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This study was conducted to determine the influence of different stress factors on the honeybee Apis mellifera. The investigation was motivated by previous experiments that suggested the existence of an unspecific defense mechanism causing a generalized change of flight behavior after the onset of different diseases. This mechanism is thought to impede the ability of flight bees to return to their respective colonies thereby removing the disease from the colony over time. During the last years, the existence of such a “suicidal behavior” was supported by further studies. Thus, an unnoticed, potentially highly effective defense mechanism of social insects was revealed whose spectrum of activity and physiological basics require further investigation. Suggesting that the reaction by the bees is unspecific to different diseases as well as to other potential stress factors, this study was designed to investigate the influence of pathogens, insecticides, and different brood rearing temperatures on different parameters like lifespan, foraging activity, and foraging trip duration of worker bees.
Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten.
Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine.
Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.
Characterisation of Metalloprotease-mediated EGFR Signal Transactivation after GPCR Stimulation
(2011)
In the context of metalloprotease-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, different monoclonal antibodies against ADAM17 / TACE were characterized for their ability to block the sheddase. Activity of some of them was observed at doses between 2µg/mL and 10µg/mL. Kinetic analyses showed their activity starting at around 30 minutes. In cellular assays performed with the antibodies, especially upon treatment of cells with sphingosine-1-phosphate a reduction in proliferation was observed with some candidates. Moreover this study provides potential new roles for ß-Arrestins. Their involvement in the triple membrane-passing signal pathway of EGFR transactivation was shown. Furthermore, in overexpressing cellular model systems, an interaction between ADAM17 and ß-Arrestin1 could be observed. Detailed analysis discovered that phosphorylation of ß-Arrestin1 is crucial for this interaction. Additionally, the novel mechanism of UV-induced EGFR transactivation was extended to squamous cell carcinoma. The mechanism happens in a dose dependent manner and requires a metalloprotease to shed the proligand Amphiregulin. The involvement of both ADAM9 and ADAM17, being the metalloproteases responsible for this cleavage, was shown for SCC9 cells.
Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen.
Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker.
Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel für eine PI3K-abhängige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung führt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die Fähigkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehomöostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell für Usp28 charakterisiert. Mäuse mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensfähig, fertil und phänotypisch unauffällig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie Überleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verlängert.
Although age is one of the most salient and fundamental aspects of human faces, its processing in the brain has not yet been studied by any neuroimaging experiment. Automatic assessment of temporal changes across faces is a prerequisite to identifying persons over their life-span, and age per se is of biological and social relevance. Using a combination of evocative face morphs controlled for global optical flow and functional magnetic resonance imaging (fMRI), we segregate two areas that process changes of facial age in both hemispheres. These areas extend beyond the previously established face-sensitive network and are centered on the posterior inferior temporal sulcus (pITS) and the posterior angular gyrus (pANG), an evolutionarily new formation of the human brain. Using probabilistic tractography and by calculating spatial cross-correlations as well as creating minimum intersection maps between activation and connectivity patterns we demonstrate a hitherto unrecognized link between structure and function in the human brain on the basis of cognitive age processing. According to our results, implicit age processing involves the inferior temporal sulci and is, at the same time, closely tied to quantity decoding by the presumed neural systems devoted to magnitudes in the human parietal lobes. The ventral portion of Wernicke’s largely forgotten perpendicular association fasciculus is shown not only to interconnect these two areas but to relate to their activations, i.e. to transmit age-relevant information. In particular, post-hoc age-rating competence is shown to be associated with high response levels in the left angular gyrus. Cortical activation patterns related to changes of facial age differ from those previously elicited by other fixed as well as changeable face aspects such as gender (used for comparison), ethnicity and identity as well as eye gaze or facial expressions. We argue that this may be due to the fact that individual changes of facial age occur ontogenetically, unlike the instant changes of gaze direction or expressive content in faces that can be “mirrored” and require constant cognitive monitoring to follow. Discussing the ample evidence for distinct representations of quantitative age as opposed to categorical gender varied over continuous androgyny levels, we suggest that particular face-sensitive regions interact with additional object-unselective quantification modules to obtain individual estimates of facial age.
HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts.
Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen.
SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner
(2011)
Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1.
There is more and more evidence for the cancer stem cell hypothesis which believes that cancers are driven by a cellular subcomponent that has stem cell properties which is self-renewal, tumorigenicity and multilineage differentiation capacity. Cancer stem cells have been connected to the initiation of tumors and are even found to be responsible for relapses after apparently curative therapies have been undertaken. This hypothesis changes our conceptual approach of oncogenesis and shall have implications in breast cancer prevention, detection and treatment, especially in metastatic breast cancer for which no curative treatment exists. Given the specific stem cell features, novel therapeutic pathways can be targeted. Since the value of vaccinia virus as a vaccination virus against smallpox was discovered by E. Jenner at 18th century, it plays an important role in human medicine and molecular biology. After smallpox was successfully eradicated, vaccinia virus is mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The outstanding capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes which encode therapeutic or diagnostic proteins to be expressed when a tumor is infected. The emphasis in this study was the establishment of methods for the enrichment of human breast cancer stem-like cells from cancer cell lines and characterization of those cancer stem-like cells in vitro and in vivo. Furthermore, by using the Genelux Corporation vaccinia virus strain GLV-1h68, the isolated cancer stem-like cells can be targeted not only in vitro but also in vivo more efficiently. Side-population (SP) cells within cancers and cell lines are rare cell populations known to be enriched cancer stem-like cells. In this study, we used Hoechst 33342 staining and flow cytometry to identify SP cells from the human breast cancer cell lines MCF-7 and GI-101A as models for cancer stem-like cells. Considering the cytotoxicity of Hoechst dye and the restriction of instrument, we did not carry out further studies by this method. Utilizing in vitro and in vivo experimental systems, we showed that human breast cancer cell line GI-101A with aldehyde dehydrogenase activity (ALDH) have stemlike properties. Higher ALDH activity identifies the tumorigenic cell fraction which is capable of self-renewal and of generating tumors that could recapitulate the heterogeneity of the parental tumor. Furthermore, the cells with higher ALDH activity display significant resistance to chemotherapy and ionizing radiation, which proves their stem-like properties again. The cells which have higher ALDH activity also are more invasive compared to cells which have lower ALDH activity, which connects the cancer stem-like cells with cancer metastases. By analyzing the popular human breast cancer stem cells surface markers CD44, CD49f and CD24, it was discovered that the cells with higher ALDH activity have stronger CD44 and CD49f expression than in those cells with lower ALDH activity, which further confirms their stem-like properties. Finally, the cells with higher ALDH activity and lower ALDH activity were infected in vitro and used in virotherapy in a mouse xenograft model was performed. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 can replicate in cells with higher ALDH activity more efficiently than cells with lower ALDH activity. GLV-1h68 also can selectively target and eradicate the xenograft tumors which were derived from cells with higher ALDH activity. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key developmental program that is often activated during cancer invasion and metastases. EMT was induced in immortalized human mammary epithelial cells (HMLEs) and in GI-101A cells, which results in the acquisition of mesenchymal traits and in the expression of stem cell markers. Furthermore, the EMT-induced GI-101A cells showed resistance to chemotherapy and invasion capacity. CD44+/CD24- cells were enriched during the EMT induction. Following flow cytometry sorting by using CD44, CD24 and ESA surface marker, the sorted cells were tested in a mouse model regarding tumorigenicity. Unexpectedly, we found that CD44+/CD24+/ESA+ cells could initiate tumors more efficiently rather than CD44+/CD24-/ESA+ and other fractions in EMTinduced GI-101A cells. We also infected the CD44+/CD24+/ESA+ and CD44+/CD24- /ESA+ cells in vitro and performed virotherapy in a mouse xenograft model. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 is able to replicate in CD44+/CD24+/ESA+ cells more efficiently than in CD44+/CD24-/ESA+ cells. GLV-1h68 was also capable to selectively target and eradicate the xenograft tumors which derived from CD44+/CD24+/ESA+ cells. Moreover, CD44- cells have much lower tumorigenicity in the mouse model and CD44- cells derived-tumors are not responsive to vaccinia virotherapy. In summary, we have successfully established an in vitro and in vivo system for the identification, characterization and isolation of cancer stem-like cells from the human breast cancer cell line GI-101A by using the ALDEFLUOR assay. The vaccinia virus GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the higher ALDH activity cells and tumors derived from those cells. Although contrary to the current assumption, CD44+/CD24+/ESA+ cells in the EMT-induced GI-101A cell line showed stem-like properties and GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the CD44+/CD24+/ESA+ cells and tumors which derived from those cells. Finally, improved understanding of cancer stem cells may have tremendous relevance for how cancer should be treated. It is menacing that cancer stem cells are resistant to almost all anti-tumor approaches which have already been established for the treatment of metastatic diseases such as ionizing radiation, hormonal therapy, chemotherapy, and small molecular inhibitors. Therefore, it is promising that our results suggest that these cancer stem cells may be susceptible to treatment with oncolytic vaccinia virus.
Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten.
Molecular modelling and simulation are powerful methods in providing important in-formation on different biological systems to elucidate their structural and functional proper-ties, which cannot be determined in experiment. These methods are applied to analyse versa-tile biological systems: lipid membrane bilayers stabilized by an intercalated single wall carbon nanotube and retroviral proteins such as HIV protease and integrase. HIV-1 integrase has nuclear localization signals (NLS) which play a crucial role in nuclear import of viral preintegration complex (PIC). However, the detailed mechanisms of PIC formation and its nuclear transport are not known. Previously it was shown that NLSs bind to the cell transport machinery e.g. proteins of nuclear pore complex such as transportins. I investigated the interaction of this viral protein HIV-1 integrase with proteins of the nuclear pore complex such as transportin-SR2 (Shityakov et al., 2010). I showed that the transportin-SR2 in nuclear import is required due to its interaction with the HIV-1 integrase. I analyzed key domain interaction, and hydrogen bond formation in transportin-SR2. These results were discussed in comparison to other retroviral species such as foamy viruses to better understand this specific and efficient retroviral trafficking route. The retroviral nuclear import was next analyzed in experiments regarding the retroviral ability to infect nondividing cells. To accomplish the gene transfer task successfully, ret-roviruses must efficiently transduce different cell cultures at different phases of cell cycle. However, promising and safe foamy viral vectors used for gene transfer are unable to effi-ciently infect quiescent cells. This drawback was due to their inability to create a preintegra-tion complex (PIC) for nuclear import of retroviral DNA. On the contrary, the lentiviral vec-tors are not dependant on cell cycle. In the course of reverse transcription the polypurine tract (PPT) is believed to be crucial for PIC formation. In this thesis, I compared the transduction frequencies of PPT modified FV vectors with lentiviral vectors in nondividing and dividing alveolar basal epithelial cells from human adenocarcinoma (A549) by using molecular cloning, transfection and transduction techniques and several other methods. In contrast to lentiviral vectors, FV vectors were not able to effi-ciently transduce nondividing cell (Shityakov and Rethwilm, unpublished data). Despite the findings, which support the use of FV vectors as a safe and efficient alternative to lentiviral vectors, major limitation in terms of foamy-based retroviral vector gene transfer in quiescent cells still remains. Many attempts have been made recently to search for the potential molecules as pos-sible drug candidates to treat HIV infection for over decades now. These molecules can be retrieved from chemical libraries or can be designed on a computer screen and then synthe-sized in a laboratory. Most notably, one could use the computerized structure as a reference to determine the types of molecules that might block the enzyme. Such structure-based drug design strategies have the potential to save off years and millions of dollars compared to a more traditional trial-and-error drug development process. After the crystal structure of the HIV-encoded protease enzyme had been elucidated, computer-aided drug design played a pivotal role in the development of new compounds that inhibit this enzyme which is responsible for HIV maturation and infectivity. Promising repre-sentatives of these compounds have recently found their way to patients. Protease inhibitors show a powerful sustained suppression of HIV-1 replication, especially when used in combi-nation therapy regimens. However, these drugs are becoming less effective to more resistant HIV strains due to multiple mutations in the retroviral proteases. In computational drug design I used molecular modelling methods such as lead ex-pansion algorithm (Tripos®) to create a virtual library of compounds with different binding affinities to protease binding site. In addition, I heavily applied computer assisted combinato-rial chemistry approaches to design and optimize virtual libraries of protease inhibitors and performed in silico screening and pharmacophore-similarity scoring of these drug candidates. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease bind-ing ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is dis-cussed (Shityakov and Dandekar, 2009). A number of atomistic models were developed to elucidate the nanotube behaviour in lipid bilayers. However, none of them provided useful information for CNT effect upon the lipid membrane bilayer for implementing all-atom models that will allow us to calculate the deviations of lipid molecules from CNT with atomistic precision. Unfortunately, the direct experimental investigation of nanotube behaviour in lipid bilayer remains quite a tricky prob-lem opening the door before the molecular simulation techniques. In this regard, more de-tailed multi-scale simulations are needed to clearly understand the stabilization characteristics of CNTs in hydrophobic environment. The phenomenon of an intercalated single-wall carbon nanotube in the center of lipid membrane was extensively studied and analyzed. The root mean square deviation and root mean square fluctuation functions were calculated in order to measure stability of lipid mem-branes. The results indicated that an intercalated carbon nanotube restrains the conformational freedom of adjacent lipids and hence has an impact on the membrane stabilization dynamics (Shityakov and Dandekar, 2011). On the other hand, different lipid membranes may have dissimilarities due to the differing abilities to create a bridge formation between the adherent lipid molecules. The results derived from this thesis will help to develop stable nanobiocom-posites for construction of novel biomaterials and delivery of various biomolecules for medi-cine and biology.
This work delves into the recently developed ‘Whedo’-aquaculture-system in the rural community of Malanville (North Benin)and aims on providing a closer insight on this – for the area--recent system including the ecological but also the sociological and economical aspects in order to develop this extensive traditional fishery to a more productive semi-intensive aquaculture system. With the retreat of the flood ‘Whedos’ usually become infested with numerous hydato-and tenagophytes, while the presence and density of the free-floating macrophytes were positively related to the nutrient content of the ‘Whedo’. Extensive plant infestation also affects water quality through the decomposition of organic material and its accumulation in thick mud layers on the pond bottom as well as through the nocturnal oxygen consumption. Unfavourable water quality, especially low dissolved oxygen as well as high conductivity and nitrite levels, was identified to be the main factor determining which fish species were able to survive the harsh conditions prevailing in the ‘Whedos’ during the dry season. With the deteriorating water quality with advancing dry season, fish diversity decreased significantly leaving only species that are highly adapted to such unfavourable conditions. The most abundant species were Clarias gariepinus, Heterotis niloticus, Oreochromis niloticus L., Hemichromis c.f. letourneauxi, Polypterus senegalus and Epiplatys spilargyreius. Besides, the investigations also concentrated on the fish diversity of the rivers Niger and Sota with the results that for three species distribution gaps could be closed and for further three species their already known distribution could be expanded. But otherwise it could also be detected that some economically important species that were abundant in the past. In regard to the ‘Whedo’-management, the investigations showed that the owners lack most of the knowledge on appropriate management strategies, e.g. the feeding and stocking regime. The exploitation period depends on the extent of the previous annual flood and the location of the ‘Whedo’ within the floodplain, but the main season is from February to April. The biomass harvested on a hectare basis separated for each of the ‘Whedos’ averaged 17 tons/ha in 2008 and 8.6 tons/ha in 2009. However, 72 percent of the total biomass of Clarias only had an average weight of 40 grams. Therefore, two separated feeding trials were conducted and in total 6 supplementary feeds were tested on Clarias gariepinus. Groundnut cake, fish trash, rice bran, blood meal and azolla meal were used in different combination and rations to formulate the experimental diets. Diet containing 19 percent blood meal resulted in the best economical benefits showing that the use of high quality feed ingredients such as groundnut cake is not recommendable because local fish prices are too low to compensate the additional feeding costs. Instead of high quality feed farmers should focus on ingredients that are free of charge and easy to process. The supplementation based on 19 percent blood meal resulted in the doubling of the net profit compared to the income based on feeding only rice bran, thus provided higher additional income, enhancing the livelihood of the fish farmers. Concluding, the ‘Whedo’-aquaculture system is still in its infancy but nevertheless is an attractive system for the rural population because of existing knowledge of post-flood wetland fisheries as well as the low investment needed for its installation. Additionally, the local fish supply will increase and hence not only contribute to a better provision of protein-rich food and reduced pressure on the wild fish stocks but might also prevent fish prices to increase in a way that the poor won’t be able anymore to afford their most important source of animal protein. But fish farmers need more knowledge on appropriate management strategies and thus should be provided with technical support to guarantee a successful development and not to discourage the owners as a consequence of avoidable failures. Furthermore, the use of supplementary feed offers a cheap and effective means to increase the biomass production and thus enhance the extensive fishery to a semi-intensive aquaculture system.
Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2-actin nucleators. A C-terminal modified FYVE zinc finger motif is necessary to target Spir proteins towards intracellular membranes. The function and regulation of the Spir actin organizers at vesicular membranes is almost unknown. Live cell imaging analyses performed in this study show that Spir-2 is localized at tubular vesicles. Cytoplasmic Spir-2-associated vesicles branch and form protrusions, which can make contacts to the microtubule network, where the Spir-2 vesicles stretch and slide along the microtubule filaments. The analysis of living HeLa cells expressing eGFP-tagged Spir-2, Spir-2-ΔKIND and Spir-2-ΔKW (lacking the 4 WH2 domains and the KIND domain) showed Spir-2-associated tubular structures which differ in their length and motility. Throughout the course of that study it could be shown that the tail domain of the actin motor protein myosin Vb, as a force-generating molecule, is colocalizing and co-immunoprecipitating with Spir-2-ΔKW. By using the tail domain of myosin Vb as a dominant negative mutant for myosin Vb-dependent vesicle transport processes it could be shown that Spir-2-ΔKW/MyoVb-cc-tail- associated vesicles exhibit an increased elongation. Moreover, using the microtubule depolymerizing drug nocodazole it could be shown that the elongation and the motility of Spir-2-ΔKW-associated vesicles depends on an intact microtubule cytoskeleton. Motility and morphological dynamics of Spir-2-associated vesicles is therefore dependent on actin, actin motorproteins and microtubule filaments. These results propose a model in which myosin/F-actin forces mediate vesicle branching, allowing the vesicles to move to and in between the microtubule filaments and thereby providing a new degree of freedom in vesicular motility. To determine the exact subcellular localization of Spir-2, colocalization studies were performed. It could be shown that Spir-2 shows a partial colocalization to Rab11a-positive compartments. Furthermore, Spir-2 exhibits an almost identical localization to Arf1 and the Arf1 small G protein but not Rab11a could be immunoprecipitated with Spir-2-ΔKW. This suggests, that Arf1 recruits Spir-2 to Arf1/Rab11a-positive membranes. Another important function of the Spir-2 C-terminus is the membrane targeting by the FYVE domain. By performing a protein-lipid overlay assay, it has been shown that purified GST- and 6xHis-tagged Spir-2-ΔKW bind phosphatidic acid suggesting a mechanism in which Spir-2 is recruited to phosphatidic acid-enriched membranes. To further elucidate the mechanism in which Spir-2 membrane-targeting could be regulated, interaction studies of C-terminal parts of Spir-2 revealed that the Spir-2 proteins interact directly.
The Ecology and Population structure of the invasive Yelllow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes
(2011)
The invasive Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes is a widespread tropical ant species which is particularly common in anthropogenically disturbed habitats in South-East Asia and the Indopacific region. Its native range is unknown, and there is little information concerning its social structure as a potential mechanism facilitating invasion as well as its ecology in one of the putative native ranges, South-East Asia. Using mitochondrial DNA sequences, I demonstrated that the majority of the current Indopacific colonies were likely introduced from South-East Asian populations, which in turn may have been introduced much earlier from a yet unidentified native range. By conducting behavioral, genetic and chemical analyses, I found that A. gracilipes supercolonies contain closely related individuals, thus resembling enlarged versions of monogynous, polydomous colonies of other ant species. Furthermore, mutually aggressive A. gracilipes supercolonies were highly differentiated both genetically and chemically, suggesting limited or even absent gene flow between supercolonies. Intranidal mating and colony-budding are most likely the predominant, if not the exclusive mode of reproduction and dispersal strategy of A. gracilipes. Consequently, a positive feedback between genetic, chemical and behavioral traits may further enhance supercolony differentiation though genetic drift and neutral evolution. This potential scenario led to the hypothesis that absent gene flow between different A. gracilipes supercolonies may drive them towards different evolutionary pathways, possibly including speciation. Thus, I examined one potential way by which gene flow between supercolonies of an ant species without nuptial flights may be maintained, i.e. the immigration of sexuals into foreign supercolonies. The results suggest that this option of maintaining gene flow between different supercolonies is likely impaired by severe aggression of workers towards allocolonial sexuals. Moreover, breeding experiments involving males and queens from different supercolonies suggest that A. gracilipes supercolonies may already be on the verge of reproductive isolation, which might lead to the diversification of A. gracilipes into different species. Regarding the ecological consequences of its potential introduction to NE-Borneo, I could show that A. gracilipes supercolonies may affect the local ant fauna. The ant community within supercolonies was less diverse and differed in species composition from areas outside supercolonies. My data suggest that the ecological dominance of A. gracilipes within local ant communities was facilitated by monopolization of food sources within its supercolony territory, achieved by a combination of rapid recruitment, numerical dominance and pronounced interspecific aggression. A. gracilipes’ distribution is almost exclusively limited to anthropogenically altered habitat, such as residential and agricultural areas. The rate at which habitat conversion takes place in NE-Borneo will provide A. gracilipes with a rapidly increasing abundance of suitable habitats, thus potentially entailing significant population growth. An potentially increasing population size and ecological dominance, however, are not features that are limited to invasive alien species, but may also occur in native species that become ‘pests’ in an increasing abundance of anthropogenically altered habitat. Lastly, I detected several ant guests in supercolonies of A. gracilipes. I subsequently describe the relationship between one of them (the cricket Myrmecophilus pallidithorax) and its ant host. By conducting behavioral bioassays and analyses of cuticular hydrocarbon (CHC) profiles, I revealed that although M. pallidithorax is attacked and consumed by A. gracilipes whenever possible, it may evade aggression from its host by a combination of supreme agility and, possibly, chemical deception. This thesis adds to our general understanding of biological invasions by contributing species-specific data on a previously understudied invasive organism, the Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes. Introductions which may have occurred a long time ago may make it difficult to determine whether a given species is an introduced invader or a native pest species, as both may have pronounced ecological effects in native species communities. Furthermore, this thesis suggests that supercolonialism in invasive ants may not be an evolutionary dead end, but that it may possibly give rise to new species due to reproductive boundaries between supercolonies evoked by peculiar mating and dispersal strategies.
Stroke, after myocardial infarction and cancer is the third most common cause of death worldwide and 1/6th of all human beings will suffer at least one stroke in their lives. Furthermore, it is the leading cause for adult disability with approximately one third of patients who survive for the next 6 months are dependent on others. Because of its huge socioeconomic burden absorbing 6% of all health care budgets and with the fact that life expectancy increases globally, one can assume that stroke is already, and will continue to be, the most challenging disease. Ischemic stroke accounts for approximately 80% of all strokes and results from a thrombotic or embolic occlusion of a major cerebral artery (most often the middle cerebral artery, MCA) or its branches Following acute ischemic stroke, the most worrisome outcome is the rapidly increasing intra-cranial pressure due to the formation of space-occupying vasogenic oedema which can have lethal consequences. Permeability changes at the Blood-Brain Barrier (BBB) usually accompanies the oedematous development and their time course can provide invaluable insight into the nature of the insult, activation of compensatory mechanisms followed by long term repair. Rodent models of focal cerebral ischemia have been developed and optimized to mimic human stroke conditions and serve as indispensable tools in the field of stroke research. The presented work constituting of three separate but complete works by themselves are sequential, where, the first part was dedicated to the establishment of non-invasive small animal imaging strategies on a 3 tesla clinical magnetic resonance scanner. This facilitated the longitudinal monitoring of pathological outcomes following stroke where identical animals can serve as its own control. Tissue relaxometric estimations were carried out initially to derive the transverse (T2), longitudinal (T1) and the transverse relaxation time due to magnetic susceptibility effects (T2*) at the cortical and striatal regions of the rodent brain. Statistically significant differences in T2*-values could be found between the cortex and striatal regions of the rodent brain. The derived tissue relaxation values were considered to modify the existing imaging protocols to facilitate the study of the rodent model of ischemic stroke. The modified sequence protocols adequately characterized all the clinically relevant sequels following acute ischemic stroke, like, the altered perfusion and diffusion characteristics. Subsequent to this, serial magnetic resonance imaging was performed to investigate the temporal and spatial relationship between the biphasic nature of BBB opening and, in parallel, the oedema formation after I/R injury in rats. T2-relaxometry for oedema assessment was performed at 1 h after ischemia, immediately following reperfusion, and at 4, 24 and 48 hours post reperfusion. Post-contrast T1-weighted imaging was performed at the last three time points to assess BBB integrity. The biphasic course of BBB opening with significant reduction in BBB permeability at 24 hours after reperfusion was associated with a progressive expansion of leaky BBB volume, accompanied by a peak ipsilateral oedema formation. At 48 hours, the reduction in T2-value indicated oedema resorption accompanied by a second phase of BBB opening. In addition, at 4 hours after reperfusion, oedema formation could also be detected at the contralateral striatum which persisted to varying degrees throughout the study, indicative of widespread effects of I/R injury. The observations of this study may indicate a dynamic temporal shift in the mechanisms responsible for biphasic BBB permeability changes, with non-linear relations to oedema formation. Two growth factor peptides namely pigment epithelium derived factor (PEDF) and epidermal growth factor (EGF) with widely different trophic properties were considered for their beneficial effects, if any, in the established rodent model of I/R injury and studied up to one week employing magnetic resonance imaging. Both the selected, trophic factors demonstrated significant neuroprotection as demonstrated by a reduction in infarct volume, even though PEDF was found to be the most potent one. PEDF also demonstrated significant attenuation of oedema formation in comparison to both the control and EGF groups, even though EGF could also demonstrate oedema suppression. In the present work, we noticed that interventions with macromolecule protein/peptides by itself could mediate remote oedema at distant sites even though the significance of such an observation is not clear at present. Susceptibility (T2*) weighted tissue relaxometric estimations were considered at the infarct region to detect any metabolic changes arising out of any neuroprotection and/or cellular proliferation / neurogenesis. PEDF group demonstrated a striking reduction of the T2*-values, which is indicative of an increased metabolic activity. Moreover, all the groups (Control, EGF and PEDF) demonstrated significantly elevated T2*-values at the contralateral striatum, which is indicative of widespread metabolic suppression usually associated with a variety of traumatic brain conditions. Moreover, as expected from the properties of PEDF, it demonstrated an extended BBB permeability suppression throughout the duration of the study. This study underlines the merits of considering non-invasive imaging strategies without which it was not possible to study the required parameters in a longitudinal fashion. All the observations are adequately supported by reasonably well defined mechanisms and needs to be further verified and confirmed by an immunohistochemical study. These results also need to be complemented by a functional study to evaluate the behavioural outcome of animals following these treatments. These studies are progressing at our laboratory and the results will be duly published afterwards.
Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp.
An animal depends heavily on its sense of smell and its ability to form olfactory associations as this is crucial for its survival. This thesis studies in two parts about such associative olfactory learning in larval Drosophila. The first part deals with different aspects of odour processing while the second part is concerned with aspects related to memory and learning. Chapter I.1 highlights how odour intensities could be integrated into the olfactory percept of larval Drosophila. I first describe the dose-effect curves of learnability across odour intensities for different odours and then choose odour intensities from these curves such that larvae are trained at intermediate odour intensity, but are tested for retention with either that trained intermediate odour intensity, or with respectively HIGHer or LOWer intensities. I observe a specificity of retention for the trained intensity for all the odours used. Further I compare these findings with the case of adult Drosophila and propose a circuit level model of how such intensity coding comes about. Such intensity specificity of learning adds to appreciate the richness in 'content' of olfactory memory traces, and to define the demands on computational models of olfaction and olfactory learning. Chapter I.2 provides a behaviour-based estimate of odour similarity using four different types of experiments to yield a combined, task-independent estimate of perceived difference between odour-pairs. Further comparison of these perceived differences to published measures of physico- chemical difference reveals a weak correlation. Notable exceptions to this correlation are 3-octanol and benzaldehyde. Chapter I.3 shows for two odours (3-octanol and 1-octene-3-ol) that perceptual differences between these odours can either be ignored after non-discriminative training (generalization), or accentuated by odour-specific reinforcement (discrimination). Anosmic Or83b1 mutants have lost these faculties, indicating that this adaptive adjustment is taking place downstream of Or83b expressing sensory neurons. Chapter II.1 of this thesis deals with food supplementation with dried roots of Rhodiola rosea. This dose-dependently improves odour- reward associative function in larval Drosophila. Supplementing fly food with commercially available tablets or extracts, however, does not have a 'cognitive enhancing' effect, potentially enabling us to differentiate between the effective substances in the root versus these preparations. Thus Drosophila as a genetically tractable study case should now allow accelerated analyses of the molecular mechanism(s) that underlie this 'cognitive enhancement' conveyed by Rhodiola rosea. Chapter II.2 describes the role of Synapsin, an evolutionarily conserved presynaptic phosphoprotein using a combined behavioural and genetic approach and asks where and how, this protein affects functions in associative plasticity of larval Drosophila. This study shows that a Synapsin-dependent memory trace can be pinpointed to the mushroom bodies, a 'cortical' brain region of the insects. On the molecular level, data in this study assign Synapsin as a behaviourally- relevant effector of the AC-cAMP-PKA cascade.
For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.
Understanding of complex interactions and events in a nervous system, leading from the molecular level up to certain behavioural patterns calls for interdisciplinary interactions of various research areas. The goal of the presented work is to achieve such an interdisciplinary approach to study and manipulate animal behaviour and its underlying mechanisms. Optical in vivo imaging is a new constantly evolving method, allowing one to study not only the local but also wide reaching activity in the nervous system. Due to ease of its genetic accessibility Drosophila melanogaster represents an extraordinary experimental organism to utilize not only imaging but also various optogenetic techniques to study the neuronal underpinnings of behaviour. In this study four genetically encoded sensors were used to investigate the temporal dynamics of cAMP concentration changes in the horizontal lobes of the mushroom body, a brain area important for learning and memory, in response to various physiological and pharmacological stimuli. Several transgenic lines with various genomic insertion sites for the sensor constructs Epac1, Epac2, Epac2K390E and HCN2 were screened for the best signal quality, one line was selected for further experiments. The in vivo functionality of the sensor was assessed via pharmacological application of 8-bromo-cAMP as well as Forskolin, a substance stimulating cAMP producing adenylyl cyclases. This was followed by recording of the cAMP dynamics in response to the application of dopamine and octopamine, as well as to the presentation of electric shock, odorants or a simulated olfactory signal, induced by acetylcholine application to the observed brain area. In addition the interaction between the shock and the simulated olfactory signal by simultaneous presentation of both stimuli was studied. Preliminary results are supporting a coincidence detection mechanism at the level of the adenylyl cyclase as postulated by the present model for classical olfactory conditioning. In a second series of experiments an effort was made to selecticvely activate a subset of neurons via the optogenetic tool Channelrhodopsin (ChR2). This was achieved by recording the behaviour of the fly in a walking ball paradigm. A new method was developed to analyse the walking behaviour of the animal whose brain was made optically accessible via a dissection technique, as used for imaging, thus allowing one to target selected brain areas. Using the Gal4-UAS system the protocerebral bridge, a substructure of the central complex, was highlighted by expressing the ChR2 tagged by fluorescent protein EYFP. First behavioural recordings of such specially prepared animals were made. Lastly a new experimental paradigm for single animal conditioning was developed (Shock Box). Its design is based on the established Heat Box paradigm, however in addition to spatial and operant conditioning available in the Heat Box, the design of the new paradigm allows one to set up experiments to study classical and semioperant olfactory conditioning, as well as semioperant place learning and operant no idleness experiments. First experiments involving place learning were successfully performed in the new apparatus.
Yersinia enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 comprises about 80-90 % of all human patient isolates in Germany and Europe and is responsible for sporadic cases worldwide. Even though this serobiotype is low pathogenic, Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 is involved in gastroenteritis, lymphadenitis and various extraintestinal sequelae as reactive arthritis. The main animal reservoir of this serobiotype are pigs, causing a high rate of O:3/4 contaminations of raw pork in butcher shops in Germany (e.g. Bavaria 25 %) and countries in north-east Europe. As Y. enterocolitica O:3/4 is geographically and phylogenetically distinct from the so far sequenced mouse-virulent O:8/1B strain, complete genome sequencing has been performed for the European serobiotype O:3/4 DSMZ reference strain Y11, which has been isolated from a patient stool. To gain greater insight into the Y. enterocolitica subspecies palearctica group, also draft genome sequences of two other human O:3/4 isolates (strains Y8265, patient isolate, and Y5307, patient isolate associated with reactive arthritis), a closely related Y. enterocolitica palearctica serobiotype O:5,27/3 (strain Y527P), and two biotype 1A strains (a nosocomial strain of serogroup O:5 and an environmental serogroup O:36 isolate) have been performed. Those strains were compared to the high-pathogenic Y. enterocolitica subsp. enterocolitica serobiotype O:8/1B strain 8081 to address the peculiarities of the strain Y11 and the Y. enterocolitica subspecies palearctica group. The main focus was to unravel the pathogenic potential of strain Y11 and thus to identify novel putative virulence genes and fitness factors, especially those that may constitute host specificity of serobiotype O:3/4. Y. enterocolitica subspecies palearctica serobiotype O:3/4 strains lack most of the mouse-virulence-associated determinants of Y. enterocolitica subsp. enterocolitica serotype O:8, for example the HPI, Yts1 type 2 and Ysa type three secretion systems. In comparison, serobiotype O:3/4 strains obviously acquired a different set of genes and genomic islands for virulence and fitness such as the Ysp type three secretion system, an RtxA-like putative toxin, insecticidal toxins and a functional PTS system for N-acetyl-galactosamine uptake, named aga-operon. The aga-operon is able to support the growth of the Y. enterocolitica subsp. enterocolitica O:8/1B on N-acetyl-galactosamine after transformation with the aga operon. Besides these genes, also two prophages, PhiYep-2 and PhiYep-3, and a asn tRNA-associated GIYep-01 genomic island might influence the Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 pathoadaptation. The PhiYep-3 prophage and the GIYep-01 island show recombination activity and PhiYep-3 was not found in all O:3/4 strains of a small strain collection tested. Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:5,27/3 strain Y527P was found to be closely related to all serobiotype O:3/4 strains, whereas the biotype 1A isolates have more mosaic-segmented genomes and share putative virulence genes both with serobiotypes O:8/1B and O:3/4, which implies their common descent. Besides the pYV virulence plasmid, biotype 1A strains lack classical virulence markers as the Ail adhesin, the YstA enterotoxin, and the virulence-associated protein C. Interestingly, there are no notable differences between the known virulence factors present in nosocomial and environmental strains, except the presence of a truncated Rtx toxin-like gene cluster and remnants of a P2-like prophage in the hospital serogroup O:5 isolate.
