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H-Y-specific and H-2Db-restricted, Lyt-1 "2+ T-cell clones (CTLL) with graded specific cytotoxic activities on male C57BL/6 (B6) target cells (1E3, +++; 2C5, ++; 2A5, +, 3E6, ±) were tested for their capacity to inhibit the generation of H-Y-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) in vitro. Addition of irradiated lymphocytes of CTLL 1E3 and CTLL 3E6 but not those of CTLL 2A5 or CTLL 2C5 abolished the generation of CTL from in vivo primed H-Y-specific precursor cells (CTLP) when added to fresh mixed-lymphocyte cultures (MLC). Exogenous sources of T-cell growth factors (TCGF) did not overcome suppression. Rather the presence of TCGF resulted in a further enhancement of suppressive activities in CTLL 1E3 and 3E6 and the induction of similar activities in cells from CTLL 2A5 and 2C5, which by themselves were not inhibitory. Moreover when added to similar MLC on Day 1 instead of Day 0, only irradiated cells of CTLL 3E6 but not those of the other three CTLL were suppressive. Induction of suppressive activities in H-Y-specific CTLL was independent of the appropriate male stimulator cells since it was also observed in MLC induced by irrelevant antigens (H-2, trinitrophenol). Furthermore at low cell numbers, irradiated lymphocytes from any of the CTLL consistently enhanced CTL activities generated from H-Y-specific CTLP. This augmenting activity, which was not TCGF, could be transferred by soluble mediators present in antigen-sensitized CTLL cultures. Thus, these data indicate (i) that cytotoxic effector cells can function as suppressor cells in the generation of CTL, (ii) that the cytotoxic activity of cloned CTL does not correlate with their capacity to suppress CTL responses, (iii) that the inhibition of CTL responses by CTLL is not due to simple consumption of T-cell growth factors produced in MLC, and (iv) that different CTL clones may interfere with the generation of CTL at different stages of their maturation. Moreover, the experiments suggest an antigen-independent enhancement of suppression by the interaction of CTL with lymphokines. Together with the augmenting activity evoked by cloned CTL the data provide strong evidence for the expression of multiple immunological functions by one particular subset of T cells and suggest that cytotoxic effector cells can differentially regulate the maturation and/or clonal expression of their precursor cells.
Mouse H-Y-specific and I-Ab restricted T-cell clones have been established and compared for their helper effects in the differentiation ofboth T and B Iymphocytes. The results demonstrate that three individual T -cell clones and one subclone could help in the antigen-driven induction of cytotoxic Iymphocytes (CTL) from their precursor cells (CTL-P), and were able to activate B cells to develop into antibody-secreting cells (PFC) in the presence of SRBC, provided the cloned T cells were restimulated by H-Y antigen on antigen-presenting cells. In addition, antigen or lectin could induce the same H -Y -specific T -cell clones to secrete factor(s) expressing helper activities similar to that ofthe cloned T cells. Furthermore, it is shown that the T cell-derived soluble mediator(s) was distinct from T-cell growth factor (TCGF) and from immune interferon (lFN-y). The data reveal a new type ofT cell with helper potential for the activation ofCTL-P and B Iymphocytes, and suggest the existence of distinct T helper cells which can provide help for both cytotoxic and antibody responses by virtue of different Iymphokine activities.
We have recently demonstrated that the frequency ofT cells expressing granzyme A is significantly higher in skin lesions and spleens of susceptible BALB/c mice compared with resistant C57BL/6 mice infected with Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. In the present study, we have performed in vitro studies to characterize the subpopulation, the antigen responsiveness and the lymphokine production pattern of granzyme A-expressing T cells in L. major-infected mice. Using a limiting dilution system for functional analysis of selected T cells at the clonallevel, we could show that granzyme A activity in infected BALB/c mice can be assigned to L. major-reactive CD4\(^+\) T cells secreting interleukin-2 (IL-2) and IL-4. Granzyme A production was most pronounced in the early phase of infection. On the other hand, granzyme A expression could not be detected in C57BL/6-derived T cells responding to L. major. The da ta support the suggestion that granzyme A is produced by L. major-responsive CD4\(^+\) T cells facilitating lesion formation and the dissemination of infection.
Schwämme (Phylum Porifera) sind der älteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die Hälfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexität des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schwämmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, für das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellulären Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-ähnlichen intrazellulären Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abhängige, als auch kultivierungs-unabhängige Versuchsansätze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. Während auf dem ‚dilution-to-extinction‘-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur führten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications‘) umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazitäten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabhängigen Methode eine spezifische Verknüpfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schwämmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gewährte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekundärmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms führte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information über diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen über den poribakteriellen Primär- und Sekundärstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und bestätigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenität innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von möglichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis für eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schwämmen vorzufinden sind. Dieser Studie gewährte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterführende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.
Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.
The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.
The major macromolecule on the surface o/Leishmania majorpromastigotes is a lipophosphoglycan (LPG). This glycoconjugate plays a key role in determining infectivity and survival of para-sites in the mammalian host cell. In addition, L. major LPG is able to induce a host-protective immune response. In this article, we summarise the evidence for recognition of highly purified LPG by T cells and we discuss the potential mechanisms of T-cell Stimulation by this non-protein antigen.
Ten monoclonal antibodies (McAbs) raised to Schistosoma japonicum eggs could be assigned using several serological and immunochemical techniques to 3 groups. The McAbs, termed A, B and C-McAbs, apparently recognize carbohydrate epitopes that can be located on the same antigen molecule. The antibodies, generally of IgM isotype, are idiotypically related. They are distinct from another IgM McAb (Group D-McAb) the carbohydrate target epitope of which can also be associated with the epitopes of A. B and C-McAbs. The McAbs produce large vacuolated bleb reactions in the circumoval precipitin test (COPT) and target epitopes have different representations in various life cycle stages such as immature and mature eggs, male and female worms (including S. mansoni). Antigens affinity purified on columns containing A, B, C and D-McAbs stimulate proliferation of T cells from egg-sensitized mice and elicit DTH reactions in such mice. This raises the possibility that the target antigens of these carbohydrate-reactive monoclonal antibodies are immunopathologic and involved in egg-induced granuloma formation.