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Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden.
In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine….