating the mechanisms of nest building and how the nest environment can spatially guide building responses that lead to an adaptive nest architecture. The emergence of nest chambers in the nest of the leaf-cutting ant Acromyrmex lundi were evaluated. Rather than excavating nest chambers in advance, at places where workers encounter suitable environmental conditions for brood and fungus rearing, these items have to be present at a site. When presented in the laboratory with a choice between two otherwise identical digging sites, offering suitable environmental conditions, but one containing brood, the workers displayed a higher excavation activity at the site where they encountered the putative content of a chamber. The shape of the excavated cavity was also more round and chamber-like. It is concluded that leaf-cutting ants respond to social cues during nest building. Excavation is a costly process and colonies have to spend a part of their energy stores on nest building, so that regulatory responses for the control of nest excavation are expected to occur. Worker density at the beginning of the digging process influenced digging activity while the presence of in-nest stores did not. Stored brood and fungus did however influence the architecture of the excavated nest, leading to the excavation of larger chambers and smaller tunnels. While self-organized mechanisms appear to be involved in the nest building process, the social cues of the ants’ environment during building clearly influence the nest architecture and lead to an adjustment of the nest size to the current space needs of the colony. Workers secondarily regulated nest size by the opportunistic refilling of unused space with excavated soil pellets. As the ants should provide suitable conditions for brood and fungus rearing, they should show a behavioral response to CO2 concentrations, as the gas is known to hinder fungus respiration. Workers of A. lundi did indeed avoid high CO2-levels for fungus rearing but actually preferred CO2-values in the range encountered close to the soil surface, where this species excavates their nests. However, different CO2-levels did not affect their excavation behavior. While fungus chambers make up part of a leaf-cutting ant nest, most leaf-cutting ants of the genus Atta also spent part of the colony’s energy on excavating large, voluminous chambers for waste disposal, rather than scattering the material aboveground. It is expected that leaf-cutting ants also show environmental preferences for waste management. In experiments Atta laevigata workers preferred deposition in a warm and dry environment and showed no preference for specific CO2-levels. The continued accumulation of waste particles in a waste chamber seems to be based on the use of volatiles. These originate from the waste itself, and seem to be used as an orientation cue by workers relocating the material. The ensuing large accumulation of waste at one site should result in the emergence of more voluminous chambers for waste disposal.
Volumenregulatorische Transportwege von anorganischen und organischen Osmolyten in Säugetierzellen
(2014)
Die Aufrechterhaltung des Zellvolumens unter variablen osmotischen Bedingungen stellt für nahezu alle tierischen Zellen eine essenzielle Aufgabe dar. Um regulatorische Volumenanpassungen vorzunehmen besitzen sie daher effektive Mechanismen, mit deren Hilfe der zelluläre Gehalt an organischen und anorganischen Osmolyten erhöht (= regulatorische Volumenzunahme; RVI) oder gesenkt (= regulatorische Volumenabnahme; RVD) werden kann. Trotz langjähriger Forschung auf diesem Gebiet konnten die hieran beteiligten Transportwege für Osmolyte bisher nur unvollständig aufgeklärt werden.
Insbesondere bei T-Lymphozyten sind wichtige Zellfunktionen wie die Proliferation, Migration und die T-Zell-Aktivierung eng mit volumenregulatorischen Mechanismen verbunden. Bei all diesen Prozessen sind u. a. unterschiedliche Kaliumkanäle beteiligt, die insbesondere für die pharmakologische Manipulation von Immunsystemprozessen von wissenschaftlichem Interesse sind. Bisherige Modelle der hypotonen Volumenregulation von T-Lymphozyten berücksichtigen lediglich den spannungsabhängigen KV1.3 sowie den Ca2+-aktivierten IKCa1-Kanal, die zur Klasse der 6TM/P-K+-Kanäle gehören.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine potentielle Rolle von kürzlich entdeckten Zwei-Poren Domänen Kaliumkanälen (K2P) am RVD von murinen und humanen primären CD4+-T-Lymphozyten untersucht. In einem kombinierten genetischen und pharmakologischen Ansatz mittels knockout-Tiermodellen und dem Einsatz kanalspezifischer Inhibitoren konnte mithilfe zellvolumetrischer Analysen gezeigt werden, dass die K2P-Vertreter TASK1, TASK2, TASK3 und TRESK maßgeblich am schwellungsaktivierten Efflux von K+ beteiligt sind. Beurteilt an den Ergebnissen dieser Untersuchung sind der spannungsabhängige TASK2- und der Ca2+-aktivierte TRESK-Kanal für die hypotone Volumenregulation in T-Zellen deutlich bedeutender als TASK1 und TASK3. Der Beitrag der Kanäle TASK2 und TRESK am RVD-Prozess war über dies vergleichbar mit dessen des bisher bekannten KV1.3-Kanals. In dieser Arbeit wurde damit erstmals eine Beteiligung der K2P-Kanäle am RVD muriner und humaner CD4+-Lymphozyten identifiziert. Aufgrund der engen Verbindung zwischen T-Zell-Funktion und der Volumenregulation können Zwei-Poren Domänen K+-Kanäle damit in den engeren Kreis potentieller immunmodulierende Angriffspunkte aufgefasst werden.
