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π-Conjugated organic polymers have attracted tremendous attention in the last decades, and the interest in these materials is mainly driven by their applicability in next-generation electronic and optoelectronic devices (OLEDs, OFETs, photovoltaics). The partial or complete replacement of carbon atoms by main group elements in conjugated polymers can significantly change the characteristics and applications of these macromolecules. In this work, a class of inorganic polymers comprising a backbone of exclusively boron and nitrogen atoms (poly(iminoborane)s, PIBs) and their monodisperse oligomers is described. In addition, novel inorganic–organic hybrid polymers containing BN units in their polymer backbone were synthesized and characterized.
In chapter 2.1, the development of catalytic B–N coupling routes for the controlled synthesis of macromolecular materials is described. While the reaction of an N-silyl-B-chloro-aminoborane with the electrophilic reagent trimethylsilyl triflate led to effective B–N coupling, the reaction with a silver(I) salt resulted in an intramolecular Cl/Me exchange between the boron and silicon centers.
In chapter 2.2-2.4, the study of oligo- and poly(iminoborane)s is discussed. Monodisperse and cyclolinear oligo(iminoborane)s based on diazaborolidines with up to 7 boron and 8 nitrogen atoms were synthesized by successively extending the B-N main chain. However, the use of benzodiazaborolines only led to limited BN catenation. Furthermore, the redistribution processes resulting from the reaction of longer oligomers with non-stoichiometric amounts of (di)halogenated boranes is reported.
In chapter 2.5-2.6, the synthesis of 1,2,5-azadiborolanes as building blocks for the synthesis of poly(iminoborane)s and inorganic-organic hybrid polymers is described. While the attempt to apply an azadiborolane with sterically demanding groups on the boron-bridging ethylene unit for the construction of PIB was unfeasible, it was successfully incorporated in inorganic-organic hybrid polymers. Photophysical studies indicated π-conjugation along the polymer chain. A first attempt to synthesize PIBs based on azadiborolanes with unsubstituted ethylene units showed promising results.
In chapter 2.7-2.8, a comprehensive study of poly(arylene iminoborane)s, which are BN analogs of poly(arylene vinylene)s is described, and the properties of four polymers as well as twelve monodisperse oligomers were investigated. Photophysical investigations of the monomers, dimers and polymers showed a systematic bathochromic shift of the absorption maximum with increasing chain length and thiophene content. Based on TD-DFT calculations of the model oligomers, the lowest-energy absorption band could be assigned to HOMO to LUMO transitions with π-π* character. The oligo- and poly(arylene iminoborane)s showed only very weak to no emission in solution but they were emissive in the solid state. For four oligomers the aggregation induced emission (AIE) in a THF/water mixture was investigated and DLS studies confirmed the formation of nanoaggregates.
In chapter 2.9, oligo- and polymerizations of sulfur-containing building blocks and subsequent pH-triggered degradation of the products is described. While a sulfilimine-containing oligomer could not be isolated, the sulfone-, sulfoximine-, and sulfoxide-containing molecular oligomers and polymers could be successfully synthesized by B=N or B–O bond formation reactions. The sulfur-containing building blocks were successfully released under acidic or basic conditions, which was confirmed by NMR spectroscopy and mass spectrometry.
Introduction.
Mobile health (mHealth) integrates mobile devices into healthcare, enabling remote monitoring, data collection, and personalized interventions. Machine Learning (ML), a subfield of Artificial Intelligence (AI), can use mHealth data to confirm or extend domain knowledge by finding associations within the data, i.e., with the goal of improving healthcare decisions. In this work, two data collection techniques were used for mHealth data fed into ML systems: Mobile Crowdsensing (MCS), which is a collaborative data gathering approach, and Ecological Momentary Assessments (EMA), which capture real-time individual experiences within the individual’s common environments using questionnaires and sensors. We collected EMA and MCS data on tinnitus and COVID-19. About 15 % of the world’s population suffers from tinnitus.
Materials & Methods.
This thesis investigates the challenges of ML systems when using MCS and EMA data. It asks: How can ML confirm or broad domain knowledge? Domain knowledge refers to expertise and understanding in a specific field, gained through experience and education. Are ML systems always superior to simple heuristics and if yes, how can one reach explainable AI (XAI) in the presence of mHealth data? An XAI method enables a human to understand why a model makes certain predictions. Finally, which guidelines can be beneficial for the use of ML within the mHealth domain? In tinnitus research, ML discerns gender, temperature, and season-related variations among patients. In the realm of COVID-19, we collaboratively designed a COVID-19 check app for public education, incorporating EMA data to offer informative feedback on COVID-19-related matters. This thesis uses seven EMA datasets with more than 250,000 assessments. Our analyses revealed a set of challenges: App user over-representation, time gaps, identity ambiguity, and operating system specific rounding errors, among others. Our systematic review of 450 medical studies assessed prior utilization of XAI methods.
Results.
ML models predict gender and tinnitus perception, validating gender-linked tinnitus disparities. Using season and temperature to predict tinnitus shows the association of these variables with tinnitus. Multiple assessments of one app user can constitute a group. Neglecting these groups in data sets leads to model overfitting. In select instances, heuristics outperform ML models, highlighting the need for domain expert consultation to unveil hidden groups or find simple heuristics.
Conclusion.
This thesis suggests guidelines for mHealth related data analyses and improves estimates for ML performance. Close communication with medical domain experts to identify latent user subsets and incremental benefits of ML is essential.
Ziel der vorliegenden Studie war es, verschiedene kommerzielle Anbieter für KI-gestützte FRS-Analysen hinsichtlich ihrer Genauigkeit mit einem menschlichen Goldstandard zu vergleichen.
Auf 50 FRS wurden durch zwölf erfahrene Untersucher 15 Landmarken identifiziert, auf deren Basis neun relevante Parameter vermessen wurden. Der Medianwert dieser zwölf Auswertungen wurde für jeden Parameter auf jedem FRS als Goldstandard definiert und als Referenz für die Vergleiche mit vier verschiedenen kommerziellen KI-Anbietern (DentaliQ.ortho, WebCeph, AudaxCeph, CephX) festgelegt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA mit Messwiederholung, paarweiser Vergleiche mittels Post-hoc-Test und Bland-Altman-Plots.
DentaliQ.ortho zeigte für alle neun untersuchten Parameter keinen statistisch signifikanten Unterschied zum menschlichen Goldstandard und es konnte insgesamt von einer hohen Genauigkeit der Auswertungen ausgegangen werden. Auch für WebCeph war kein statistisch signifikanter Unterschied zum menschlichen Goldstandard zu verzeichnen. Allerdings war die Präzision im Vergleich zu den anderen Anbietern für alle Parameter am geringsten und der proportionale Fehler bei nahezu allen Parametern am höchsten. AudaxCeph wies für sieben Parameter statistisch signifikante Unterschiede zum menschlichen Goldstandard auf. Für CephX wurden für fünf Parameter statistisch signifikante Unterschiede zum menschlichen Goldstandard ermittelt. Insbesondere für die dentale Analyse war für alle untersuchten kommerziellen KI-Anbieter eine vergleichsweise niedrigere Genauigkeit zu verzeichnen.
Die Ergebnisse zeigen, dass noch deutliche Qualitätsunterschiede zwischen den kommerziellen KI-Anbietern für die vollständig automatisierte FRS-Analyse bestehen. Vor dem Hintergrund der Zeitersparnis und Qualitätssicherung sind KI zwar vielversprechend, sollten aber zum aktuellen Zeitpunkt nur unter Aufsicht durch menschliche Experten zum Einsatz kommen.
Es erfolgte eine Evaluierung von Bestrahlungsdaten aus der Strahlentherapie der Universitätsklinik Würzburg von 435 Patienten mit biochemischen oder klinischen Rezidiv des Prostatakarzinoms. Der primäre Endpunkt war das biochemisch rezidivfreie Überleben. Sekundäre Endpunkte waren das Auftreten von Fernmetastasen und das Versterben der Patienten. Zudem wurde der Einfluss patienten-, tumor-, und behandlungsspezifischer Faktoren überprüft.
