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ResearcherID
- J-8841-2015 (1)
- N-2030-2015 (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 311781 (1)
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden.
Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden.
Zur Gattung Bordetella zählen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii gehört zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-ähnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine für die „klassischen“ Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filamentösen Hämagglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufwärts von einem putativen Membranprotein und stromabwärts von einem IS1001-ähnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die größte Ähnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung bestärkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminosäuresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddomäne sowie eine TPS-Domäne identifiziert werden. Dies lässt vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfläche transportiert und möglicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedomäne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv könnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen“ Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Adäsionsfähigkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adhäsionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adhäsionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adhäsionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 lässt zudem auf die Beteiligung weiterer Adhäsionsfaktoren an der Wirtszelladhäsion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii über zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abhängigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die Ähnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5’- T/A T T C C/T T A -3’ aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell für die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zunächst die primäre BvgABH-Bindestelle BS2 mit der höchsten Affinität von BvgABH-P gebunden, wobei für BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekundäre Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabwärts von BS2 befindet. Eine möglicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, hauptsächlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zurückzuführen. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabwärts und könnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gewährleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei höheren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abhängige fhaBBH-Expression unterstützt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gewährleisten.
Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.
Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein.
Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.
In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden.
Neurodegenerative Erkrankungen des Menschen sind eines der Hauptfelder molekularer neurobiologischer Grundlagenforschung. Um generell molekulare, komplizierte Vorgänge in vivo untersuchen zu können, nutzt man seit geraumer Zeit Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster. In der vorliegenden Arbeit wird die Drosophila-Neurodegenerationsmutante loe (löchrig) beschrieben, die als Modell für die Rolle des Cholesterinhaushalts im Bezug auf Neurodegeneration herangezogen werden kann. Die Fliegen dieser Mutante zeigen stark progressive, altersabhängige Degeneration von Neuronen, dabei unterlaufen diese Nervenzellen einen nekrotischenZelltod. Verantwortlich für diese Mutation ist die Insertion eines P-Elementes in einem Intron des Drosophila-g-5'-AMP-aktivierten Proteinkinase- (AMPK)-Gens. Die verschiedenen Spleißprodukte des loe Gens kodieren für die regulatorische g-Untereinheit des AMPK-Komplexes, der , aktiviert durch 5'AMP, energieintensive Prozesse negativ reguliert. Die Spleißform loeI ist durch die P-Element-Insertion betroffen, Anteile des P-Elementes werden in das loeI-Transkript hineingespleißt. Eine neuronale Expression von loeI im loe-Hintergrund führt zur Revertierung des loe-Phänotypes. Mit der Expression anderer Spleißformen kann dieser Effekt nicht erzielt werden. Das LOE I-Protein birgt in seinem N-Terminus eine Reihe möglicher Interaktionstellen mit anderen Proteinen, die den AMPK-Komplex in einen Kontext mit den Proteinen der APP (Amyloid Precursor Proteins) ?Familie stellen oder z. B. Interaktionen mit dem Cytoskelett herstellen können. Eine molekulare Interaktion mit NiPSNAP, einem Protein, dass vermutlich eine Rolle im Vesikelverkehr spielt, konnte nachgewiesen werden. Ein direktes humanes Homolog von LOE I ist nicht bekannt, wohlgleich es im Menschen drei AMPK-g-Untereinheiten gibt, von denen zwei ähnliche Funktionen übernehmen könnten wie LOE I. Die loe-Mutante interagiert genetisch mit der Mutante clb ? columbus, die einen Defekt im Gen der HMG-CoA-Reduktase trägt. Dieses Emzym ist das Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Die Art der Interaktion belegt eine negative Regulierung der HMG-CoA-Reduktase durch die AMPK. So schwächt die clb-Mutation den neurodegenerativen loe-Phänotyp ab, eine Überexpression von clb verstärkt diesen. Eine Verminderung der Neurodegeneration kann auch mit Medikamenten erreicht werden: Statine, potente Hemmer der HMG-COA-Reduktase, reprimieren deutlich den loe-Phänotyp. In loe ist der Cholesterinester-Spiegel auf 40% abgesenkt. Eine weitere genetische Interaktion von loe konnte nachgewiesen werden: Die Mutante für das Drosophila-Homolog von APP (Appl) verstärkt den neurodegenerativen Phänotyp in loe stark, wogegen die Appl-Mutante selbst keine neurodegenerativen Defekte aufweist. Darüberhinaus zeigt die Doppelmutante Defekte, die keine der Einzelmutanten aufweist: Sterilität oder eine extrem kurze Lebensdauer von nur 3-4 Tagen. Diese Interaktion ließ sich auf molekularer Ebene charakterisieren. Die proteolytische Prozessierung von APPL durch Sekretasen ist in loe alteriert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die loe-Mutation die b-Sekretase aus Vertebraten (BACE) und eine bisher noch nicht beschriebene endogene Sekretase aus Drosophila negativ beeiflusst werden. Ein AMPK-Komplex mit LOE I als g-Untereinheit scheint über den Cholesterinester-Spiegel die Aktivität einer speziellen Untergruppe der Sekretasen zu beeinflussen. Die Missfunktion dieser Sekretasen ist ein kritischer Punkt in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Die loe-Mutation wirft neues Licht auf die bekannten Verbindungen zwischen Cholesterin-Stoffwechsel, Vesikelverkehr und Prozessierung von APP(L). Mit den großen Möglichkeiten, die die Drosophila-Genetik bietet, stellt diese neue Mutante ein weiteres Werkzeug zur Charakterisierung von Therapie-Ansätzen für die Alzheimer-Kankheit dar. Die vorliegende Arbeit belegt um ein weiteres Mal, dass Drosophila ein potentes Modellsystem zur Untersuchung humaner, neurodegenerativer Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson oder der Alzheimer Krankheit ist.
Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden.