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Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
Zur Gattung Bordetella zählen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii gehört zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-ähnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine für die „klassischen“ Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filamentösen Hämagglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufwärts von einem putativen Membranprotein und stromabwärts von einem IS1001-ähnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die größte Ähnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung bestärkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminosäuresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddomäne sowie eine TPS-Domäne identifiziert werden. Dies lässt vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfläche transportiert und möglicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedomäne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv könnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen“ Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Adäsionsfähigkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adhäsionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adhäsionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adhäsionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 lässt zudem auf die Beteiligung weiterer Adhäsionsfaktoren an der Wirtszelladhäsion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii über zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abhängigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die Ähnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5’- T/A T T C C/T T A -3’ aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell für die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zunächst die primäre BvgABH-Bindestelle BS2 mit der höchsten Affinität von BvgABH-P gebunden, wobei für BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekundäre Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabwärts von BS2 befindet. Eine möglicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, hauptsächlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zurückzuführen. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabwärts und könnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gewährleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei höheren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abhängige fhaBBH-Expression unterstützt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gewährleisten.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
The bacteriophage Lambda is a virus which infects bacteria carrying LamB protein in their outer membrane. GpJ, a protein of the tail of the phage, is involved in the binding to LamB. The study of the interaction between GpJ expressed as fusion protein and LamB was performed in order to investigate the interaction between the bacteriophage Lambda and LamB. The fusion proteins are called MBP-gpJ and His-gpJ. MBP-gpJ is a chimeric protein representing Maltose Binding Protein connected to the Cterminal part of the GpJ protein (residue 684 until 1132), graciously given by Pr. Charbit (Paris, France). MBP-gpJ, expressed in E.coli and purified, bound to the exoplasmic side of LamB and LamB variants in planar lipid bilayer experiments and allowed a complete and reversible blockage of LamB channels. In order to obtain data about the binding of the GpJ fragment alone to LamB, an other fusion protein without MBP was created, called His-gpJ. His-gpJ is the C-terminal part of GpJ (684-1132) in fusion with a 6×Histidine-tag, produced as insoluble form in E.coli. After renaturation, a soluble protein can be obtained. Without MBP, the GpJ fragment still bound to LamB in planar lipid bilayer experiments, but did not block significantly its channels, as previously observed after addition of MBP-gpJ. The interaction between His-gpJ and LamB or LamB mutants was also demonstrated on SDSPAGE and immunodetection by the presence of high molecular mass bands. Furthermore, the use of variants of lamB allowed to demonstrate that the C-terminal fragment of GpJ does not bind to the same area on the surface of LamB than GpJ involved in the tail of the Lambda phage.
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).
Lamin C2
(2000)
In der Kernlamina von Spermatozyten von Nagetieren sind die Lamin A-Genprodukte, Lamin A und C, durch eine meiosespezifische Splicingvariante ersetzt. Dieses Lamin C2 unterscheidet sich auffallend von den somatischen Varianten in Struktur, Menge und Verhalten. Durch eine ektopische Expression von Lamin C2 als EGFP-Lamin C2-Fusionsprotein in einer somatischen Zellinie zeigte sich, daß eine neuartige Hexapeptidsequenz (GNAEGR) am N-terminalen Ende des Proteins anstelle der C-terminal gelegenen CaaX-Box somatischer Lamine für die Interaktion mit der Kernhülle verantwortlich ist. So ermöglicht eine posttranslationelle Myristylierung des ersten Glycins ein Membrantargeting, bei dem der hydrophobe Myristinsäurerest vergleichbar dem hydrophoben Farnesylrest am Cystein der Caax-Box mit den Fettsäureresten der Kernmembran interagiert. Die Deletion des Hexapeptids im Fusionsprotein EGFP-Lamin C2 und die seine N-terminale Insertion in das Fusionsprotein EGFP-Lamin C - es besitzt keine Caax-Box - bestätigt, daß allein das Hexapeptid das Membrantargeting steuert: Die Deletionsmutante EGFP-Lamin C2 bleibt diffus im Kern verteilt, während sich die Insertionsmutante EGFP-Lamin C im Bereich der Kernperipherie anreichert. Eine weitere Besonderheit stellt die Verteilung von Lamin C2 innerhalb der Kernhülle dar, denn es verteilt sich nicht gleichmäßig wie alle bisher bekannten Lamine, sondern bildet zahlreiche Aggregate. Nicht nur in der Kernhülle von Spermatozyten, sondern auch als Fusionsprotein in somatischen Zellen exprimiert, zeigt Lamin C2 diese Akkumulationen. Überraschenderweise treten die Synaptonemal-komplexenden nur im Bereich dieser Lamin C2-Aggregate mit der Kernhülle in Kontakt. Es wird daher postuliert, daß die Lamin C2-Aggregate der lokalen Verstärkung der Kernhülle dienen und wichtig für die auf die Prophase beschränkte Anheftung der SC an die Kernhülle sind. Da zudem in einer Kurzzeitkultur von Pachytänspermatozyten, in der die Prophase künstlich beschleunigt wird, gezeigt werden konnte, daß Lamin C2 mit Ende der Prophase I noch vor dem Auflösen der eigentlichen Kernhülle nicht mehr nachweisbar ist, scheint ein Zusammenhang zwischen Lamin C2 in der Kernhülle und der Umorganisation des genetischen Materials zu bestehen.
Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist.
Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellulärer Krankheitserreger, besitzt die Fähigkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellulär zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazelluläre Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellulärem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der für die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberflächenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde über einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als Köder eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit über 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Hälfte, während die C-terminale Hälfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Darüberhinaus enthält LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA bestätigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-Säule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. Über RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen Säugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopräzipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in Säugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazelluläre Lokalisation von LaXp180 wurde über Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke Färbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, während das restliche Zytoplasma schwach gefärbt war. Über Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfläche vieler, aber nicht aller intrazellulärer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellulären, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Darüberhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfläche verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. Über Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellulären, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert.
The identification of NRAGE
(2001)
The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.
Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
Im Katabolismus methylverzweigter Fettsäuren spielt die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase eine wichtige Rolle, indem sie die (R)- und (S)-Isomere von alpha-methylverzweigten Fettsäuren als Coenzym A Thioester racemisiert. Methylverzweigte Fettsäuren entstehen beim Abbau von Isoprenoiden und werden darüber hinaus auch von vielen Organismen, wie z.B. Mycobakterien, synthetisiert. Die Hauptaufgabe der Racemase ist aber vermutlich in der Biosynthese von Gallensäuren zu sehen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase aus humanem Gewebe zu reinigen und zu charakterisieren sowie ihre physiologische Rolle im Katabolismus verzweigtkettiger Fettsäuren und der Gallensäurebiosynthese zu untersuchen. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase wurde aus humanem Gewebe zur Homogenität gereinigt, umfassend biochemisch charakterisiert und zur genauen molekularbiologischen Analyse in E.coli kloniert. Die Aktivität der Racemase wurde anhand der [³H]H2O-Freisetzung aus [alpha-³H]-a-Methylacyl-CoAs bestimmt. Die humane Racemase ist in der aktiven Form ein monomeres Protein und besteht aus 382 Aminosäuren. Als Substrate akzeptiert das Enzym ein breites Spektrum von alpha-Methylacyl-CoAs. Neben den Coenzym A-Thioestern alpha-methylverzweigter Fettsäuren, wie Pristansäure, werden auch CoA-Ester von Steroidderivaten, z.B. des Gallensäureintermediats Trihydroxycoprostansäure, und aromatischen Phenylpropionsäuren, wie dem Analgetikum Ibuprofen, umgesetzt. Freie Fettsäuren, geradkettige oder beta-methylverzweigte Acyl-CoAs werden nicht racemisiert. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase ist im Menschen zu ca. 80 Prozent auf die Peroxisomen und ca. 20 Prozent auf die Mitochondrien verteilt, wobei entsprechende peroxisomale (PTS 1) und mitochondriale (MTS) Transportsignale die Lokalisation bestimmen. Die vollständige cDNA-Sequenz der humanen a-Methylacyl-CoA-Racemase hat eine Gesamtlänge von 2039 Basenpaaren mit einem offenen Leseraster von 89 - 1237 bp. Das Startcodon ATG ist in eine klassische Kozak-Sequenz zum Translationsstart eingebettet. Die Protein endet am C-Terminus mit dem Sequenzmotiv –KASL, das dem peroxisomalen Transportsignal (PTS I) einiger Säugetierkatalasen entspricht. Aufgrund alternativer Polyadenylierung sind in allen untersuchten menschlichen Geweben Transkripte von 1,6 kb bzw. 2,0 kb zu finden. Es liegt keine gewebsabhängige Polyadenylierung vor, die Racemase wird aber gewebsspezifisch exprimiert (besonders stark in Leber und Niere). Das humane Racemasegen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 5 nahe am Centromer (5p1.3), im Intervall von D5S651 (46,6 cM) und D5S634 (59.9 cM).