We analyze the mathematical models of two classes of physical phenomena. The first class of phenomena we consider is the interaction between one or more insulating rigid bodies and an electrically conducting fluid, inside of which the bodies are contained, as well as the electromagnetic fields trespassing both of the materials. We take into account both the cases of incompressible and compressible fluids. In both cases our main result yields the existence of weak solutions to the associated system of partial differential equations, respectively. The proofs of these results are built upon hybrid discrete-continuous approximation schemes: Parts of the systems are discretized with respect to time in order to deal with the solution-dependent test functions in the induction equation. The remaining parts are treated as continuous equations on the small intervals between consecutive discrete time points, allowing us to employ techniques which do not transfer to the discretized setting. Moreover, the solution-dependent test functions in the momentum equation are handled via the use of classical penalization methods.
The second class of phenomena we consider is the evolution of a magnetoelastic material. Here too, our main result proves the existence of weak solutions to the corresponding system of partial differential equations. Its proof is based on De Giorgi's minimizing movements method, in which the system is discretized in time and, at each discrete time point, a minimization problem is solved, the associated Euler-Lagrange equations of which constitute a suitable approximation of the original equation of motion and magnetic force balance. The construction of such a minimization problem is made possible by the realization that, already on the continuous level, both of these equations can be written in terms of the same energy and dissipation potentials. The functional for the discrete minimization problem can then be constructed on the basis of these potentials.
Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies.
Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis.
In dieser Arbeit wurde einerseits retrospektiv untersucht, wie sich supratentorielle und infratentorielle Ependymome bildmorphologisch unterscheiden, ob Lokalrezidive eines Ependymoms dessen Bildeigenschaften teilen und welche Art von Rezidiven im Verlauf auftreten können. Die von uns beschriebenen Bildcharakteristika der Ependymome decken sich zum größten Teil mit bereits veröffentlichten Studien. Supratentorielle Ependymome unterscheiden sich signifikant in ihrer Bildmorphologie im Vergleich zu Ependymome der hintern Schädelgrube. Alle pädiatrischen Ependymompatienten/innen in unserem Kollektiv erkrankten an mindestens einem Rezidiv. Am häufigsten traten Lokalrezidive gefolgt von Meningeosen im ersten Rezidiv auf. Seltener fanden sich transiente postradiogene Läsionen, Diffuse intrinsische Ponsgliome und extraneurale Metastasen. Der bildmorphologische Vergleich, Primarius versus Lokalrezidiv ergab überwiegend ähnliche bildgebende Eigenschaften vor allem im Signalverhalten, Tumorbegrenzung und KM-Aufnahme sowie KM anreichernder Tumoranteil. Die kranielle Meningeose präsentierte sich zum ersten Rezidivzeitpunkt different zum Primärtumor. Die extraneuralen Metastasen hatten bildcharakteristisch Ähnlichkeiten zum Primärtumor. Bei der Bewertung neuer intraparenchymaler Läsionen sollte immer der zeitliche Zusammenhang zur letzten Therapie und damit mögliche vorübergehende postradiologischen Veränderungen berücksichtigt werden.
Letztlich ist das pädiatrische Ependymom und Ependymomrezidiv ein komplexes und immer noch unvollständiges erfasstes Krankheitsbild. Durch umfangreichere Studien und die Zusammenführung dieser Ergebnisse könnte schlussendlich die Komplexität des Krankheitsbildes und somit die Therapieoptionen verbessert werden. Durch unsere Studie gelang einerseits die Beschreibung und der Vergleich des primären Ependymoms bezüglich supra- und infratentorieller Lokalisation und andererseits gelang eine neuroradiologische Beschreibung von Ependymomrezidiven im Vergleich zum primären Ependymom, wodurch in Zukunft die Nachsorge der Ependymomrezidive und die Therapieoptionen optimiert werden könnten.
