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Molecular modelling and simulation are powerful methods in providing important in-formation on different biological systems to elucidate their structural and functional proper-ties, which cannot be determined in experiment. These methods are applied to analyse versa-tile biological systems: lipid membrane bilayers stabilized by an intercalated single wall carbon nanotube and retroviral proteins such as HIV protease and integrase. HIV-1 integrase has nuclear localization signals (NLS) which play a crucial role in nuclear import of viral preintegration complex (PIC). However, the detailed mechanisms of PIC formation and its nuclear transport are not known. Previously it was shown that NLSs bind to the cell transport machinery e.g. proteins of nuclear pore complex such as transportins. I investigated the interaction of this viral protein HIV-1 integrase with proteins of the nuclear pore complex such as transportin-SR2 (Shityakov et al., 2010). I showed that the transportin-SR2 in nuclear import is required due to its interaction with the HIV-1 integrase. I analyzed key domain interaction, and hydrogen bond formation in transportin-SR2. These results were discussed in comparison to other retroviral species such as foamy viruses to better understand this specific and efficient retroviral trafficking route. The retroviral nuclear import was next analyzed in experiments regarding the retroviral ability to infect nondividing cells. To accomplish the gene transfer task successfully, ret-roviruses must efficiently transduce different cell cultures at different phases of cell cycle. However, promising and safe foamy viral vectors used for gene transfer are unable to effi-ciently infect quiescent cells. This drawback was due to their inability to create a preintegra-tion complex (PIC) for nuclear import of retroviral DNA. On the contrary, the lentiviral vec-tors are not dependant on cell cycle. In the course of reverse transcription the polypurine tract (PPT) is believed to be crucial for PIC formation. In this thesis, I compared the transduction frequencies of PPT modified FV vectors with lentiviral vectors in nondividing and dividing alveolar basal epithelial cells from human adenocarcinoma (A549) by using molecular cloning, transfection and transduction techniques and several other methods. In contrast to lentiviral vectors, FV vectors were not able to effi-ciently transduce nondividing cell (Shityakov and Rethwilm, unpublished data). Despite the findings, which support the use of FV vectors as a safe and efficient alternative to lentiviral vectors, major limitation in terms of foamy-based retroviral vector gene transfer in quiescent cells still remains. Many attempts have been made recently to search for the potential molecules as pos-sible drug candidates to treat HIV infection for over decades now. These molecules can be retrieved from chemical libraries or can be designed on a computer screen and then synthe-sized in a laboratory. Most notably, one could use the computerized structure as a reference to determine the types of molecules that might block the enzyme. Such structure-based drug design strategies have the potential to save off years and millions of dollars compared to a more traditional trial-and-error drug development process. After the crystal structure of the HIV-encoded protease enzyme had been elucidated, computer-aided drug design played a pivotal role in the development of new compounds that inhibit this enzyme which is responsible for HIV maturation and infectivity. Promising repre-sentatives of these compounds have recently found their way to patients. Protease inhibitors show a powerful sustained suppression of HIV-1 replication, especially when used in combi-nation therapy regimens. However, these drugs are becoming less effective to more resistant HIV strains due to multiple mutations in the retroviral proteases. In computational drug design I used molecular modelling methods such as lead ex-pansion algorithm (Tripos®) to create a virtual library of compounds with different binding affinities to protease binding site. In addition, I heavily applied computer assisted combinato-rial chemistry approaches to design and optimize virtual libraries of protease inhibitors and performed in silico screening and pharmacophore-similarity scoring of these drug candidates. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease bind-ing ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is dis-cussed (Shityakov and Dandekar, 2009). A number of atomistic models were developed to elucidate the nanotube behaviour in lipid bilayers. However, none of them provided useful information for CNT effect upon the lipid membrane bilayer for implementing all-atom models that will allow us to calculate the deviations of lipid molecules from CNT with atomistic precision. Unfortunately, the direct experimental investigation of nanotube behaviour in lipid bilayer remains quite a tricky prob-lem opening the door before the molecular simulation techniques. In this regard, more de-tailed multi-scale simulations are needed to clearly understand the stabilization characteristics of CNTs in hydrophobic environment. The phenomenon of an intercalated single-wall carbon nanotube in the center of lipid membrane was extensively studied and analyzed. The root mean square deviation and root mean square fluctuation functions were calculated in order to measure stability of lipid mem-branes. The results indicated that an intercalated carbon nanotube restrains the conformational freedom of adjacent lipids and hence has an impact on the membrane stabilization dynamics (Shityakov and Dandekar, 2011). On the other hand, different lipid membranes may have dissimilarities due to the differing abilities to create a bridge formation between the adherent lipid molecules. The results derived from this thesis will help to develop stable nanobiocom-posites for construction of novel biomaterials and delivery of various biomolecules for medi-cine and biology.
Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker.
In many animals the ability to navigate over long distances is an important prerequisite for foraging. For example, it is widely accepted that desert ants and honey bees, but also mammals, use path integration for finding the way back to their home site. It is however a matter of a long standing debate whether animals in addition are able to acquire and use so called cognitive maps. Such a 'map', a global spatial representation of the foraging area, is generally assumed to allow the animal to find shortcuts between two sites although the direct connection has never been travelled before. Using the artificial neural network approach, here we develop an artificial memory system which is based on path integration and various landmark guidance mechanisms ( a bank of individual and independent landmark-defined memory elements). Activation of the individual memory elements depends on a separate motivation network and an, in part, asymmetrical lateral inhibition network. The information concerning the absolute position of the agent is present, but resides in a separate memory that can only be used by the path integration subsystem to control the behaviour, but cannot be used for computational purposes with other memory elements of the system. Thus, in this simulation there is no neural basis of a cognitive map. Nevertheless, an agent controlled by this network is able to accomplish various navigational tasks known from ants and bees and often discussed as being dependent on a cognitive map. For example, map-like behaviour as observed in honey bees arises as an emergent property from a decentralized system. This behaviour thus can be explained without referring to the assumption that a cognitive map, a coherent representation of foraging space, must exist. We hypothesize that the proposed network essentially resides in the mushroom bodies of the insect brain.
Non-target effects of a multiple insect resistant Bt-maize on the honey bee (Apis mellifera L.)
(2011)
Honey bee pollination is an ecologically and economically important ecosystem service. New methodological developments are needed to research the underlying factors of globally observed bee losses. The honey bee (Apis mellifera) is a key non-target arthropod species for environmental risk assessment of genetically modified (GM) crops. For GM-crop risk assessments, mainly methods for monitoring adult honey bees under laboratory conditions are documented. However, protocols with robust methods for standardized colonies or in vitro reared honey bee larvae are currently lacking. Within the research, presented in this this dissertation, multiple methodological developments are achieved; a mortality trap (Chapter II), a ‘full life cycle test’ (III), a novel in vitro rearing methodology (IV), a standardized in vitro test for Bt-pollen (V), a mixed toxicity test for purified transgenic proteins (VI), and a bacterial flora test with pollen digestion rate monitoring (VII). Overall, the studies did not indicate a detrimental effect caused by Bt-maize pollen, or by purified Bt-proteins at worst case exposure levels. Considering the risk for honey bees and larvae, we conclude that the tested Bt-maize Mon89034xMon88017 is not likely to cause harm to honey bee colonies. The study methods presented are highly recommended for future environmental risk assessment studies testing GM-crop biosafety on honey bees.
HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts.
Background
Squalius alburnoides is an Iberian cyprinid fish resulting from an interspecific hybridisation between Squalius pyrenaicus females (P genome) and males of an unknown Anaecypris hispanica- like species (A genome). S. alburnoides is an allopolyploid hybridogenetic complex, which makes it a likely candidate for ploidy mosaicism occurrence, and is also an interesting model to address questions about gene expression regulation and genomic interactions. Indeed, it was previously suggested that in S. alburnoides triploids (PAA composition) silencing of one of the three alleles (mainly of the P allele) occurs. However, not a whole haplome is inactivated but a more or less random inactivation of alleles varying between individuals and even between organs of the same fish was seen.
In this work we intended to correlate expression differences between individuals and/or between organs to the occurrence of mosaicism, evaluating if mosaics could explain previous observations and its impact on the assessment of gene expression patterns.
Results
To achieve our goal, we developed flow cytometry and cell sorting protocols for this system generating more homogenous cellular and transcriptional samples. With this set-up we detected 10% ploidy mosaicism within the S. alburnoides complex, and determined the allelic expression profiles of ubiquitously expressed genes (rpl8; gapdh and β-actin) in cells from liver and kidney of mosaic and non-mosaic individuals coming from different rivers over a wide geographic range.
Conclusions
Ploidy mosaicism occurs sporadically within the S. alburnoides complex, but in a frequency significantly higher than reported for other organisms. Moreover, we could exclude the influence of this phenomenon on the detection of variable allelic expression profiles of ubiquitously expressed genes (rpl8; gapdh and β-actin) in cells from liver and kidney of triploid individuals. Finally, we determined that the expression patterns previously detected only in a narrow geographic range is not a local restricted phenomenon but is pervasive in rivers where S. pyrenaicus is sympatric with S. alburnoides.
We discuss mechanisms that could lead to the formation of mosaic S. alburnoides and hypothesise about a relaxation of the mechanisms that impose a tight control over mitosis and ploidy control in mixoploids."
Retinoic acid pathway activity in Wilms tumors and characterization of biological responses in vitro
(2011)
Background: Wilms tumor (WT) is one of the most common malignancies in childhood. With current therapy protocols up to 90% of patients can be cured, but there is still a need to improve therapy for patients with aggressive WT and to reduce treatment intensity where possible. Prior data suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) signaling pathway in high-risk WT, but its mode of action remained unclear. Results: The association of retinoid signaling and clinical parameters could be validated in a large independent tumor set, but its relevance in primary nephrectomy tumors from very young children may be different. Reduced RA pathway activity and MYCN overexpression were found in high risk tumors as opposed to tumors with low/ intermediate risk, suggesting a beneficial impact of RA especially on advanced WT. To search for possible modes of action of retinoids as novel therapeutic options, primary tumor cell cultures were treated in vitro with all-trans-RA (ATRA), 9cis-RA, fenretinide and combinations of retinoids and a histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Genes deregulated in high risk tumors showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. 6/7 primary cultures tested reduced proliferation, irrespective of prior RA signaling levels. The only variant culture was derived from mesoblastic nephroma, a distinct childhood kidney neoplasm. Retinoid/HDAC inhibitor combinations provided no synergistic effect. ATRA and 9cis-RA induced morphological changes suggestive of differentiation, while fenretinide induced apoptosis in several cultures tested. Microarray analysis of ATRA treated WT cells revealed differential expression of many genes involved in extracellular matrix formation and osteogenic, neuronal or muscle differentiation. The effects documented appear to be reversible upon drug withdrawal, however. Conclusions: Altered retinoic acid signaling has been validated especially in high risk Wilms tumors. In vitro testing of primary tumor cultures provided clear evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment based on the analysis of gene expression, proliferation, differentiation and apoptosis.
Bees are subject to permanent threat from predators such as ants. Their nests with large quantities of brood, pollen and honey represent lucrative targets for attacks whereas foragers have to face rivalry at food sources. This thesis focused on the role of stingless bees as third party interactor on ant-aphid-associations as well as on the predatory potential represented by ants and defense mechanisms against this threat. Regular observations of an aphid infested Podocarpus for approaching stingless bees yielded no results. Another aim of this thesis was the observation of foraging habits of four native and one introduced ant species for assessment of their predatory potential to stingless bees. All species turned out to be dietary balanced generalists with one mostly carnivorous species and four species predominantly collecting nectar roughly according to optimal foraging theory. Two of the species monitored, Rhytidoponera metallica and Iridomyrmex rufoniger were considered potential nest robbers. As the name implies, stingless bees lack the powerful weapon of their distant relatives; hence they specialized on other defense strategies. Resin is an important, multipurpose resource for stingless bees that is used as material for nest construction, antibiotic and for defensive means. For the latter purpose highly viscous resin is either directly used to stick down aggressors or its terpenic compounds are included in the bees cuticular surface. In a feeding choice experiment, three ant species were confronted with the choice between two native bee species - Tetragonula carbonaria and Austroplebeia australis - with different cuticular profiles and resin collection habits. Two of the ant species, especially the introduced Tetramorium bicarinatum did not show any preferences. The carnivorous R. metallica predominantly took the less resinous A. australis as prey. The reluctance towards T. carbonaria disappeared when the resinous compounds on its cuticle had been washed off with hexane. To test whether the repulsive reactions were related to the stickiness of the resinous surface or to chemical substances, hexane extracts of bees’ cuticles, propolis and three natural tree resins were prepared. In the following assay responses of ants towards extract treated surfaces were observed. Except for one of the resin extracts, all tested substances had repellent effects to the ants. Efficacy varied with the type of extract and species. Especially to the introduced T. bicarinatum the cuticular extract had no effect. GCMS-analyses showed that some of the resinous compounds were also found in the cuticular profile of T. carbonaria which featured reasonable analogies to the resin of Corymbia torelliana that is highly attractive for stingless bees. The results showed that repellent effects were only partially related to the sticky quality of resin but were rather caused by chemical substances, presumably sesqui- and diterpenes. Despite its efficacy this defense strategy only provides short time repellent effects sufficient for escape and warning of nest mates to initiate further preventive measures.
Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control
(2011)
Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly.
SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner
(2011)
Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1.