Im zweiten und umfangreicheren Teil dieser Arbeit wurden darüber hinaus die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte (small organic osmolytes; SOOs) untersucht. SOOs stellen chemisch inerte Verbindungen dar, zu denen vor allem Polyole (Sorbitol, myo-Inositol), Methylamine (Betain, α-Glycerophosphocholin) sowie Aminosäuren (α- bzw. β-Alanin und Prolin) und deren Derivate (Taurin) zählen. Da SOOs weder die zelluläre Struktur noch die Funktion von Makromolekülen beeinträchtigen, sind sie wichtige Instrumente der Volumenregulation, die sich in hohen Konzentrationen im Zytosol nahezu aller Zellen wiederfinden. Werden tierische Zellen mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, dann ist bei nahezu allen Zellen die Freisetzung organischer Osmolyte zu beobachten, wodurch die zelluläre Osmolarität unabhängig von Elektrolyten angepasst werden kann. Trotz der wichtigen Funktion der SOOs in der Osmoregulation tierischer Zellen konnte die molekulare Identität beteiligter Effluxwege (Kanäle bzw. Transporter) bisher nicht aufgeklärt werden.
Ungeachtet der molekularen Identität der SOO-Effluxwege war es aus zahlreichen biotechnologischen Anwendungen zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte eine größenselektive Permeabilität für eine Reihe monomerer Zucker und verwandter Verbindungen aufweisen. Um diese Größenselektivität näher zu charakterisieren, wurde im ersten Schritt die schwellungsaktivierte Membranpermeabilität für eine Reihe strukturell homogener Polyethylenglykole unterschiedlicher Polymerlänge (PEG200–1500; hydrodynamische Radien zwischen ~0,5-1,5 nm) unter iso- und hypotonen Bedingungen in Jurkat-Lymphozyten untersucht. Unter milden hypotonen Bedingungen (200 mOsm) war die Plasmamembran der untersuchten Lymphozyten für PEG300-1500 undurchlässig, was aus der Fähigkeit der Zellen zur hypotonen Volumenregulation geschlossen werden konnte. Darüber hinaus wurde RVD in stark hypotonen Lösungen (100 mOsm) mit PEG600-1500 beobachtet, während PEG300-400 unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen die Volumenregulation der Zellen inhibierten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass starkes hypotones Zellschwellen der Lymphozyten zur Permeabilisierung der Plasmamembran für PEG300-400, nicht jedoch für PEG600-1500, führt. Anhand der hydrodynamischen Radien Rh der verwendeten PEGs konnte ein cutoff-Radius von ~0,74 nm für schwellungsaktivierte Transportwege organischer Osmolyte bestimmt werden. Da diese schwellungsaktivierten Transportwege vielfältig für Zellbeladungstechniken verwendet werden, könnte dieses Ergebnis für zahlreiche biotechnologische und biomedizinische Anwendungen von Interesse sein.
Im zweiten Schritt wurde der Versuch unternommen, potentielle Transportwege für organische Osmolyte im RVD-Prozess molekular zu identifizieren. Da es grundlegend ungeklärt war, wie viele unterschiedliche Transporter bzw. Kanäle am Efflux der zahlreichen organischen Osmolyte beteiligt sind, erfolgte zunächst die vergleichende Analyse des schwellungsaktivierten Membrantransports strukturell verschiedener SOOs einschließlich der Aminosulfonsäure Taurin und des Polyols myo-Inositol. Hierbei wurde erstmals gezeigt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für Taurin und myo-Inositol deutlich unterschiedliche Aktivitätsprofile aufweisen. Während der Taurintransport bereits unter milden hypotonen Bedingungen, d.h. nach einer geringen Absenkung der Osmolalität von 300 auf ~230 mOsm, aktiviert wurde, erfolgte die Aktivierung der Membranpermeabilität für myo-Inositol bei einer viel niedrigeren Osmolalität von ~150 mOsm. Darüber hinaus wiesen die beiden Transportwege unter vergleichbarem hypotonen Stress von 100 mOsm deutlich unterschiedliche Aktivitätsdauern auf (Transport von Taurin ~95 min und myo-Inositol ~40 min). Somit deuteten diese Ergebnisse erstmals auf substrat-spezifische Transportwege für SOOs hin, die voneinander stark abweichende osmotische Aktivierungsprofile besitzen.
Als aussichtsreiche Kandidaten für diese Transportwege wurden zwei Mitglieder der Gruppe der Solute Carrier (SLC) untersucht, die klare Übereinstimmungen mit den gesuchten Transportern für SOOs aufweisen. Daher wurde im Weiteren eine RVD-Beteiligung dieser Transportergruppe mit einer Kombination aus molekularbiologischer und konventioneller bzw. hochaufgelöster mikroskopischen Techniken überprüft. Die semiqantitativen RT-PCR-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dabei, dass die Gentranskription der potentiellen SOO-Transporter SLC5A3 und SLC6A6 in den untersuchten Zelllinien Jurkat, HEK wie auch HepG2-Zellen durch hypotone Bedingungen deutlich verstärkt wird. Hierbei nimmt der zelluläre mRNA-Gehalt der Gene SLC5A3 zwischen 20-60% und SLC6A6 um 30-100% innerhalb von 10-20 min zu, was auf eine potentielle RVD-Beteiligung von SLC-Transportern hindeutet. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde daraufhin die zelluläre Lokalisation des SLC5A3-Transporters unter isotonen und hypotonen Bedingungen mikroskopisch untersucht. Wie anhand der konfokalen lasermikroskopischen Untersuchung zu erkennen ist, findet unter hypotoner Stimulation eine zelluläre Umverteilung des mit EGFP fluoreszenzmarkierten Proteins SLC5A3 statt. Innerhalb von 10 min wird der Transporter dabei von intrazellulären Regionen in Richtung Plasmamembran verlagert. Darüber hinaus konnte mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Technik dSTORM gezeigt werden, dass der Transporter SLC5A3 unter hypotoner Stimulation verstärkt mit der Plasmamembran assoziiert vorliegt. Diese verstärkte Membranassoziation des SLC5A3-Proteins deutet damit auf einen schwellungsinduzierten exozytotischen Einbau des Transporters hin.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit erstmals, dass SLC-Transporter wie SLC5A3, SLC6A6 und vermutlich andere Vertreter der SLC-Superfamilie potentiell am Mechanismus der hypotonen Volumenregulation beteiligt sind. Da SLC-Transporter als wichtige Transportsysteme für Therapeutika angesehen werden und die Mechanismen der Volumenregulation bereits in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen implementiert sind, könnte der hier aufgedeckte Zusammenhang einen Erkenntnisgewinn für zahlreiche biomedizinische Forschungsgebiete darstellen.
Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der
Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl
und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat.
Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen‐zu‐Männchen
Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert.
Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht.
Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten.
Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs
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mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen.
Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben.
Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen.
Organisms have evolved endogenous clocks which allow them to organize their behavior, metabolism and physiology according to the periodically changing environmental conditions on earth. Biological rhythms that are synchronized to daily changes in environment are governed by the so-called circadian clock. Since decades, chronobiologists have been investigating circadian clocks in various model organisms including the fruitfly Drosophila melanogaster, which was used in the present thesis.
Anatomically, the circadian clock of the fruitfly consists of about 150 neurons in the lateral and dorsal protocerebrum, which are characterized by their position, morphology and neurochemistry. Some of these neurons had been previously shown to contain either one or several neuropeptides, which are thought to be the main signaling molecules used by the clock. The best investigated of these neuropeptides is the Pigment Dispersing Factor (PDF), which had been shown to constitute a synchronizing signal between clock neurons as well as an output factor of the clock.
In collaboration with various coworkers, I investigated the roles of three other clock expressed neuropeptides for the generation of behavioral rhythms and the partly published, partly unpublished data are presented in this thesis. Thereby, I focused on the Neuropeptide F (NPF), short Neuropeptide F (sNPF) and the Ion Transport Peptide (ITP). We show that part of the neuropeptide composition within the clock network seems to be conserved among different Drosophila species. However, the PDF expression pattern in certain neurons varied in species deriving from lower latitudes compared to higher latitudes. Together with findings on the behavioral level provided by other people, these data suggest that different species may have altered certain properties of their clocks - like the neuropeptide expression in certain neurons - in order to adapt their behavior to different habitats.
We then investigated locomotor rhythms in Drosophila melanogaster flies, in which neuropeptide circuits were genetically manipulated either by cell ablation or RNA interference (RNAi). We found that none of the investigated neuropeptides seems to be of equal importance for circadian locomotor rhythms as PDF. PDF had been previously shown to be necessary for rhythm maintenance in constant darkness (DD) as well as for the generation of morning (M) activity and for the right phasing of the evening (E) activity in entrained conditions. We now demonstrate that NPF and ITP seem to promote E activity in entrained conditions, but are clearly not the only factors doing so. In addition, ITP seems to reduce nighttime activity. Further, ITP and possibly also sNPF constitute weak period shortening components in DD, thereby opposing the effect of PDF. However, neither NPF or ITP, nor sNPF seem to be necessary in the clock neurons for maintaining rhythmicity in DD.
It had been previously suggested that PDF is released rhythmically from the dorsal projection terminals. Now we discovered a rhythm in ITP immunostaining in the dorsal projection terminals of the ITP+ clock neurons in LD, suggesting a rhythm in peptide release also in the case of ITP. Rhythmic release of both ITP and PDF seems to be important to maintain rhythmic behavior in DD, since constantly high levels of PDF and ITP in the dorsal protocerebrum lead to behavioral arrhythmicity.
Applying live-imaging techniques we further demonstrate that sNPF acts in an inhibitory way on few clock neurons, including some that are also activated by PDF, suggesting that it acts as signaling molecule within the clock network and has opposing effects to PDF. NPF did only evoke very little inhibitory responses in very few clock neurons, suggesting that it might rather be used as a clock output factor. We were not able to apply the same live-imaging approach for the investigation of the clock neuron responsiveness to ITP, but overexpression of ITP with various driver lines showed that the peptide most likely acts mainly in clock output pathways rather than inter-clock neuron communication.
Taking together, I conclude that all investigated peptides contribute to the control of locomotor rhythms in the fruitfly Drosophila melanogaster. However, this control is in most aspects dominated by the actions of PDF and rather only fine-tuned or complemented by the other peptides. I assume that there is a high complexity in spatial and temporal action of the different neuropeptides in order to ensure correct signal processing within the clock network as well as clock output.
The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells.
Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction.
This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda.
The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section.
The consequences of habitat change for human well-being are assumed to be especially extreme in Burkina Faso. The country is located in a highly drought-sensitive zone of West Africa, and small‐scale subsistence farmers may be especially affected if losses of biodiversity lead to changes in ecosystem functioning; many depend on more or less degraded lands for agricultural production.
The overall aim of the present thesis consequently was to characterize the functional traits of soil-organisms which are crucial for a productive and balanced soil environment in the study region – termites and ants. They are true ecosystem engineers whose activity alters the habitat. Through soil-turnover in the course of constructing biogenic structures of varying size and nature (mounds, nests, galleries, soil-sheetings, foraging-holes), they bioturbate huge amounts of soil masses and exert massive effects on soil structure, positively influencing the fertility, stability, aeration and water infiltration rate into soils; and they provide habitats for other species. In sub-Saharan Africa, ants and termites are the only active soil macrofauna during the long dry season; in the sub-Sahel zone of Burkina Faso, termites even represent the only active, quantitatively remarkable decomposers all year round. Since no information was available about the actual diversity of the focal arthropods, I divided the thesis in two main parts: In the first part, a baseline study, I assessed the local termite and ant fauna, and investigated their quantitative and qualitative response to changing habitat parameters resulting from increasing human impact (‘functional response traits’). In the second and applied part, I addressed the impact of the biogenic structures which are important for the restoration of degraded soils (‘functional effect traits’).