The demand for LIB with enhanced energy densities leads to increased utilization of the space within the confinements of the battery housing or to the use of electrode material with increased intrinsic specific energy densities. Both requirements result in more stress on the battery electrodes and separator during cycling or aging. However, the effect of mechanical strain on the cell’s electrochemistry and thus the performance of batteries is rather unexplored compared to the impact of current or temperature, for example. The objective of this thesis was to give a better understanding of the electrochemical and mechanical interplay in current- and next-generation lithium based battery cells. Therefore, the thesis was structured into the investigations on SoA and next-generation LIBs. For SoA LIBs, the investigations of the interplay started at laboratory scale. Here, the expansion of various electrodes and also the impact of mechanical pressure and its distribution on the performance of the cells were
studied. The investigations at laboratory scale was followed by an examination of the electrochemical and mechanical interactions on large format commercial LIBs which are used in BEVs. Accordingly, the effect of bracing and its effect on the performance was studied in an aging and post-mortem study. To gain a deeper understanding of the mechanical changes in LIBs, an ultrasonic study was performed for pouch cells. Here, the mechanical changes were further investigated in dependence of SoC and SoH. The effects of the mechanical stress on the performance for next-generation batteries were studied at laboratory scale. In the beginning, the expansion of next-generation anode materials such as silicon and lithium was compared with today’s anode materials. Furthermore, the effect of mechanical pressure and electrolyte on the irreversible dilation and performance was investigated for lithium metal cells. Overall, it was shown that pressure has a significant effect on the performance of today’s and also future LIBs. The interplay of the electrochemical and mechanical effects inside a LIB has a considerable impact on the lifetime, capacity fading and impedance increase of the batteries.
Angesichts aktueller und zurückliegender Migrations- und Fluchtprozesse in Deutschland kommen Jugendliche der Residenzgesellschaft in verschiedenen Bereichen ihres Lebens mit Menschen mit Flucht- oder Migrationserfahrung in Kontakt, woraus sich Chancen und Entwicklungspotenziale, aber auch Herausforderungen ergeben. Beispielsweise kann vermehrter interkultureller Kontakt auf individueller Ebene zur Weiterentwicklung von Toleranz und Empathie führen. Jedoch können Jugendliche der Residenzgesellschaft auf vermehrte Zuwanderung auch mit einem Gefühl der Unsicherheit und einer ablehnenden Haltung gegenüber Menschen mit Flucht- oder Migrationserfahrung reagieren. Diese Reaktionen können durch einseitige oder negative Medienberichte zum Themenkomplex Flucht und Migration verstärkt werden. Um Chancen und Entwicklungspotenziale ausschöpfen sowie Herausforderungen im Kontext von Flucht und Migration bewältigen zu können, müssen Jugendliche in der Entwicklung interkultureller Kompetenz gefördert werden. Interkulturelle Kompetenz ist eine wesentliche Voraussetzung für das Zusammenleben in einer pluralistischen Gesellschaft und daher ein bedeutsames Bildungs- und Erziehungsziel für Schule und Unterricht.
Die Zielstellung der vorliegenden Forschungsarbeit ist demnach die praxis- und theorieorientierte Entwicklung und Evaluation eines Unterrichtskonzepts zur Förderung interkultureller Kompetenz unter Verwendung digitaler Medienangebote und Gestaltung medialer Beiträge.
Hinsichtlich theoretischer Grundlagen zu interkultureller Kompetenz wird vor dem Hintergrund eines an Offenheit, Prozesshaftigkeit und Heterogenität orientierten Kulturbegriffs Interkulturalität als sozialer Prozess verstanden, in dem sich Personen unterschiedlicher kultureller bzw. kollektiver Zugehörigkeiten begegnen, miteinander interagieren und kommunizieren. Interkulturelle Kompetenz setzt sich aus Wissen (kognitive Dimension), Einstellungen (affektive Dimension) sowie Verhaltensweisen (behaviorale Dimension) zusammen und es wird angenommen, dass diese erlernt und gefördert werden kann. Vorgehensweisen zur Entwicklung interkultureller Kompetenz sollten die kognitive, affektive und behaviorale Dimension interkultureller Kompetenz adressieren, die Reflexion authentischer, kritischer Überschneidungssituationen einbeziehen sowie realweltliche, interkulturelle Begegnungen als Lerngelegenheiten aufgreifen.
Bezüglich theoretischer Grundlagen zum Lehren und Lernen mit Medien stellt vor dem Hintergrund verschiedener Ansätze zum Lehren und Lernen mit Medien die handlungs- und entwicklungsorientierte Didaktik eine bedeutsame Grundlage für die vorliegende Forschungsarbeit dar. Sie wird bezüglich der Prinzipien der Situations-, Bedürfnis-, Erfahrungs- und Entwicklungsorientierung, der Bedeutsamkeit komplexer, lernprozessanregender Aufgabenstellungen und einer idealtypischen Strukturierung von Unterricht mit theoretischen Grundlagen interkultureller Kompetenz und Vorgehensweisen zu ihrer Förderung in Beziehung gesetzt.
Hinsichtlich des forschungsmethodischen Vorgehens wird auf Basis einer Gegenüberstellung verschiedener Ansätze der gestaltungsorientierten Bildungsforschung der Ansatz einer praxis- und theorieorientierten Entwicklung und Evaluation von Konzepten unterrichtlichen Handelns für die vorliegende Forschungsarbeit begründet ausgewählt und seine Umsetzung erläutert.
Im Rahmen der ersten Studie wird auf der Basis theoretischer und empirischer Grundlagen interkultureller Kompetenz und didaktischer Zugänge ein pädagogisches Konzept zur Förderung interkultureller Kompetenz von Schülerinnen und Schülern der Sekundarstufe I unter Verwendung digitaler Medien entwickelt und für eine achte Klasse am Gymnasium konkretisiert. Das Konzept wird hinsichtlich seiner Zielerreichung sowie auftretender Nebenwirkungen unter Einsatz von Mixed Methods evaluiert. Die Ergebnisse weisen unter anderem darauf hin, dass das entwickelte Unterrichtskonzept zur Förderung interkultureller Kompetenz der Schülerinnen und Schüler beigetragen hat.
Die zweite Studie stellt eine ergänzende qualitative Studie dar, mit dem Ziel, die gemeinsame Mediengestaltung in Zusammenarbeit von Lernenden mit und ohne Flucht- bzw. Migrationserfahrung als bedeutsame Lernaktivität des Unterrichtskonzepts vertiefend zu untersuchen und Vorgehensweisen des kollaborativen Gestaltungsprozesses, die aus der Perspektive der Schülerinnen und Schüler wichtig sind, zu identifizieren. Hierzu werden die subjektiven Sichtweisen der Gymnasiastinnen und Gymnasiasten auf die Gestaltung medialer Beiträge in interkultureller Begegnung unter Bezugnahme auf interkulturelle Sensibilität in Fokusgruppen erhoben und qualitativ-inhaltsanalytisch ausgewertet. Die Ergebnisse der qualitativen Inhaltsanalyse zeigen, dass im Rahmen der Mediengestaltung verschiedene Komponenten interkultureller Sensibilität angesprochen wurden. Beispielsweise geben einige Gymnasiastinnen und Gymnasiasten an, dass ihnen sowohl die Zusammenarbeit mit den Mittelschülerinnen und -schülern als auch die gemeinsame Mediengestaltung Freude bereitete.
In der dritten Studie werden die von den Schülerinnen und Schülern gestalteten Medienbeiträge aus interkulturell-kommunikativer und medienbezogener Perspektive vertiefend analysiert. Die Auswertung erfolgt durch qualitative Inhaltsanalysen hinsichtlich wesentlicher Aspekte der Kommunikationssituation, der Medienmerkmale sowie Bezugspunkten zur behavioralen Dimension interkultureller Kompetenz. Aus den Ergebnissen der Videoanalysen geht unter anderem hervor, dass die interkulturellen Begegnungssituationen, die im Rahmen der Beiträge dargestellt werden, aus kommunikationstheoretischer Perspektive komplex und vielschichtig sind.
Nach einer abschließenden kritischen Methodenreflexion werden Ergebnisse der Studien zusammengeführt und interpretiert. Beispielsweise geht aus der Zusammenführung der Ergebnisse aus der ersten und der zweiten Studie hervor, dass sich zwischen Pre- und Post-Test eine statistisch signifikante Steigerung des Mittelwertes der Komponente Aufmerksamkeit während der interkulturellen Interaktion ergibt, was unter Berücksichtigung der Resultate aus den Fokusgruppen als gesteigertes Interesse der Probandinnen und Probanden an den Schülerinnen und Schülern der Mittelschulklasse im Laufe der gemeinsamen Videogestaltung gedeutet werden kann. Die vergleichende Betrachtung von Ergebnissen aus der ersten und der dritten Studie zeigt, dass mit einer Steigerung des Summenscores der behavioralen Dimension interkultureller Kompetenz Bezüge zu verschiedenen Komponenten der behavioralen Dimension im Rahmen der gestalteten Videos in Verbindung stehen.
Hinsichtlich der Konsequenzen für zukünftige Forschung wird abschließend auf die Notwendigkeit der Entwicklung von Verfahren zur Erfassung interkultureller Kompetenz von Jugendlichen mit unzureichenden Deutschkenntnissen verwiesen. Bezüglich der Praxis in Schule und Unterricht ist die Förderung interkultureller Kompetenz unter Verwendung und Gestaltung digitaler Medienangebote bzw. -beiträge als schulische Querschnittsaufgabe aller Jahrgangsstufen, Fächer und Schulformen wahrzunehmen. Insgesamt leistet die vorliegende Forschungsarbeit damit einen Beitrag zur Verknüpfung der Förderung interkultureller Kompetenz mit der interkulturell-kooperativen Gestaltung medialer Beiträge.
Development Of A Human iPSC-Derived Cortical Neuron Model Of Adaptor- Protein-Complex-4-Deficiency
(2024)
Adaptor-protein-4-deficiency (AP-4-deficiency) is an autosomal-recessive childhood- onset form of complicated hereditary spastic paraplegia (HSP) caused by bi-allelic loss- of-function mutations in one of the four subunits of the AP-4-complex. These four conditions are named SPG47 (AP4B1, OMIM #614066), SPG50 (AP4M1, OMIM #612936), SPG51 (AP4E1, OMIM #613744) and SPG52 (AP4S1, OMIM #614067), respectively and all present with global developmental delay, progressive spasticity and seizures. Imaging features include a thinning of the corpus callosum, ventriculomegaly and white matter changes. AP-4 is a highly conserved heterotetrameric complex, which is responsible for polarized sorting of transmembrane cargo including the autophagy- related protein 9 A (ATG9A). Loss of any of the four subunits leads to an instable complex and defective sorting of AP-4-cargo. ATG9A is implicated in autophagosome formation and neurite outgrowth. It is missorted in AP-4-deficient cells and CNS-specific knockout of Atg9a in mice results in a phenotype reminiscent of AP-4-deficiency. However, the AP-4-related cellular phenotypes including ATG9A missorting have not been investigated in human neurons.
Thus, the aim of this study is to provide the first human induced pluripotent stem cell- derived (iPSC) cortical neuron model of AP-4-deficiency to explore AP-4-related phenotypes in preparation for a high-content screening. Under the hypothesis that AP-4- deficiency leads to ATG9A missorting, elevated ATG9A levels, impaired autophagy and neurite outgrowth in human iPSC-derived cortical neurons, in vitro biochemical and imaging assays including automated high-content imaging and analysis were applied. First, these phenotypes were investigated in fibroblasts from three patients with compound heterozygous mutations in the AP4B1 gene and their sex-matched parental controls. The same cell lines were used to generate iPSCs and differentiate them into human excitatory cortical neurons.
This work shows that ATG9A is accumulating in the trans-Golgi-network in AP-4- deficient human fibroblasts and that ATG9A levels are increased compared to parental controls and wild type cells suggesting a compensatory mechanism. Protein levels of the AP4E1-subunit were used as a surrogate marker for the AP-4-complex and were decreased in AP-4-deficient fibroblasts with co-immunoprecipitation confirming the instability of the complex. Lentiviral re-expression of the AP4B1-subunit rescues this corroborating the fact that a stable AP-4-complex is needed for ATG9A trafficking. Surprisingly, autophagic flux was present in AP-4-deficient fibroblasts under nutrient- rich and starvation conditions. These phenotypic markers were evaluated in iPSC-derived cortical neurons and here, a robust accumulation of ATG9A in the juxtanuclear area was seen together with elevated ATG9A protein levels. Strikingly, assessment of autophagy markers under nutrient-rich conditions showed alterations in AP-4-deficient iPSC- derived cortical neurons indicating dysfunctional autophagosome formation. These findings point towards a neuron-specific impairment of autophagy and need further investigation. Adding to the range of AP-4-related phenotypes, neurite outgrowth and branching are impaired in AP-4-deficient iPSC-derived cortical neurons as early as 24h after plating and together with recent studies point towards a distinct role of ATG9A in neurodevelopment independent of autophagy.
Together, this work provides the first patient-derived neuron model of AP-4-deficiency and shows that ATG9A is sorted in an AP-4-dependent manner. It establishes ATG9A- related phenotypes and impaired neurite outgrowth as robust markers for a high-content screening. This disease model holds the promise of providing a platform to further study AP-4-deficiency and to search for novel therapeutic targets.