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SNAP25 (Synaptosomal-Associated Protein of 25 kDa; part of the SNARE complex) is involved in the docking and fusion of synaptic vesicles in presynaptic neurons necessary for the regulation of neurotransmitter release, as well as in axonal growth and synaptic plasticity. In humans, different single nucleotide polymorphisms of SNAP25 have repeatedly been associated with attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD). Thus, in this study heterozygous Snap25 knockout mice were investigated as a model of ADHD.
Heterozygous (+/-) Snap25 knockout mice as well as their wild-type (+/+) littermates were reared under control conditions or underwent a Maternal Separation (MS) procedure. Starting at the age of 2 months, mice were tested for locomotor activity in a repeated long-term Open Field (OF) task, for attention deficits and impulsive behavior in the 5 Choice Serial Reaction Time Task (5CSRTT), for anxiety-like behavior in the Light-Dark Box (LDB) and for depression-like behavior in the Porsolt Forced Swim Test (FST). The brains of these mice were subsequently tested for the expression of several ADHD related genes in a quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) study. Another group of female mice (+/+; +/-) underwent a one hour OF test after oral administration of 45 mg/kg Methylphenidate (MPH) or placebo.
To find an optimized dosage for this MPH challenge, a pilot study was performed. Wild-type C57BL/6 mice were tested in a long-term OF with several dosages of MPH both intraperitoneally (i.p.) and orally. The brains of these animals were afterwards investigated for neurotransmitter concentrations. In this pilot study the dosages of MPH that were similarly behaviorally effective without causing symptoms of overdosing were 7.5-15 mg/kg intraperitoneally and 30-60 mg/kg orally. However, even though it was possible to find intraperitoneal and oral doses that correlate behaviorally, the neurochemistry was mostly different.
In the study on Snap25-deficient mice, unstressed controls showed a hyperactive phenotype in the second of two long-term OF sessions (60 min) spaced three weeks apart. Considering all groups, there was a significant interaction of stress and genotype in the second session, with animals subjected to MS being overall hyperactive with no genotype differences. In the training phase of the 5CSRTT only effects of stress were found, with MS animals finding and consuming fewer rewards. In the single test trial, several genotype effects became apparent, with tendencies for the number of correct nose pokes and the number of rewards eaten, and a significant effect for the number of rewards eaten directly after the correct response. In all of these variables +/- mice performed worse than their wild-type littermates. In the LDB +/- mice entered the lit compartment of the arena earlier than the controls, thus showing attenuated anxiety-like behavior. Regarding depressive-like behavior in the FST, male +/- mice spent significantly less time struggling than male +/+ mice. In the gene expression study, +/- mice had lower expression levels of Maoa and Comt, and higher expression levels of Nos1 than wild-types. Finally, the locomotor activity response to MPH was exaggerated in +/- mice as compared to controls.
Heterozygous Snap25 knockout mice show some of the behavioral characteristics of ADHD, as for example a mild hyperactivity in a familiar environment, difficulties in the correct execution of a given task and even some behavior that can be interpreted as delay aversion. Additionally, expression levels of three ADHD related genes were changed in these animals. Although the exaggerated locomotor activity response to MPH is not to be expected of an ADHD model, the difference in the response between +/+ and +/- mice nonetheless implicates a potential dysfunction of the brain dopaminergic system.
Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.
Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.
Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.
Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos.
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.
In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war.