Two traditional agricultural systems characteristic for the study region were selected. Each system represented a land-use intensification gradient comprising four distinct habitats now differing in the magnitude of human intervention but formerly having the same initial state. The first disturbance gradient, the temporal cross-section of a traditional soil water conservation technique to restore degraded heavily encrusted, barren soil named Zaï in Ouahigouya (Yatenga province, sub-Sahel zone); the second disturbance gradient, an agriculture type using crop rotation and fallow as nutrient management techniques near Fada N’Gourma (Gourma province, North-Sudanese zone).
No standard protocol existed for the assessment of termite and ant diversity in semi-arid (agro-) ecosystems; two widely accepted standard protocols provided the basis for the newly revised and combined rapid assessment protocol ‘RAP’: the ALL protocol for leaf litter ants of Agosti and Alonso (2000), and the transect protocol for termites in tropical forests of Jones and Eggleton (2000). In each study site, three to four replicate transects were conducted during the rainy seasons (2004—2008).
The RAP-protocol turned out to be very effective to characterize, compare and monitor the taxonomic and functional diversity of termites and ants; between 70% and 90% of the estimated total species richness were collected on all levels (transects, habitats, regions). Together in both regions, 65 ant species (25 genera) and 39 termite species (13 genera) were collected. These findings represent the first records for Burkina Faso. The data indicate a high sensitivity of termites and ants to land-use intensification. The diversity strongly decreased with increasing anthropogenic impact in the North-Sudan region. In total, 53 ant species (23 genera) and 31 termite species (12 genera) were found. Very promising results concerning the recovery potential of the soil-arthropods’ diversity were gathered in the Zaï system. The diversity of both taxa strongly increased with increasing habitat rehabilitation – in total, 41 ant species (16 genera) and 33 termite species (11 genera) were collected. For both taxa significant differences could be noted in the shape of the density variations along the gradient. For instance termites: Fungus-growers showed the greatest adaptability to different management practices. The greatest variations between the habitats were observed in soil and grass-feeding termites. Whole functional groups were missing in heavily impacted habitats, e.g. soil-, grass-, and wood-feeders were absent in the degraded site in the sub-Sahel zone. Several environmental parameters could be identified which significantly explained a great part of the variations in the composition of the arthropods’ communities; they indicate the importance of the habitats’ structural complexity (vegetation structure) and concomitant effects on diurnal temperature and moisture fluctuations, the availability of food sources, and the soil-structure. The diversity of termites in the sub-Sahel region was strongly correlated with the crown-cover percentages, the topsoils’ sand-content, and the availability of litter; in the North-Sudan region with the cumulated woody plant basal area, the topsoils’ clay- and organic matter-content. The parameters identified for ant communities in the Zaï system, were the height of trees, the topsoils’ clay-content and air humidity; in the North-Sudan region the habitats’ crown-cover percentages, the quantity of litter and again the height of trees.
In the second part of the thesis, I first rapidly assessed the (natural) variations in the amount of epigeal soil-structures along the two disturbance gradients in order to judge the relative importance of termites and ants for soil-turnover. The results illustrated impressively that a) in all study sites, termites were the main bioturbators while ant structures were of minor importance for soil turn-over; b) earthworms and grass-feeding termites contributed significantly to soil turn-over in the more humid North-Sudan region; and c) the bioturbated soil mass varied between seasons and years, however, the relative importance of the different taxa seemed to be fairly constant. In the sub-Sahel zone, fungus-growing Odontotermes and Macrotermes species fully take over the important function of bioturbation, leading to the transport of huge amounts of fine-textured soil material to the surface; with increasing habitat restoration, coarse fragments decreased in the upper horizons and became concentrated deeper along the soil profile.
Consequently, in the applied part, I concentrated on the bioturbation activity of fungus-growing termites in the four main stages of the Zaï system: crusted bare soil (initial stage), millet field, young and old forest. In each of the four Zaï sites nine experimental blocks (each comprising four plots of 1m2) were used to stimulate the foraging activity of fungus-growing termites with different, locally available organic materials (Aristida kerstingii hay, Bombax costatum wooden blocks, compost and a control without any organic amendment). The experiment was conducted twice for the duration of four weeks (rainy season 2005, dry season 2006). The plots were regularly checked and the increase of the area covered by sheetings chronologically followed. After four weeks a) all sheeting-soil was collected, air dried and separately weighed according to the different genera, and b) the foraging-holes were counted and their diameter measured. Additionally, c) ponded water infiltration was measured in selected plots, and d) the physicochemical properties of sheeting-soil were analyzed. In case of complete consumption of the offered hay during the experimental 4-weeks-duration, the same procedure (a, b) was followed before adding new hay to the respective plot.
The comparison between the different plots, sites and seasons revealed clearly that hay was the most attractive bait; for each gram of hay removed, Odontotermes brought about 12 g soil to the surface, Macrotermes 4 g. Odontotermes was the only genus attracted by organic material to the degraded area, and was therefore the decisive primary physical ecosystem engineer in the Zaï system, initiating the restoration process. The mass of soil bioturbated in the course of foraging increased strongly from the degraded, barren towards the most rehabilitated reforested site. Combining all 36 experimental plots per Zaï stage, Odontotermes bioturbated 31.8 tons of soil per hectare and month dry season in the degraded area, and 32.4 tons ha-1 mon-1 in the millet fields; both genera moved 138.9 tons ha-1 mon-1 in the young and 215.5 tons ha-1 mon-1 in the old Zaï forest. Few comparable figures were found in the literature. In northern Burkina Faso, both genera constructed 20 tons of sheetings ha-1 mon-1 after mulching with a straw-wood mixture (Mando & Miedema 1997), and in Senegal, around 10 tons ha-1 mon-1 were moved in heavily foraged plots (Rouland et al. 2003). Within a site, soil turn-over and the number of foraging holes created was always highest in hay, followed by compost, then by wood and in the end control. The fungus-growers’ foraging-activity was leading to an enormous increase in surface pore space – after one month of induced foraging activity in hay-plots, the median number of foraging-holes increased from 142 m-2 in the degraded site up to 921 m-2 in the old Zaï forest. The creation of subterranean galleries and macropores significantly increased the water infiltration rate by a mean factor 2–4.