In recent years high-throughput experiments provided a vast amount of data from all areas of molecular biology, including genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Its analysis using bioinformatics methods has developed accordingly, towards a systematic approach to understand how genes and their resulting proteins give rise to biological form and function. They interact with each other and with other molecules in highly complex structures, which are explored in network biology. The in-depth knowledge of genes and proteins obtained from high-throughput experiments can be complemented by the architecture of molecular networks to gain a deeper understanding of biological processes. This thesis provides methods and statistical analyses for the integration of molecular data into biological networks and the identification of functional modules, as well as its application to distinct biological data. The integrated network approach is implemented as a software package, termed BioNet, for the statistical language R. The package includes the statistics for the integration of transcriptomic and functional data with biological networks, the scoring of nodes and edges of these networks as well as methods for subnetwork search and visualisation. The exact algorithm is extensively tested in a simulation study and outperforms existing heuristic methods for the calculation of this NP-hard problem in accuracy and robustness. The variability of the resulting solutions is assessed on perturbed data, mimicking random or biased factors that obscure the biological signal, generated for the integrated data and the network. An optimal, robust module can be calculated using a consensus approach, based on a resampling method. It summarizes optimally an ensemble of solutions in a robust consensus module with the estimated variability indicated by confidence values for the nodes and edges. The approach is subsequently applied to two gene expression data sets. The first application analyses gene expression data for acute lymphoblastic leukaemia (ALL) and differences between the subgroups with and without an oncogenic BCR/ABL gene fusion. In a second application gene expression and survival data from diffuse large B-cell lymphomas are examined. The identified modules include and extend already existing gene lists and signatures by further significant genes and their interactions. The most important novelty is that these genes are determined and visualised in the context of their interactions as a functional module and not as a list of independent and unrelated transcripts. In a third application the integrative network approach is used to trace changes in tardigrade metabolism to identify pathways responsible for their extreme resistance to environmental changes and endurance in an inactive tun state. For the first time a metabolic network approach is proposed to detect shifts in metabolic pathways, integrating transcriptome and metabolite data. Concluding, the presented integrated network approach is an adequate technique to unite high-throughput experimental data for single molecules and their intermolecular dependencies. It is flexible to apply on diverse data, ranging from gene expression changes over metabolite abundances to protein modifications in a combination with a suitable molecular network. The exact algorithm is accurate and robust in comparison to heuristic approaches and delivers an optimal, robust solution in form of a consensus module with confidence values. By the integration of diverse sources of information and a simultaneous inspection of a molecular event from different points of view, new and exhaustive insights into biological processes can be acquired.
Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden.
Tumore der Nebennieren stellen häufige Tumore dar, welche bei mindestens 3 % der Population über 50-Jähriger vorkommen. Im Gegensatz dazu ist das Nebennierenrindenkarzinom mit einer Inzidenz von 1-2 Einwohner pro Million ein sehr seltener Tumor. Da seine Prognose allerdings ungünstig, und diese maßgeblich davon abhängt wie fortgeschritten der Tumor bei Diagnosestellung ist, ist es wichtig, dass die richtige Diagnose frühzeitig gestellt wird. Bis heute ist kein zuverlässiger immunhistochemischer Nebennierenrindenkarzinom-spezifischer Marker etabliert um das Nebennierenrindenkarzinom von anderen retroperitonealen Tumoren zu differenzieren. Sasano et al. schlug bereits 1995 erstmalig den Transkriptionsfaktor Steroidogenic Factor 1 (SF1) als Marker zur Differenzierung von Nebennierenrinden- und Nicht-Nebennierenrindentumoren vor. Allerdings wurde die diagnostische Wertigkeit bisher nur in sehr kleinen Fallserien mit insgesamt nur 17 Nebennierenrindenkarzinomen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die SF1 Protein-Expression bei 163 Nebennierenrindenkarzinomen, 52 Nebennierenrinden-Adenomen, 12 normalen steroidogenen Geweben (6 Nebennieren und 6 Ovare), sowie 73 Nicht-Steroidtumoren immunhistochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, das SF1 bei 158 von 161 evaluierbaren Nebennierenrindenkarzinomen und bei allen Proben von normalen und gutartigen Geweben (n=64) nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war keine der 73 Nicht-Steroidgeweben SF1 positiv, so dass die diagnostische Genauigkeit extrem gut ist (Sensitivität: 98.6 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value jeweils 100 % und 97.3 %). In einem zweiten Schritt wurde untersucht ob die Protein-Expression von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom auch prognostische Bedeutung hat. Hierbei zeigte sich, dass Patienten mit Tumoren mit starker SF1 Färbung (30 %) ein deutlich schlechteres tumorstadium-adjustiertes Rezidiffreies- und Gesamt-Überleben haben als Patienten mit geringer SF1 Expression (hazard ratio: 2.45). Zusätzlich zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden FISH Analysen durchgeführt. Hierbei zeigte sich allerdings keine signifikante Korrelation zwischen SF1 Gendosis und der SF1 Protein-Expression, so dass zu vermuten ist, dass SF1 maßgeblich auf Transkriptions- und Translationsebene reguliert wird. In einem Versuch diese Frage zu beantworten wurden zwei mutmaßliche SF1 Interaktionspartner, FATE1 und DAX1, genauer immunhistochemisch untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass FATE1 bei 62 von 141 evaluierbaren Nebenierenrindenkarzinomen und 12 von 62 normalen und gutartigen Geweben nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu waren alle 9 Nicht-Steroidgewebe FATE1 negativ. Dies zeigt, das FATE1 nicht zur Diagnostik nutzbar ist (Sensitivität: 61 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value 100 % bzw. 14 %). Die DAX1 Analyse zeigte, dass alle 20 normalen und gutartigen Gewebe eine positive DAX1 Färbereaktion zeigten. Von 126 Nebennierenrindenkarzinomen waren 71 DAX1 positiv. Von den 8 untersuchten Nicht-Steroidgeweben waren 6 DAX1 positiv. Diese Ergebnisse belegen, dass auch DAX1 keine diagnostische Genauigkeit besitzt (Sensitivität: 56 %, Spezifität: 25 %, positive und negative predictive value 92 % bzw. 4 %). Die Untersuchung der prognostischen Fähigkeiten von FATE1 und DAX1 zeigte, dass Patienten mit Tumoren mit starker FATE1 Färbung (39 %) ein schlechteres tumorstadium-adjustiertes Gesamt- aber nicht Rezidiffreies-Überleben haben als Patienten mit niedriger FATE1 Protein-Expression (hazard ratio: 2.01). Weiterhin wurde deutlich, dass DAX1 keine deutlichen prognostischen Fähigkeiten besitzt. Zusammenfassend läßt sich aus der vorliegenden Arbeit folgern, das SF1 aktuell der beste diagnostische Marker zur Diagnose von Tumoren der Nebennierenrinde ist und damit Eingang in die histopathologische Routine-Diagnostik von Nebennierentumoren finden wird. Zusätzlich ist die SF1 Expression ein sehr guter prognostischer Marker beim Nebennierenrindenkarzinom, wobei sich die prognostische Aussage durch zusätzliche Färbung von FATE1 und DAX1 nur unwesentlich verbessern läßt.
Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe.
According to a changing environment it is crucial for animals to make experience and learn about it. Sensing, integrating and learning to associate different kinds of modalities enables animals to expect future events and to adjust behavior in the way, expected as the most profitable. Complex processes as memory formation and storage make it necessary to investigate learning and memory on different levels. In this context Drosophila melanogaster represents a powerful model organism. As the adult brain of the fly is still quite complex, I chose the third instar larva as model - the more simple the system, the easier to isolate single, fundamental principles of learning. In this thesis I addressed several kinds of questions on different mechanism of olfactory associative and synaptic plasiticity in Drosophila larvae. I focused on short-term memory throughout my thesis. First, investigating larval learning on behavioral level, I developed a one-odor paradigm for olfactory associative conditioning. This enables to estimate the learnability of single odors, reduces the complexity of the task and simplify analyses of "learning mutants". It further allows to balance learnability of odors for generalization-type experiments to describe the olfactory "coding space". Furthermore I could show that innate attractiveness and learnability can be dissociated and found finally that paired presentation of a given odor with reward increase performance, whereas unpaired presentations of these two stimuli decrease performance, indicating that larva are able to learn about the presence as well as about the absence of a reward. Second, on behavioral level, together with Thomas Niewalda and colleagues we focussed on salt processing in the context of choice, feeding and learning. Salt is required in several physiological processes, but can neither be synthesized nor stored. Various salt concentrations shift the valence from attraction to repulsion in reflexive behaviour. Interestingly, the reinforcing effect of salt in learning is shifted by more than one order of magnitude toward higher concentrations. Thus, the input pathways for gustatory behavior appear to be more sensitive than the ones supporting gustatory reinforcement, which is may be due to the dissociation of the reflexive and the reinforcing signalling pathways of salt. Third, in cooperation with Michael Schleyer we performed a series of behavioral gustatory, olfactory preference tests and larval learning experiments. Based on the available neuroanatomical and behavioral data we propose a model regarding chemosensory processing, odor-tastant memory trace formation and the 'decision' like process. It incorporates putative sites of interaction between olfactory and gustatory pathways during the establishment as well as behavioral expression of odor-tastant memory. We claim that innate olfactory behavior is responsive in nature and suggest that associative conditioned behavior is not a simple substitution like process, but driven more likely by the expectation of its outcome. Fourth, together with Birgit Michels and colleagues we investigated the cellular site and molecular mode of Synapsin, an evolutionarily conserved, presynaptic vesicular phosphoprotein and its action in larval learning. We confirmed a previously described learning impairment upon loss of Synapsin. We localized this Synapsin dependent memory trace in the mushroom bodies, a third-order "cortical" brain region, and could further show on molecular level, that Synapsin is as a downstream element of the AC-cAMP-PKA signalling cascade. This study provides a comprehensive chain of explanation from the molecular level to an associative behavioral change. Fifth, in the main part of my thesis I focused on molecular level on another synaptic protein, the Synapse associated protein of 47kDa (Sap47) and its role in larval behavior. As a member of a phylogenetically conserved gene family of hitherto unknown function. It is localized throughout the whole neuropil of larval brains and associated with presynaptic vesicles. Upon loss of Sap47 larvae exhibit normal sensory detection of the to-be-associated stimuli as well as normal motor performance and basic synaptic transmission. Interestingly, short-term plasticity is distorted and odorant–tastant associative learning ability is reduced. This defect in associative function could be rescued by restoring Sap47 expression. Therefore, this report is the first to suggest a function for Sap47 and specifically argues that Sap47 is required for synaptic as well as for behavioral plasticity in Drosophila larva. This prompts the question whether its homologs are required for synaptic and behavioral plasticity also in other species. Further in the last part of my thesis I contributed to the study of Ayse Yarali. Her central topic was the role of the White protein in punishment and relief learning in adult flies. Whereas stimuli that precede shock during training are subsequently avoided as predictors for punishment, stimuli that follow shock during training are later on approached, as they predict relief. Concerning the loss of White we report that pain-relief learning as well as punishment learning is changed. My contribution was a comparison between wild type and the white1118 mutant larvae in odor-reward learning. It turned out that a loss of White has no effect on larval odorant-tastant learning. This study, regarding painrelief learning provides the very first hints concerning the genetic determinants of this form of learning.
Epimutations in Germ-Cell and Embryo Development: Possible Consequences for Assisted Reproduction
(2011)
Assisted reproductive technologies (ART) emerged in the late 1970’s as a therapy for human infertility. Up till now more than 3 million babies have been conceived through ART, demonstrating the safety and efficiency of the technique. Published reports showed an increase in the rate of imprinting disorders (Beckwith Wiedemann Syndrome, Angelman Syndrome, etc.) in babies born after ART. What are the effects imposed through ART and should researchers reassess its safety and implications on the future offspring? Throughout this thesis, I analyzed the methylation patterns of germ cells and embryos to determine whether in vitro maturation and in vitro fertilization have a negative impact on the epigenetic patterns. Furthermore, DNA methylation was compared between sperm of infertile and presumably fertile controls in order to understand whether epigenetic disturbances lead to infertility at the first place. The occurrence of methylation aberrations in germ cells of infertile patients could be transmitted to new-borns and then cause epigenetic disorders. In order to elucidate the imprinting status within single cells, I developed a new technique based on limiting dilution where bisulfite treated DNA is distributed across several wells before amplification. This allowed methylation measurement at the single allele level as well parent of origin detection. In a total of 141 sperm samples from couples undergoing in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) including 106 with male factor or combined infertility and 28 with female infertility, I detected a significant correlation between lower quality of semen parameters (sperm count, percentage of abnormal sperm, and percentage of motile sperm) and the rate of imprinting errors. ALU repeats displayed a higher methylation in sperm DNA of patients leading to a pregnancy and live birth, compared to patients in which pregnancy was not achieved or a spontaneous abortion occurred. A discriminant analysis based on ALU methylation allowed correct classification of >70% of cases. Preliminary data from illumina methylation arrays where more than 27,000 CpGs were analyzed determined that only a single CpG site from the open reading frame C14orf93 was significantly different between the infertile and presumably fertile control group. However, further improvements on data normalization might permit detection of other differentially methylated regions. Comparison of embryos after natural conception, in vitro fertilized embryos from superovulated oocytes, and embryos achieved through fertilization of in vitro cultured oocytes revealed no dramatic effect on the imprinting patterns of Igf2r, H19, and Snrpn. Oocyte cryotop vitrification did not result in a dramatic increase of imprinting mutations in oocytes even though the rate of sporadic methylation errors in single Snrpn CpGs were higher within the in-vitrified group. Collectively, the results I will present within this thesis suggest an increase in the rate of imprinting errors within the germ cells of infertile patients, in addition to a decrease in genome wide methylation of ALU repetitive elements. I did not observe a detrimental effect on the methylation patterns of oocytes and the resulting embryos using in vitro maturation of oocytes and/or standard IVF with in vivo grown superovulated oocytes.
Honeybees (Apis mellifera) forage on a great variety of plant species, navigate over large distances to crucial resources, and return to communicate the locations of food sources and potential new nest sites to nest mates using a symbolic dance language. In order to achieve this, honeybees have evolved a rich repertoire of adaptive behaviours, some of which were earlier believed to be restricted to vertebrates. In this thesis, I explore the mechanisms involved in honeybee learning, memory, numerical competence and navigation. The findings acquired in this thesis show that honeybees are not the simple reflex automats they were once believed to be. The level of sophistication I found in the bees’ memory, their learning ability, their time sense, their numerical competence and their navigational abilities are surprisingly similar to the results obtained in comparable experiments with vertebrates. Thus, we should reconsider the notion that a bigger brain automatically indicates higher intelligence.
Zurzeit sterben jährlich ca. 11.000 Männer in Deutschland am Prostatakarzinom. Damit stellt dies die zweithäufigste Krebstodesursache von Männern dar. Da das Prostatakarzinom häufig asymptomatisch verläuft, wird die Erkrankung oftmals erst so spät erkannt, dass zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Metastasierung stattgefunden hat. Durch metastasierende Prostatakarzinomzellen werden Lymphknoten, Knochen und Lungen befallen. Es sind zwei unterschiedliche Verbreitungsarten von metastasierenden Tumorzellen beschrieben. Zum einen kann eine Migration über Lymphgefäße erfolgen, ein Prozess der als lymphatische Metastasierung bezeichnet wird. Zum anderen können Tumorzellen über das Blutsystem im Körper zirkulieren: die hämatogene Metastasierung. In dieser Arbeit wurde die lymphatische Metastasierung der humanen Prostatakarzinomzellline PC-3 im Detail analysiert und Teilaspekte der hämatogenen Verteilung untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen bildete die Vergrößerung lumbaler und renaler Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden Mäusen 60 Tage nach der Implantation von PC-3-Zellen. Es wurde daraufhin der zeitliche Verlauf der Vergrößerung untersucht und festgestellt, dass sowohl das Volumen als auch die Anzahl vergrößerter Lymphknoten von Woche zu Woche nach Implantation der PC-3-Tumore zunehmen. Anschließend wurden alle vergrößerten Lymphknoten bezüglich des Vorhandenseins von metastasierenden humanen PC-3-Zellen in den Mäusen untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung von Primern für humanes β-Aktin. Sechs Wochen nach Implantation konnten in 90 % der vergrößerten Lymphknoten PC-3-Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch lentivirale Transduktion das Gen für das rot fluoreszierende Protein (RFP) in die PC-3-Zellen inseriert, wodurch eine Visualisierung dieser Zellen in der Maus ermöglicht wurde. Es konnten metastasierende PC-3-RFP-Zellen in lumbalen und renalen Lymphknoten PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse nachgewiesen werden. Ebenso konnte mittels RFP gezeigt werden, dass die Lymphknotenmetastasierung in Abhängigkeit von der Lokalisation des PC-3-RFP-Tumors erfolgt. Es kam zur Metastasierung jener Lymphknoten, in deren Einzugsgebiet sich der PC-3-Tumor befand. Es wurde eine PC-3-RFP-Zellmigration zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen nachgewiesen und bei immunhistologischen Untersuchungen stellte sich heraus, dass PC-3-RFP-Zellen tatsächlich in lymphatischen Bahnen zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen migrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass es von Woche zu Woche nach Implantation von PC-3-Zellen zu einer Zunahme der Anzahl von Lymphgefäßen in PC-3-Tumoren kommt. Die Zunahme der Lymphgefäßdichte korrelierte hierbei positiv mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen. Es konnten weiterhin neben Lymphknotenmetastasen hämatogene Mikrometastasen in den Lungen PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse beobachtet werden. Da die Haupttodesursache von Prostatakarzinompatienten in der Bildung von Metastasen liegt, ist es von herausragender Bedeutung eine effektive Therapie gegen lymphatische und hämatogene Metastasen zu entwickeln. Aus diesem Grund erlangt die onkolytische Virustherapie große Bedeutung. Deshalb wurde als zweiter Aspekt in dieser Arbeit der Einfluss des onkolytischen Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf den Prozess der PC-3-Zellmetastasierung untersucht. Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass GLV-1h68 in der Lage ist, erfolgreich sowohl migrierende PC-3-Zellen als auch metastasierende PC-3-Zellen in Lymphknoten zu kolonisieren. In der Folge wurde deshalb ein möglicher Metastasen-inhibierender Effekt von GLV-1h68 untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass GLV-1h68 drei Wochen nach intravenöser Injektion eine signifikante Reduktion der Anzahl der für PC-3-Zellen positiven Lymphknoten bewirkt. Des Weiteren konnte ein inhibierender Effekt von GLV-1h68 auf die im Blut zirkulierenden PC-3-Zellen und auf hämatogene Metastasen in den Lungen beobachtet werden. Durch intravenöse Injektion von GLV-1h68 in PC-3-RFP-Tumor-tragenden Mäusen konnte gezeigt werden, dass es zu einer präferentiellen Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den Tumoren kommt. Auch nach intraperitonealer und intratumoraler Injektion von GLV-1h68 konnte eine präferentielle Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Lymph- und Blutgefäße von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass es sieben Tage nach intravenöser Injektion von GLV-1h68 zu einer signifikanten Abnahme von beiden Gefäßarten kam. Es wurde in dieser Arbeit somit gezeigt, dass GLV-1h68 in der Lage ist, sowohl lymphatische als auch hämatogene Metastasen der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 erfolgreich zu eliminieren. Folglich dürften onkolytische Vaccinia-Viren ein vielversprechendes Therapeutikum für die Behandlung des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms darstellen.
Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease of the brain. Today AD is the most common form of dementia in elderly people. It is clinically characterized by a progressive loss of memory and later on a decline in higher cognitive functions. The pathological hallmarks of AD, consistently demonstrated in brain tissue of patients, are extracellular amyloid-β (Aβ plaques, intracellular neurofibrillary tangles of tau protein and a profound loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses and ultimatively neurons. Estimates foresee that more than 80 million individuals will be affected by the disease by 2040 due to population aging worldwide underlining the high medical need for this disease. In order to find suitable drugs for the treatment of AD, experimental model systems are utilized to explore potential drug candidates. Such an experimental system is hippocampal long-term potentiation (LTP), which is widely accepted as an in vitro model of cellular processes fundamentally involved in memory formation. The present thesis focuses on the establishment and validation of LTP in rat hippocampal slices to characterize memory enhancing drugs as a potential treatment of AD. First, a multi-slice recording system was set up enabling stable measurements of LTP for up to seven hours from several slices simultaneously (chapter 2). Then, distinct protocols to induce early and late CA1 LTP, resembling short-term and long-term memory, were established. They were validated by addressing the hallmarks accepted for these forms of LTP: protein-synthesis independence and NMDA receptor dependence without contribution of L-VDCCs for early LTP, as opposed to protein-synthesis and NMDA / L-VDCCs dependence for late LTP (chapter 3). As in AD patients a loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses is obvious, these validated forms of LTP were used to study drugs potentially being able to enhance cholinergic and/or glutamatergic neuronal functions. The effects of two drugs exclusively interfering with cholinergic function on LTP were tested: the α4β2 nicotinic acetylcholinergic receptor agonist TC-1827 (chapter 4) and the acetylcholine esterase inhibitor donepezil (chapter 5). Both drugs were found to increase early LTP, but to not affect late LTP. Furthermore, two drugs exclusively interfering with glutamatergic function were analyzed: the metabotropic glutamate 5 receptor postive allosteric modulator ADX-47273 (chapter 3) and the phosphodiesterase (PDE) 9A inhibitor BAY 73-6691 (chapter 5). ADX-47273 increased late LTP, but had no effect on early LTP, whereas BAY 73-6691 showed enhancing effects on both early and late LTP and even transformed early into late LTP. The same effects like for the PDE9A inhibitor were observed for the α7 nicotinic acetylcholinergic receptor partial agonist SSR180711 (chapter 4), which interferes with both, cholinergic and glutamatergic function. Thus, drugs facilitating glutamatergic function or both glutamatergic and cholinergic function seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function. To evaluate whether this finding also proves true for experimental circumstances mimicking decreased cognitive function together with pathophysiology in AD patients, the ability of the drugs to ameliorate LTP impaired by soluble Aβ oligomer was analyzed (chapter 6). Soluble Aβ oligomers, also referred to as amyloid-β derived diffusible ligands (ADDLs), are thought to a putative cause of AD. Here, they were demonstrated to impair early and late LTP to different extents by exclusively targeting NMDA receptors and/or their signaling. These results further contribute to the hypothesis that soluble Aβ oligomers cause synaptic dysfunction which might lead to cognitive decline seen in AD patients. Regarding drug effects, donepezil and TC-1827 slightly restored ADDLs induced impairment of early LTP, but had no effect on late LTP impaired by ADDLs. In contrast, both, SSR180711 and BAY 73-6691 completely rescued early as well as late LTP impaired by ADDLs. ADX-47273 had no restoring effect on ADDLs induced early LTP impairment, but partially restored late LTP impaired by ADDLs. Thus, the earlier finding of the present thesis was confirmed: drugs facilitating glutamatergic function not only seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function, but are also superior in ameliorating soluble Aβ oligomer induced LTP deficits. Therefore, from a preclinical perspective and based on the results of the present thesis, drugs interfering with glutamatergic function seem to have a high therapeutic potential as alternative treatment concerning cognitive deficits. Probably, they represent more efficacious approaches for the symptomatic treatment of AD than current treatments solely facilitating cholinergic function.
Trotz beträchtlicher Anstrengung Malaria zu kontrollieren bzw. zu eradizieren, stellt die Krankheit weiterhin eines der gravierendsten Gesundheitsprobleme unseres Jahrtausends dar. Malaria fordert jährlich zwischen 0,7 und 2,7 Millionen Menschenleben, beeinträchtigt schulische und soziale Entwicklung und hemmt erheblich das Wirtschaftswachstum der betroffenen Länder. In Burkina Faso, einem der ärmsten Länder der Welt, ist Malaria eines der größten Gesundheitsprobleme und ca. ein Drittel aller Todesfälle werden hier Malaria angelastet. Die sich weiter ausbreiteten Resistenzen gegen die gängigen Malariamedikamente machen die Bekämpfung der Malaria zunehmend schwierig. Artemisinin basierende Kombinationstherapien sind aktuell, trotz relativ hoher Therapiekosten und erster Resistenzen, die Erstlinien Behandlung. Effektive und billige neue Kombinationstherapien werden dringend benötigt. In dieser Doktorarbeit wurde das Resistenzpotential von Artemisinin modelliert. Die Homologiemodellierungen unterstützen die These von Krishna und Kollegen von SERCA als einzige Zielstruktur von Artemisinin. Des Weiteren wurde Methylenblau als neues altes Malariamittel evaluiert. Methylenblau ist das erste gegen Malaria eingesetzte Medikament, agiert als ein prooxidatives Agens und inhibiert selektiv und nicht-kompetitiv die P. falciparum Glutathion Reduktase. Die additiven und multiplen Zielprotein Effekte von Methylenblau wurden experimentell untersucht und hier in einem bioinformatischem Modell getestet. Unter dem Einfluss von Methylenblau werden einige Schlüsselenzyme des Redoxstoffwechsels in ihrer Aktivität beeinträchtigt und der Parasit wird verstärkt oxidativem Stress ausgesetzt. Des Weiteren konnte in dieser Dr. Arbeit eine starke Kooperationsbereitschaft der urbanen und ländlichen Bevölkerung an zukünftigen Malaria Projekten gezeigt werden.
Non-target effects of a multiple insect resistant Bt-maize on the honey bee (Apis mellifera L.)
(2011)
Honey bee pollination is an ecologically and economically important ecosystem service. New methodological developments are needed to research the underlying factors of globally observed bee losses. The honey bee (Apis mellifera) is a key non-target arthropod species for environmental risk assessment of genetically modified (GM) crops. For GM-crop risk assessments, mainly methods for monitoring adult honey bees under laboratory conditions are documented. However, protocols with robust methods for standardized colonies or in vitro reared honey bee larvae are currently lacking. Within the research, presented in this this dissertation, multiple methodological developments are achieved; a mortality trap (Chapter II), a ‘full life cycle test’ (III), a novel in vitro rearing methodology (IV), a standardized in vitro test for Bt-pollen (V), a mixed toxicity test for purified transgenic proteins (VI), and a bacterial flora test with pollen digestion rate monitoring (VII). Overall, the studies did not indicate a detrimental effect caused by Bt-maize pollen, or by purified Bt-proteins at worst case exposure levels. Considering the risk for honey bees and larvae, we conclude that the tested Bt-maize Mon89034xMon88017 is not likely to cause harm to honey bee colonies. The study methods presented are highly recommended for future environmental risk assessment studies testing GM-crop biosafety on honey bees.
A major goal of the main topics of ecology is to answer the question of how species can co-exist and maintain biodiversity. To understand how community dynamics operate in different spatio-temporal dimensions to govern biodiversity patterns requires a process-based knowledge. Thus, this study focused primarily on biodiversity patterns and ecological processes at both spatial and temporal scales. Spatially, the diversity and similarity of spider communities in high, intermediate, and low strata of beech trees represented a set of age-related effects: Old-growth trees provided unique and distinct resources to spiders and in turn possessed discrete spider compositions. Intra-annually, spider communities in different seasons showed a repeated, predictable temporal dynamics. Inter-annually, comparison revealed that neutral and niche models can operate in tandem, and that both are needed to fully explain the dynamics of arboreal spider assemblages among different canopy strata in this beech forest.
In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account.
Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen.
Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control
(2011)
Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly.
Desert ants of the genus Cataglyphis have become model systems for the study of insect navigation. An age-related polyethism subdivides their colonies into interior workers and short-lived light-exposed foragers. While foraging in featureless and cluttered terrain over distances up to several hundred meters, the ants are able to precisely return back to their often inconspicuous nest entrance. They accomplish this enormous navigational performance by using a path integration system - including a polarization compass and an odometer - as their main navigational means in addition to landmark-dependent orientation and olfactory cues. C. fortis, being the focus of the present thesis, is endemic to the salt flats of western North Africa, which are completely avoided by other Cataglyphis species. The fact that Cataglyphis ants undergo a behavioral transition associated with drastically changing sensory demands makes these ants particularly interesting for studying synaptic plasticity in visual and olfactory brain centers. This thesis focuses on plastic changes in the mushroom bodies (MBs) - sensory integration centers supposed to be involved in learning and memory presumably including landmark learning - and in synaptic complexes belonging to the lateral accessory lobe (LAL) known to be a relay station in the polarization processing pathway. To investigate structural synaptic plasticity in the MBs of C. fortis, synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the visual (collar) and olfactory (lip) input regions of the MB calyx were immunolabeled and their pre- and postsynaptic profiles were quantified. The results show that a volume increase of the MB calyx during behavioral transition is associated with a decrease of MG number - an effect called pruning - in the collar and, less pronounced, in the lip that goes along with dendritic expansion in MB intrinsic Kenyon cells. Light-exposure of dark-reared ants of different age classes revealed similar effects and dark-reared ants age-matched to foragers had MG numbers comparable to those of interior workers. The results indicate that the enormous structural synaptic plasticity of the MB calyx collar is primarily driven by visual experience rather than by an internal program. Ants aged artificially for up to one year expressed a similar plasticity indicating that the system remains flexible over the entire life-span. To investigate whether light-induced synaptic reorganization is reversible, experienced foragers were transferred back to darkness with the result that their MBs exhibit only some reverse-type characteristics, in particular differences in presynaptic synapsin expression. To investigate the structure of large synaptic complexes in the LAL of C. fortis and to detect potential structural changes, pre- and postsynaptic profiles in interior workers and foragers were immunolabeled and quantified by using confocal imaging and 3D-reconstruction. The results show that these complexes consist of postsynaptic processes located in a central region that is surrounded by a cup-like presynaptic profile. Tracer injections identified input and output tracts of the LAL: projection neurons from the anterior optic tubercle build connections with neurons projecting to the central complex. The behavioral transition is associated with an increase by ~13% of synaptic complexes suggesting that the polarization pathway may undergo some sort of calibration process. The structural features of these synaptic contacts indicate that they may serve a fast and reliable signal transmission in the polarization vision pathway. Behavioral analyses of C. fortis in the field revealed that the ants perform exploration runs including pirouette-like turns very close to the nest entrance for a period of up to two days, before they actually start their foraging activity. During these orientation runs the ants gather visual experience and might associate the nest entrance with specific landmarks or get entrained to other visual information like the polarization pattern, and, concomitantly adapt their neuronal circuitries to the upcoming challenges. Moreover, the pirouettes may serve to stimulate and calibrate the neuronal networks involved in the polarization compass pathway. Video recordings and analyses demonstrate that light experience enhanced the ants’ locomotor activity after three days of exposure. The fact that both the light-induced behavioral and neuronal changes in visual brain centers occur in the same time frame suggests that there may be a link between structural synaptic plasticity and the behavioral transition from interior tasks to outdoor foraging. Desert ants of the genus Cataglyphis possess remarkable visual navigation capabilities, but also employ olfactory cues for detecting nest and food sites. Using confocal imaging and 3D-reconstruction, potential adaptations in primary olfactory brain centers were analyzed by comparing the number, size and spatial arrangement of olfactory glomeruli in the antennal lobe of C. fortis, C. albicans, C. bicolor, C. rubra, and C. noda. Workers of all Cataglyphis species have smaller numbers of glomeruli compared to those of more olfactory-guided Formica species - a genus closely related to Cataglyphis - and to those previously found in other olfactory-guided ant species. C. fortis has the lowest number of glomeruli compared to all other species, but possesses a conspicuously enlarged glomerulus that is located close to the antennal nerve entrance. Males of C. fortis have a significantly smaller number of glomeruli compared to female workers and queens and a prominent male-specific macroglomerulus likely to be involved in sex pheromone communication. The behavioral significance of the enlarged glomerulus in female workers remains elusive. The fact that C. fortis inhabits microhabitats that are avoided by all other Cataglyphis species suggests that extreme ecological conditions may not only have resulted in adaptations of visual capabilities, but also in specializations of the olfactory system. The present thesis demonstrates that Cataglyphis is an excellent candidate for studying the neuronal mechanisms underlying navigational features and for studying neuronal plasticity associated with the ant’s lifelong flexibility of individual behavioral repertoires.