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
Die Rolle der Hirnrinde als Zentrum komplexer Funktionen wie Lernen und Ge-dächtnis wird nicht zuletzt durch deren komplexe, in Schichten organisierte Architek-tur ermöglicht. Von entscheidender Bedeutung ist die präzise Positionierung von Nervenzellen, die im Laufe der Embryonalentwicklung in der Ventrikularzone (VZ) geboren werden und anschließend in radialer Richtung zu ihrem Bestimmungsort wandern. Die Funktion des Neurotrophin-Rezeptors TrkB an der Entwicklung des zerebralen Kortex war Gegenstand dieser Arbeit. Am Tag 12,5 der Embryonalentwicklung konnte die Expression von TrkB so-wohl in den Zellen der VZ als auch in neu geborenen Neuronen der Präplatte nach-gewiesen werden. Die Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte dabei unabhängig von den beiden Liganden BDNF und NT-3. Ebenso führten BDNF oder NT-3 zu keiner zellulären Antwort in isolierten kortikalen Vorläuferzellen, wohingegen die Stimulation mit EGF eine Phosphorylierung von TrkB an der PLCγ- und der Shc-Bindungsstelle hervorrief. Durch pharmakologische Inhibition und die Überexpression dominant negativer Src-Mutanten konnte die Beteiligung des EGF-Rezeptors und zweier neuronal exprimierter Src-Kinasen, cSrc und Fyn, an dieser Transaktivierung von TrkB durch EGF gezeigt werden. Durch die Zugabe von EGF kam es im Zuge der Aktivierung von TrkB auch zur Umverteilung des Rezeptors von intrazellulären Kompartimenten zur Zellmem-bran. Die Retention des Rezeptors im Zytoplasma wurde über post-translationelle Modifikation reguliert. Die Verhinderung von N-Glykosylierung durch Tunicamycin-Behandlung kortikaler Vorläuferzellen führte zur Exposition von TrkB an der Zellober-fläche und konnte so Responsivität gegenüber BDNF herstellen. Die physiologische Bedeutung einer Transaktivierung von TrkB durch EGF wurde durch das Fehlen der TrkB-Aktivierung in EGFR KO-Mäusen am Embryonal-tag 12,5 gezeigt. Dies hatte eine fehlerhafte Positionierung kortikaler Nervenzellen zum Zeitpunkt E15,5 zur Folge. Anhand eines Migrationsassays konnte schließlich gezeigt werden, dass die EGF-induzierte Wanderung kortikaler Vorläuferzellen in vitro mit einer asymmetrischen Translokation von TrkB einhergeht. Über die Transaktivierung von TrkB in frühen Phasen der Kortexentwicklung spielt EGF eine wichtige Rolle bei der Induktion neuronaler Differenzierung und ist an der Regulation der Wanderung postmitotischer Neurone in der Hirnrinde beteiligt.
Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen.
The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function.
A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases.
One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far.
The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts.
Der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe
(2017)
Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden.
Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert.
Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ.
Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen.
Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz.
Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten.
Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von
50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich.
Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde.
Hirntumoren werden nach histologischen und molekulargenetischen Gesichtspunkten unterteilt. Neben dem Krankheitsverlauf unterscheiden sich LGA auch genetisch von GBM. Wie die mRNA der Proteine ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 und TTK in LGA exprimiert ist bzw. sich im Verlauf verändert, war in dieser Form noch nicht in einem Patientenpanel untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, die mRNA-Expressionsraten zu bestimmen sowie Korrelationen und Kointegrationen mit klinischen Daten zu analysieren. Außerdem wurden Besonderheiten der Verteilung innerhalb des Patientenpanels beschrieben. Quantitative-PCR-Analysen wurden durchgeführt. Die Expressionswerte wurden auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH normalisiert. Die resultierenden ∆CTm - bzw. ∆∆CT-Werte sowie die klinischen Patientendaten waren Basis für Kointegrations-, Korrelations-, Expressions-, Ähnlichkeits- und Verlaufsanalysen. KiSS1 schien generell kaum oder nicht in der Vielzahl der Tumoren exprimiert zu sein, Aussagen zur klinischen Korrelation erwiesen sich als schwierig. Für RPS27 konnten tendenziell niedrigere Werte in den Verlaufstumoren im Vergleich zu den LGA gefunden werden. Auch für BRMS1 war in der Mehrzahl der Fälle die mRNA der Vorläufertumoren in Relation zu den Rezidiven stärker exprimiert. ATF5 korrelierte nach Kendall RE und PFS (-0,324; p=0,077) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA, für TTK nach Kendall OS und RE (-0,444; p=0,097) im Gesamtpanel und nach Pearson auch RE und PFS (-0,43; p=0,096) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential muriner hämatopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression untersucht. Zur Veränderung der Genexpression wurden für die beiden adulten Stammzelltypen zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze gewählt: In hämatopoetischen Stammzellen wurden molekulare Regulatoren der Hämatopoese durch retroviral vermittelten Gentransfer überexprimiert und anschließend ihr in vitro Verhalten und in vivo in Maustransplantationsmodellen ihre Rekonstitutionsfähigkeit untersucht. Neurale Stammzellen wurden gleichzeitig mit den Chromatin-modifizierenden Substanzen Trichostatin A (TSA) und 5-Aza-2´-desoxycytidin (AzadC) behandelt, im Anschluß ihre Sensitivität gegenüber der Behandlung in vitro bestimmt und ihr hämatopoetisches Entwicklungspotential in vivo analysiert. In hämatopoetischen Stammzellen wurde der Transkriptionsfaktor HOXB4, die hämatopoetische Vorläuferkinase 1 (HPK1) oder eine Kinase-inaktive Mutante der HPK1 (HPK1M46) durch retrovirale Transduktion überexprimiert. Der Transfer wildtypischer HPK1 oder HPK1M46 Gene in Knochenmarkzellen hatte in vitro keinen meßbaren Einfluß auf die Proliferation und Anzahl primitiver Vorläuferzellen, was auch nach Expression verschiedener Proteinmengen beobachtet wurde. Das Repopulationsverhalten hämatopoetischer Stammzellen, die mit wildtypischer HPK1 transduziert wurden, war vergleichbar mit dem kontrolltransduzierter Stammzellen. Nach HPK1M46 Transduktion zeigten hämatopoetische Stammzellen in vivo ein reduziertes Langzeitrepopulationsverhalten und Knochenmarkzellen ex vivo ein eingeschränktes Koloniebildungspotential. Sowohl mit wildtypischer HPK1 als auch mit HPK1M46 transduzierte hämatopoetische Stammzellen wiesen ein normales Multilinienbesiedlungspotential auf. Nach Transduktion von Knochenmarkzellen mit HOXB4, einem wichtigen Regulator der Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen, konnten diese in vitro expandiert werden, ohne daß sie, wie dies bei kontrolltransduzierten Knochenmarkzellen auftrat, phänotypisch Differenzierungsmarker ausbildeten. Nach HOXB4 Transduktion akkumulierte eine homogene, Mac-1niedrig exprimierende Zellpopulation im Gegensatz zu einer Mac-1hoch, Gr-1 sowie c-kit positiven Population, die sich in den Kontrollkulturen entwickelte. Auf mRNS Ebene wurden nur in den Kontrollkulturen Transkripte hochreguliert, die für differenzierende Zellen spezifisch sind, wie z. B. Zyklin D1 während myeloider Differenzierung. Die Überexpression von HOXB4 ermöglichte eine konstante Proliferationsrate und hatte auf das Verhältnis von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen jedoch keinen Einfluß. Entsprechend blieb das Expressionsmuster an Zyklinen, Zyklin-abhängigen Kinasen und Mitgliedern des Transkriptionsaktivators AP-1 in HOXB4 transduzierten Knochenmarkzellen über den beobachteten Zeitraum konstant. Durch die Überexpression von HOXB4 kann somit in kultivierten Knochenmarkzellen in vitro eine stabile Proliferationsrate induziert und parallel eine fortschreitende Differenzierung der Knochenmarkkultur aufgehalten oder zumindest verzögert werden. Sowohl wildtypische als auch bcl-2 transgene neurale Stammzellen, die mit den Epigenotyp-verändernden Substanzen TSA und AzadC behandelt wurden, zeigten nach Transplantation in bestrahlte adulte Rezipienten hämatopoetisches Entwicklungspotential, das unbehandelte neurale Stammzellen nicht aufwiesen. Die Frequenz chimärer Tiere konnte durch Verwendung bcl-2 transgener neuraler Stammzellen erhöht werden und bereits in vitro wiesen wildtypische und bcl-2 transgene neurale Stammzellen unterschiedliche Sensitivität gegenüber der TSA/AzadC Behandlung auf. Diese von behandelten neuralen Stammzellen vermittelte Rekonstitution des hämatopoetischen Systems war langanhaltend und fand sowohl in der myeloiden als auch in der lymphoiden Linie statt. Eine erfolgreiche hämatopoetische Besiedlung war auch nach Transplantation klonaler neuraler Stammzellen zu beobachten, so daß eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen als Ursache der Rekonstitution ausgeschlossen werden konnte. Die beobachtete Generierung der morphologisch und phänotypisch intakten hämatopoetischen Zellen aus neuralen Zellen war nicht das Ergebnis einer Zellfusion von Rezipientenzellen mit injizierten Donorzellen. Denn die hämatopoetischen Donorzellen trugen einen normalen 2n Karyotyp und wiesen keine Heterokaryons auf, die für Fusionen charakteristisch wären. Somit ist es möglich, durch die Veränderung des Epigenotyps neuraler Stammzellen gefolgt von einer Transplantation in eine hämatopoetische Mikroumgebung eine Transdifferenzierung neuraler in hämatopoetische Zellen zu induzieren.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.