Laboratory analyses revealed that sheeting-soil differed strongly from the respective control soil as well as between the seasons, the food-type covered, and the two genera. Odontotermes-sheetings differed in more parameters than Macrotermes-sheetings, and dry season sheetings differed in more parameters (and more strongly) than rainy season sheetings. In the present study, soil organic matter, carbon and nitrogen contents were significantly increased in all dry season sheetings; in the rainy season mainly in those built on compost. Texture analysis pointed out that both genera used topsoil and soil from deeper horizons in varying mixture ratios, thereby supporting findings of Jouquet et al. (2006).
To summarize, the present thesis contributes to a better understanding of the functional response traits of termites and ants to changing environmental parameters resulting from increasing human impact. The RAP-protocol represents an easy-to-learn and very effective method to representatively characterize, compare and monitor the taxonomic and functional diversity of termites and ants. The experiment has provided conclusive evidence of the importance of the consideration of fungus-growing termites (particularly Odontotermes and Macrotermes species) when aiming to restore infertile, degraded and crusted soils and to maintain a sustainable agricultural production in the Sahel‐Sudanese zone of West Africa.
Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are
likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost.
However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time.
In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data.
I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them.
I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units.
The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model.
I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples.
I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities.
Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems.
I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging.
Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis.
To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading.
To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant.
Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells.
Cord blood hematopoietic stem cells (CB-HSCs) are an outstanding source for the treatment of a variety of malignant and non-malignant disorders. However, the low amount of cells collected per donor is often insufficient for treatment of adult patients. In order to make sufficient numbers of CB-HSCs available for adults, expansion is required. Different approaches were described for HSC expansion, however these approaches are impeded by the loss of engrafting potential during ex vivo culture. Little is known about the underlying molecular mechanisms. Epigenetic mechanisms play essential roles in controlling stem cell potential and fate decisions and epigenetic strategies are considered for HSC expansion. Therefore, this study aimed to characterize global and local epigenotypes during the expansion of human CB-CD34+, a well established CB progenitor cell type, to better understand the molecular mechanisms leading to the culture-associated loss of engrafting potential. Human CB-CD34+ cells were cultured using 2 different cytokine cocktails: the STF cocktail containing SCF, TPO, FGF-1 and the STFIA cocktail, which combines STF with Angiopoietin-like 5 (Angptl5) and Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2). The latter expands CB-HSCs ex vivo. Subsequently, the NOD-scid gamma (NSG) mouse model was used to study the engraftment potential of expanded cells. Engraftment potential achieved by fresh CB-CD34+ cells was maintained when CB-CD34+ cells were expanded under STFIA but not under STF conditions. To explore global chromatin changes in freshly isolated and expanded CB-CD34+ cells, levels of the activating H3K4me3 and the repressive H3K27me3 histone marks were determined by chromatin flow cytometry and Western blot analyses. For analysis of genome-wide chromatin changes following ex vivo expansion, transcriptome profiling by microarray and chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing (ChIP-seq) were performed. Additionally, local chromatin transitions were monitored by ChIP analyses on promoter regions of developmental and self-renewal factors. On a global level, freshly isolated CD34+ and CD34- cells differed in H3K4me3 and H3K27me3 levels. After 7 days of expansion, CD34+ and CD34- cells adopted similar levels of active and repressive marks. Expanding the cells without IGFBP2 and Angptl5 led to a higher global H3K27me3 level. ChIP-seq analyses revealed a cytokine cocktail-dependent redistribution of H3K27me3 profiles. Chemical inhibition of the H3K27 methyltransferase EZH2 counteracted the culture-associated loss of NSG engraftment potential. Collectively, the data presented in this study revealed that by adding epigeneticly active compounds in the culture media we observed changes on a chromatin level which counteracted the loss of engraftment potential. H3K27me3 rather than H3K4me3 may be critical to establish a specific engraftment supporting transcriptional program. Furthermore, I identified a critical function for the Polycomb repressive complex 2-component EZH2 in the loss of engraftment potential during the in vitro expansion of HPSCs. Taken together this thesis provides a better molecular understanding of chromatin changes upon expansion of CB-HSPCs and opens up new perspectives for epigenetic ex vivo expansion strategies.
1. Pollination of sexually reproducing plants requires pollen transfer agents, which can be biotic, abiotic or a combination of biotic and abiotic agents. The dominance of one of pollination system in wild plant communities depends on climatic factors and/or degrees of anthropogenic influences, which have effects on pollinator diversity and pollination function. Anthropogenic activities and climate change are also considered as main causes of ongoing invasion of invasive species into wild and managed habitats which can bring up competition for pollinators with possible negative consequences for the reproduction of co-occurring native plant species.
2. The study aimed to determine pollination systems and pollination limitation of invasive and native plant communities in natural savannah between 870 – 1130 m and semi-natural (managed) grassland between 1300 – 1750 m above sea level; effects of flower density and pollinator abundance on seed production of cross-pollinated and self-pollinated plants; and relationships of bee abundance and the proportion of cross- pollinated plants at the southern slope of Mount Kilimanjaro, Tanzania.
3. Pollinator-exclusion, open pollination and supplemental hand-pollination treatments were applied to 27 plant species in savannah and grassland habitats. Flowers were counted in each clusters based upon their species. Pollinators were sampled by using pan traps. Information-theory-based multi-model averaging and generalized linear mixed effects models were used to identify and analyze the effects of flower density, pollinator abundance, pollination treatments and habitat types on seed production. Regression models were used to determine relationships of altitude with bee abundance, and with proportion of cross-pollinated plants.
4. My results show that mean seed numbers of native plants were significantly lower in pollinator-exclusion treatments than in open-pollination treatments, indicating their reliance on pollinators for reproductive success. In contrast, seed numbers of invasive plants were similar in pollinator-exclusion and open-pollination treatments, demonstrating an ability of reproduction without pollinators. Despite of higher levels of self-pollination in invasive plants, supplemental hand-pollination treatments revealed pollen limitation in grassland and marginally in savannah habitats. There were no significant difference in seed numbers between supplemental hand pollination and open pollination treatments of native plant communities in savannah and grassland, which indicates no pollination limitation in the studied ecological system for native communities. Besides, grassland plants produced comparatively more seeds than savannah plants, however seeds in grasslands were lighter than those of the savannah which may be due to nutrient limitation in grassland.
5. I found 12 cross-pollinated and 15 self-pollinated plants along altitudinal gradient after comparing seeds from pollinator-excluded and open-pollinated experiments. I also found that proportions of cross-pollinated plants and bee abundance simultaneously decreased with increasing altitude. All cross-pollinated plants were native and grew in savannah habitats, with an exception of one species.
6. Neither effects of focal flower density nor a significant interaction between focal flower densities and bee abundance for self-pollinated plants were observed. However, there were effects of focal flower densities and interactions of flower density with bee abundance for cross-pollinated plants. Non-focal flower density has no significant effects on seed production of cross-pollinated and self-pollinated plants.
7. The results show that native plants depend more on cross-pollination than invasive plants, despite of most native plants in managed habitat (grassland) rely on self-pollination for reproduction. The tendency of having more cross-pollinated plants in natural savannah which are in low altitude coincides with other finding that the cross-pollinated plants and bee abundance simultaneously decrease with increasing altitude. Therefore, our findings support the hypotheses that self-fertilization of flowering plants increases with increasing altitude, and pollinator limitation is most pronounced in managed or disturbed habitats. Despite of reduction of pollinators in grassland, only invasive plants experience pollen limitation, which may be due to poor integration with available pollinator networks.
8. I also found bee abundance and flower density are not the main pollination factors required by self-pollinated plants during reproduction. However, focal flower density, which influences pollinator diversity, is more applicable to cross-pollinated plants. Climate change and anthropogenic activities in natural habitats are factors that influence pollinator abundance and functioning, which lead to a shift of mating systems in plant communities so as to assure their reproduction.
Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.
Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.
Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.
Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos.
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.
In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war.
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
The auditory system is an exquisitely complex sensory organ dependent upon the synchronization of numerous processes for proper function. The molecular characterization of hereditary hearing loss is complicated by extreme genetic heterogeneity, wherein hundreds of genes dispersed genome-wide play a central and irreplaceable role in normal hearing function. The present study explores this area on a genome-wide and single gene basis for the detection of genetic mutations playing critical roles in human hearing.
This work initiated with a high resolution SNP array study involving 109 individuals. A 6.9 Mb heterozygous deletion on chromosome 4q35.1q35.2 was identified in a syndromic patient that was in agreement with a chromosome 4q deletion syndrome diagnosis. A 99.9 kb heterozygous deletion of exons 58-64 in USH2A was identified in one patient. Two homozygous deletions and five heterozygous deletions in STRC (DFNB16) were also detected. The homozygous deletions alone were enough to resolve the hearing impairment in the two patients. A Sanger sequencing assay was developed to exclude a pseudogene with a high percentage sequence identity to STRC from the analysis, which further solved three of the six heterozygous deletion patients with the hemizygous, in silico predicted pathogenic mutations c.2726A>T (p.H909L), c.4918C>T (p.L1640F), and c.4402C>T (p.R1468X). A single patient who was copy neutral for STRC and without pathogenic copy number variations had compound heterozygous mutations [c. 2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) and c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. It has been shown that STRC has been previously underestimated as a hearing loss gene. One additional patient is described who does not have pathogenic copy number variation but is the only affected member of his family having hearing loss with a paternally segregating translocation t(10;15)(q26.13;q21.1).
Twenty-four patients without chromosomal aberrations and the above described patient with an USH2A heterozygous deletion were subjected to a targeted hearing loss gene next generation sequencing panel consisting of either 80 or 129 hearing-relevant genes. The patient having the USH2A heterozygous deletion also disclosed a second mutation in this gene [c.2276G>T (p.C759F)]. This compound heterozygous mutation is the most likely cause of hearing loss in this patient. Nine mutations in genes conferring autosomal dominant hearing loss [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21 and twice in MYO1A (DFNA48)] and four genes causing autosomal recessive hearing loss were detected [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3), and USH2A]. Nine normal hearing controls were also included. Statistical significance was achieved comparing controls and patients that revealed an excess of mutations in the hearing loss patients compared to the control group. The family with the GRHL2 c.1258-1G>A mutation is only the second family published worldwide with a mutation described in this gene to date, supporting the initial claim of this gene causing DFNA28 hearing loss. Audiogram analysis of five affected family members uncovered the progressive nature of DFNA28 hearing impairment. Regression analysis predicted the annual threshold deterioration in each of the five family members with multiple audiograms available over a number of years.
Post-translational histone modifications (PTMs) such as methylation of lysine residues influence chromatin structure and function. PTMs are involved in different cellular processes such as DNA replication, transcription and cell differentiation. Deregulations of PTM patterns are responsible for a variety of human diseases including acute leukemia. DOT1 enzymes are highly conserved histone methyltransferases that are responsible for methylation of lysine 79 on histone H3 (H3K79). Most eukaryotes contain one single DOT1 enzyme, whereas African trypanosomes have two homologues, DOT1A and DOT1B, which methylate H3K76 (H3K76 is homologous to H3K79 in other organisms). DOT1A is essential and mediates mono- and di-methylations, whereas DOT1B additionally catalyzes tri-methylation of H3K76. However, a mechanistic understanding how these different enzymatic activities are achieved is lacking. This thesis exploits the fact that trypanosomes possess two DOT1 enzymes with different catalytic properties to understand the molecular basis for the differential product-specificity of DOT1 enzymes. A trypanosomal nucleosome reconstitution system was established to analyze methyltransferase activity under defined in vitro conditions. Homology modeling allowed the identification of critical residues within and outside the catalytic center that modulate product-specificity. Exchange of these residues transferred the product-specificity from one enzyme to the other and revealed regulatory domains adjacent to the catalytic center. This work provides the first evidence that few specific residues in DOT1 enzymes are crucial to catalyze methyl-state-specific reactions. These results have also consequences for the functional understanding of homologous enzymes in other eukaryotes.
Die gängigen therapeutischen Behandlungsmethoden für die verschiedensten Krebserkrankungen zeigen nach wie vor Mängel bezüglich der Effizienz sowie zahlreiche Nebenwirkungen während und nach der Behandlung. Maßgeblich für diese Defizite ist die teilweise geringe Sensitivität der meisten konventionellen diagnostischen Systeme und damit einhergehend die oftmals zu späte Identifikation entarteter Gewebsbereiche. Zur Lösung dieser Problematik bieten onkolytische Vaccinia-Viren einen Ansatz, sowohl die Effizienz der Therapie wie auch die Diagnostik zu verbessern. In beiden Fällen sind die Tumorzell-spezifische Vermehrung der Viren und die Möglichkeit entscheidend, die Viren als Vektorsystem zur Expression therapeutischer oder diagnostischer Fremdgenkassetten zu nutzen.
Um ein auf Vaccinia-Virus-basierendes Reportersystem zum diagnostischen Nachweis von Krebszellen mittels Tiefengewebs-Tomographie bereit zu stellen, wurden die für die murine Tyrosinase (mTyr) und das Tyrosinase-Helferprotein 1 (Tyrp1) kodierenden Gene in das Genom eines onkolytischen Vaccinia-Virus inseriert. Die Tyrosinase ist das Schlüsselenzym der Melaninsynthese. Bereits die solitäre Expression der Tyrosinase führt in der transformierten Zelle zur Melaninproduktion. Das Tyrosinase-Helferprotein 1 ist an der Prozessierung und Stabilisierung der Tyrosinase beteiligt. Bereits in verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Melanin als Reportermolekül für die Magnetresonanz sowie für die multispektrale optoakustische Tomographie einsetzbar ist. Es wurde deswegen angestrebt, die Kombination aus dem therapeutischen Potential des onkolytischen Vaccinia-Virus und der diagnostischen Anwendung des Melanins als Reporter auszunutzen. Sämtliche in dieser Arbeit aufgeführten rekombinanten Vaccinia-Viren (rVACV) wurden von der Firma Genelux Corporation zur Verfügung gestellt und in dieser Arbeit hinsichtlich der therapeutischen Effizienz und des diagnostischen Potentials untersucht. In ersten Zellkultur-Versuchen wurde anhand verschiedener konstitutiv melanogener rVACV-Konstrukte festgestellt, dass die Kombination aus dem Vaccinia-Virus-spezifischen synthetic early/late Promotor und dem Enzym Tyrosinase (GLV-1h327) bzw. den Enzymen Tyrosinase und Tyrosinase-Helferprotein 1 (GLV-1h324) die höchste Melaninsynthese-Rate zeigte. Anschließend wurde mittels der Bestimmung der spektralen Absorption und der Enzymaktivität der viral kodierten Melanin synthetisierenden Enzyme sowie mikroskopischer Analysen gezeigt, dass es mit diesen auf
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Vaccinia-Virus-basierenden melanogenen Reportersystemen möglich ist, die Melaninsynthese in nicht-melanogenen Zellen zu induzieren.
Anhand elektronenmikroskopischer Untersuchungen in Zellkultur und ex vivo konnte gezeigt werden, dass die nach rVACV-Infektion stattfindende Melaninsynthese in den Lysosomen der Wirtszelle abläuft. Eine Analyse der atomaren Zusammensetzung des viral vermittelten Melanins ergab, dass es sich um eine Mischform aus Eu- und Phäomelanin handelt. Dieser Melanin-Mix ähnelte dem Melanin aus Haut und Augen, jedoch lagen an Melanin-gebundene Metallionen in erhöhtem Maß vor...
Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit
Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die
hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können.
Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die
Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte
chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B
werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical
reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin,
505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird
gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der
Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise
durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich.
Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um
das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins
mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht.
Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium
vorliegen.
The contribution of botanical gardens to out-of-school education should be larger than it is currently in Germany. In the curricula of all school types botany plays only a minor role, although plants form the base for all animal life on earth. To increase the attractiveness of botanical gardens for teachers, offers and programs should be created and conducted in didactically sensible manners and allow students an emotional approach towards the topics through trial and experiments. Therefore it is insufficient to conduct guided tours, which are still most common. Student-centered methods, like learning at workstations, or experimental courses, can lead to an improved retention of the contents learned at the out-of-school learning setting. There are, however, methodological differences even within learning at workstations.
In the first part of my study I compared a student- (S) and a teacher-centered (T) type of learning at workstations (chapter III). My intention was to find out, which of both methods results in more positive emotions at the out-of-school learning location and a higher sustainable knowledge increase. Like in all three parts of my study, 8th grade students from so-called “Mittelschulen” and “Realschulen” from Lower Franconia participated in the programs. I evaluated them by using multiple-choice tests assessing the students' knowledge regarding the topic 'plants and water' (see Appendix), following a before-after / control-impact study design. The students' emotions were assessed using the intrinsic motivation inventory directly after the garden visit. Using generalized linear mixed models, I did not find a significant difference between either of the two approaches. A reason for this could be that the students could be practically active in both methods, which made them fairly similar. Given that there was a significant knowledge increase in both methods, and the effort to develop the teacher-centered learning at workstations was much lower, I would suggest to follow that method for educational work in botanical gardens.
Students already have many predefined concepts regarding many topics, especially when these are important in everyday life. These concepts do often not match the scientific state-of-the-art. Still, students bring their so-called 'alternative conceptions' into visits to the botanical garden. According to theory, confronting them with their own conceptions in the light of scientific facts, should foster updating their concepts with scientifically correct additions. To investigate this method regarding my topic 'plants and water', I developed an intervention with experiments on the lotus effect, which also plays a role in everyday life (chapter IV). Topics like the surface tension of the water, which is also found in 6th grade curricula in German schools, were included. Prior to the intervention, I assessed the students' conceptions using questionnaires and used the three most frequent alternative conceptions to develop a multiple-choice test, which was also used in a before-after / control-impact design. A group of students was also confronted with their conceptions during an introductory talk (AC), whereas another was not (NAC). This was conducted in a way, that likely led to dissatisfaction of the students with their own concepts. The analysis of the questionnaires with the Mann-Whitney U test showed, however, no difference between the two groups directly following the treatment. Over longer time, however, the NAC group retained significantly more knowledge. Probably the students confronted with the alternative conceptions remembered the illustrations of these more easily than the scientifically correct view. For some botanical topics it is certainly helpful to include this conceptual change approach, but apparently not for the lotus effect. In this case it is most sensible to focus on the surface structure of water-repellent leaves and fruits, as we describe it in a publication in 'Unterricht Biologie'. For the practical work in botanical gardens I would suggest to rather assess the students' concepts and assumptions in the beginning of an intervention in a botanical garden, especially with respect to feasibility.
In the third part of my study I concentrate on the application of concept maps (chapter V). This method of cross-linking old and newly acquired knowledge is effective, but not very common in Germany, neither in schools, nor in botanical gardens. One group of students followed exclusively a teacher-centered learning at workstations regarding 'plants and water' (NCM), a second group created concept maps directly after the treatment and a second directly before the retention test (CM). The first map was intended to be a means of consolidation, whereas the late map was rather focused on recapitulation of what was learned about six weeks ago. To evaluate that I used the same multiple-choice tests as I did for the first part. The CM group showed a significantly higher knowledge increase, over short and long time-scales, although these students did significantly worse in the pretest than those of the NCM group. Regarding genders, female students profited especially from the first concept map (consolidation), males rather from the second (recapitulation). From the results one can conclude that prominently weaker students benefit from this method. Additionally the gender-related results show that using concept maps multiple times can be beneficial for different types of learners.
In every study there also was a control group (C), which only had to fill out the questionnaires at the same time as the participating students, to account for external factors (like media, etc.).
Especially learning at workstations and concept maps are very appropriate to be conducted at the out-of-school learning location botanical garden and are likely to strongly increase learning success. It is beneficial to mix several methods to achieve the best results in different types of learners. Additionally, when methods in school are mixed with those of out-of-school learning, the education gets more open, practical and colorful. That all resulted in a substantial long-term knowledge gain of all participating students.
Organisms use different resources in different habitat types during their life cycle. Thereby, they connect habitats and provide ecosystem services or disservices in several habitat types. In agricultural landscapes, the spillover of organisms, i.e. movement of an organism and its function from one habitat to another, especially from semi-natural to managed habitats, is one of the most important processes that influence population dynamics and community composition. Importantly, spillover connects habitats not only spatially, but also on different temporal scales, because availability of resources changes over time in agricultural landscapes, e.g. by mass-flowering events of crops, harvesting or crop rotation. Most often, semi-natural habitats are seen as beneficial source of organisms, but also managed habitats can provide valuable resources, and thereby initiate spillover to other habitats. Mass-flowering crops, like oil-seed rape, are such valuable feeding resources for pollinators, and pollinators might spillover from oil-seed rape to other habitats which provide alternative foraging resources. The focus of this dissertation was to evaluate the influence of oil-seed rape on pollinators in agricultural landscapes by studying effects (1) on different temporal scales (from effects during the flowering period of oil-seed rape, Chapter II & IV, to intermediate effects on a second mass-flowering crop, Chapter III, to spillover effects to the flowering period in the next year, Chapter IV), (2) semi-natural (Chapter II) and crop (Chapter III, IV) habitats, and (3) on various pollinator groups which differ in their life cycle (Chapter II, III, IV).
In this dissertation effects from oil-seed rape on all temporal scales – in the short term during mass-flowering and in the long term on a late-flowering crop and even in the next year on oil-seed rape fields ─ were found. These effects might be important for crop and wild plant pollination, and pollinator conservation. Importantly, the effects on different temporal scales depend on the considered habitat (managed or different semi-natural habitats) and on the investigated pollinator group. The more pollinators match the flowering period of oil-seed rape in their activity period and the more dependent they are on flowering resources in their life cycle, the more pronounced are their responses. Effects were found for wild bees, but not for hoverflies and honey bees. Moreover, the availability of semi-natural habitats in the landscape is important and may modulate effects from oil-seed rape. The longevity of effects of oil-seed rape shows the importance of including several temporal scales into ecosystem-service studies, not only for pollinators, but also for other ecosystem-service providing species groups.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend.
Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms.
During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation.
KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation.
In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells.