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Sonstige beteiligte Institutionen
- DNA Analytics Core Facility, Biocenter, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Department of Animal Ecology and Tropical Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany (1)
- Forschungsstation Fabrikschleichach (1)
- Institut für Tierökologie und Tropenbiologie (1)
- Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (ZIKF), Würzburg (1)
- Klinische Mikrobiologie am Universitätsklinikum Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
Background
VKORC1 has been identified some years ago as the gene encoding vitamin K epoxide reductase (VKOR) – the target protein for coumarin derivates like warfarin or phenprocoumon. Resistance against warfarin and other coumarin-type anticoagulants has been frequently reported over the last 50 years in rodents due to problems in pest control as well as in thrombophilic patients showing variable response to anticoagulant treatment. Many different mutations have already been detected in the VKORC1 gene leading to warfarin resistance in rats, mice and in humans. Since the conventional in vitro dithiothreitol (DTT)-driven VKOR enzymatic assay often did not reflect the in vivo status concerning warfarin resistance, we recently developed a cell culture-based method for coexpression of VKORC1 with coagulation factor IX and subsequent measurement of secreted FIX in order to test warfarin inhibition in wild-type and mutated VKORC1.
Results
In the present study, we coexpressed wild-type factor IX with 12 different VKORC1 variants which were previously detected in warfarin resistant rats and mice. The results show that amino acid substitutions in VKORC1 maintain VKOR activity and are associated with warfarin resistance. When we projected in silico the amino acid substitutions onto the published three-dimensional model of the bacterial VKOR enzyme, the predicted effects matched well the catalytic mechanism proposed for the bacterial enzyme.
Conclusions
The established cell-based system for coexpression of VKORC1 and factor IX uses FIX activity as an indicator of carboxylation efficiency. This system reflects the warfarin resistance status of VKORC1 mutations from anticoagulant resistant rodents more closely than the traditional DTT-driven enzyme assay. All mutations studied were also predicted to be involved in the reaction mechanism.
The unique stem cell system of the immortal larva of the human parasite Echinococcus multilocularis
(2014)
Background
It is believed that in tapeworms a separate population of undifferentiated cells, the germinative cells, is the only source of cell proliferation throughout the life cycle (similar to the neoblasts of free living flatworms). In Echinococcus multilocularis, the metacestode larval stage has a unique development, growing continuously like a mass of vesicles that infiltrate the tissues of the intermediate host, generating multiple protoscoleces by asexual budding. This unique proliferation potential indicates the existence of stem cells that are totipotent and have the ability for extensive self-renewal.
Results
We show that only the germinative cells proliferate in the larval vesicles and in primary cell cultures that undergo complete vesicle regeneration, by using a combination of morphological criteria and by developing molecular markers of differentiated cell types. The germinative cells are homogeneous in morphology but heterogeneous at the molecular level, since only sub-populations express homologs of the post-transcriptional regulators nanos and argonaute. Important differences are observed between the expression patterns of selected neoblast marker genes of other flatworms and the E. multilocularis germinative cells, including widespread expression in E. multilocularis of some genes that are neoblast-specific in planarians. Hydroxyurea treatment results in the depletion of germinative cells in larval vesicles, and after recovery following hydroxyurea treatment, surviving proliferating cells grow as patches that suggest extensive self-renewal potential for individual germinative cells.
Conclusions
In E. multilocularis metacestodes, the germinative cells are the only proliferating cells, presumably driving the continuous growth of the larval vesicles. However, the existence of sub-populations of the germinative cells is strongly supported by our data. Although the germinative cells are very similar to the neoblasts of other flatworms in function and in undifferentiated morphology, their unique gene expression pattern and the evolutionary loss of conserved stem cells regulators suggest that important differences in their physiology exist, which could be related to the unique biology of E. multilocularis larvae.
Background
The management of rectal cancer (RC) has substantially changed over the last decades with the implementation of neoadjuvant chemoradiotherapy, adjuvant therapy and improved surgery such as total mesorectal excision (TME). It remains unclear in which way these approaches overall influenced the rate of local recurrence and overall survival.
Methods
Clinical, histological and survival data of 658 out of 662 consecutive patients with RC were analyzed for treatment and prognostic factors from a prospectively expanded single-institutional database. Findings were then stratified according to time of diagnosis in patient groups treated between 1993 and 2001 and 2002 and 2010.
Results
The study population included 658 consecutive patients with rectal cancer between 1993 and 2010. Follow up data was available for 99.6% of all 662 treated patients. During the time period between 2002 and 2010 significantly more patients underwent neoadjuvant chemoradiotherapy (17.6% vs. 60%) and adjuvant chemotherapy (37.9% vs. 58.4%). Also, the rate of reported TME during surgery increased. The rate of local or distant metastasis decreased over time, and tumor related 5-year survival increased significantly with from 60% to 79%.
Conclusion
In our study population, the implementation of treatment changes over the last decade improved the patient’s outcome significantly. Improvements were most evident for UICC stage III rectal cancer.
Background
Information about genes, transcripts and proteins is spread over a wide variety of databases. Different tools have been developed using these databases to identify biological signals in gene lists from large scale analysis. Mostly, they search for enrichments of specific features. But, these tools do not allow an explorative walk through different views and to change the gene lists according to newly upcoming stories.
Results
To fill this niche, we have developed ISAAC, the InterSpecies Analysing Application using Containers. The central idea of this web based tool is to enable the analysis of sets of genes, transcripts and proteins under different biological viewpoints and to interactively modify these sets at any point of the analysis. Detailed history and snapshot information allows tracing each action. Furthermore, one can easily switch back to previous states and perform new analyses. Currently, sets can be viewed in the context of genomes, protein functions, protein interactions, pathways, regulation, diseases and drugs. Additionally, users can switch between species with an automatic, orthology based translation of existing gene sets. As todays research usually is performed in larger teams and consortia, ISAAC provides group based functionalities. Here, sets as well as results of analyses can be exchanged between members of groups.
Conclusions
ISAAC fills the gap between primary databases and tools for the analysis of large gene lists. With its highly modular, JavaEE based design, the implementation of new modules is straight forward. Furthermore, ISAAC comes with an extensive web-based administration interface including tools for the integration of third party data. Thus, a local installation is easily feasible. In summary, ISAAC is tailor made for highly explorative interactive analyses of gene, transcript and protein sets in a collaborative environment.
Background
The metacestode of the tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis, a lethal zoonosis. Infections are initiated through establishment of parasite larvae within the intermediate host’s liver, where high concentrations of insulin are present, followed by tumour-like growth of the metacestode in host organs. The molecular mechanisms determining the organ tropism of E. multilocularis or the influences of host hormones on parasite proliferation are poorly understood.
Results
Using in vitro cultivation systems for parasite larvae we show that physiological concentrations (10 nM) of human insulin significantly stimulate the formation of metacestode larvae from parasite stem cells and promote asexual growth of the metacestode. Addition of human insulin to parasite larvae led to increased glucose uptake and enhanced phosphorylation of Echinococcus insulin signalling components, including an insulin receptor-like kinase, EmIR1, for which we demonstrate predominant expression in the parasite’s glycogen storage cells. We also characterized a second insulin receptor family member, EmIR2, and demonstrated interaction of its ligand binding domain with human insulin in the yeast two-hybrid system. Addition of an insulin receptor inhibitor resulted in metacestode killing, prevented metacestode development from parasite stem cells, and impaired the activation of insulin signalling pathways through host insulin.
Conclusions
Our data indicate that host insulin acts as a stimulant for parasite development within the host liver and that E. multilocularis senses the host hormone through an evolutionarily conserved insulin signalling pathway. Hormonal host-parasite cross-communication, facilitated by the relatively close phylogenetic relationship between E. multilocularis and its mammalian hosts, thus appears to be important in the pathology of alveolar echinococcosis. This contributes to a closer understanding of organ tropism and parasite persistence in larval cestode infections. Furthermore, our data show that Echinococcus insulin signalling pathways are promising targets for the development of novel drugs.
Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen in vielen inflammatorischen, aber auch primär neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Daher besitzt die Fragestellung inwiefern CD8+ ZTL Neurone direkt schädigen und ggf. welche mechanistischen Aspekte dieser Schädigung zugrunde liegen, eine hohe Relevanz. Um diese Fragestellung eingehender zu beleuchten, wurde mit dem OT-I-System gearbeitet. Dieses gut vorcharakterisierte CD8+ T-Zell-Modell besitzt den Vorteil, dass diese transgenen Zellen nur eine Peptidsequenz des Ovalbumin (OVA) Protein als spezifisches Antigen erkennen.
Zunächst wurden in der vorliegenden Arbeit Co-Kultivierungs-Experimente durchgeführt. Hierzu wurden akut isolierte murine Hippokampus-Neurone unter verschiedenen Bedingungen mit OT-I Lymphozyten co-kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter Antigenpräsentation der Neurone signifikant mehr Neurone in die Apoptose/Nekrose geführt werden, als unter Kontroll-Bedingungen, in denen entweder kein Antigen oder ein Antigen, das nicht von OT-I Lymphozyten erkannt wird, präsentiert wird.
Nachdem die Antigen-abhängigen zytotoxischen Effekte auf Neurone gezeigt werden konnten, wurde mithilfe elektrophysiologischer Techniken die mechanistischen und funktionellen Konsequenzen des direkten neuronalen/OT-I-vermittelten Zellkontakts untersucht. Bei diesem experimentellen Ansatz wurde durch elektrisches Auslenken eines Neurons nach Kontakt mit einem OT-I Lymphozyt die passiven elektrischen Parameter der Neuronenmembran gemessen. In diesen Messungen konnte gezeigt werden, dass nach unmittelbarem Kontakt eines Neurons mit einem OT-I Lymphozyt der neuronale Membranwiderstand reduziert wird bzw. die Leitfähigkeit der Zellmembran erhöht wird. Diese Änderung der neuronalen Membran-Leitfähigkeit findet in einem Zeitraum von 10 min nach dem Zell-Zell-Kontakt statt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dieser Einfluss von OT-I Lymphozyten auf Neurone strikt Antigen-abhängig ist. Zur Untersuchung des Mechanismus der OT-I T-Lymphozyten auf Neurone wurde das Augenmerk auf verschiedene T-Zell-induzierte Apoptosewegegelegt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Blockieren der Fas/FasL-Interaktion mittels eines Antikörpers kein Unterschied, weder in der neuronalen Apoptoserate nach Co-Kultivierung, noch eine Änderung der passiven neuronalen Membran-Leitfähigkeit auftritt. Weiterhin wurde die Rolle der von T-Zellen sezernierten Granula Perforin und Granzym B untersucht. Um den Einfluss dieser Granula aufzuklären, wurden OT-I Lymphozyten verwendet, die entweder defizient für Perforin oder Granzym B waren. In diesem experimentellen Ansatz wurde gezeigt, dass ausschließlich Perforin für die Erniedrigung des passiven neuronalen Membran-Widerstandes verantwortlich ist.
Diese Erhöhung der neuronalen Membranleitfähigkeit führte aber nicht direkt zum neuronalen Zelltod. Vielmehr wurde durch die einhergehende Depolarisation des Neurons die elektrische Aktivität der Zelle vermindert, sodass es zu einem sogenannten „electrical silencing“ kommt. Dieser Umstand konnte auch in der Betrachtung der spontanen Netzwerkaktivität von Neuronenkulturen gezeigt werden. Hierfür wurden hoch dichte Neuronenkulturen auf MEA-Chips kultiviert. Mit Hilfe dieser MEA konnten die Summenfeldpotentiale der Neuronenkulturen detektiert werden. Hierbei wurde beobachtet, dass nach Beladung der Neuronen mit dem spezifischen OT-I-Antigen und OT-I Zellen eine Verringerung der spontanen Netzwerkaktivität einhergeht. Auch in diesem Effekt konnte eine Antigen-Spezifität nachgewiesen werden.
Da der Prozess der zellulären Apoptose mit einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration einhergeht, und Perforin als Ca2+-durchlässiger unselektiver Porenbildner fungiert, wurden zur Überprüfung der Hypothese calcium imaging-Experimente durchgeführt. Analog zu den elektrophysiologischen Messungen wurde gezeigt, dass nach direktem Zell-Zell-Kontakt zwischen Neuron und OT-I Lymphozyt eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu messen ist. Dass diese Änderung des neuronalen Ca2+-Einstroms durch Perforin-abhängige Membranporen hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten bewiesen werden. Unter Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten wurde keine Änderung der neuronalen Ca2+-Konzentration ermittelt. Weiterhin wurde in diesem experimentellen Ansatz gezeigt, dass auch der OT-I-vermittelte neuronale Ca2+-Anstieg strikt Antigen-abhängig ist.Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MHC-I/Antigen-vermittelte CD8+ Lymphozyten-Interaktion mit einem Neuron zu „electrical silencing“ des Neurons führt. Dieser Prozess ist klar Perforin-abhängig, führt jedoch nicht zum unmittelbaren Zelltod des Neurons.
SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype.
The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1.
Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage.
Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis.
To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress.
Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms.
In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend.
Degenerative Bandscheibenerkrankungen wie Protrusionen oder vorgefallenes Nukle-usgewebe führen häufig zu chronischen Schmerzen und schränken die Bewegungsmo-bilität sehr ein. Operative Behandlungsmöglichkeiten wie die Nukleotomie oder die Fusion von Wirbelkörpern stellen traumatische Eingriffe in das komplexe System der Wirbelsäule dar. Biologische Verfahren, durch die eine Regeneration des geschädigten Gewebes erzielt werden kann, sind klinisch bisher nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung, Herstellung und Testung regenerativer azellulä-rer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I, die den degenerierten Nukleus pulposus ersetzen sollen. Insbesondere eine Höhenminderung der Bandscheibe kann zu Anschlussdegenerationen benachbarter Segmente führen. Dies soll durch die Implan-tatmatrix ausgeglichen werden. Nach der Konstruktion und dem Bau eines Reaktors aus dem Hochleistungskunststoff Polytetrafluorethylen (PTFE), der allen Anforderungen eines CE-Konformitätsbewertungsverfahrens entspricht, wird eine hoch verdichtete Kollagen Typ I Matrix mit einer Stärke von 1 mm hergestellt. Diese kann über den Pro-zess der Lyophilisation auf 0,6 mm weiter reduziert werden. Es gelingt, die Matrix in einer Edelstahlhülse zu platzieren, über die mit Hilfe eines passgenauen Führungssta-bes die endoskopische Implantation in die Nukleuskavität erfolgen soll. Im Rahmen der Interkorporellen Fusionstage des Diakonie Klinikums Stuttgart wird das operative Handling an einem humanem Präparat simuliert. Die Implantation erfolgt offen über einen transforaminalen Zugang in zwei nukleotomierte Segmente der lumbalen Wir-belsäule. Die anwesenden Wirbelsäulenchirurgen beurteilen die Möglichkeit der endo-skopischen Applikation als positiv und machbar.
Durch den Zusatz des Polysaccharids Hyaluronsäure gelingt es, die Quelleigenschaften der hoch verdichteten Matrix zu steigern, so dass diese wie natives Nukleusgewebe in der Lage ist, Flüssigkeit in Ruhe wieder aufzunehmen. Das Quellpotential und die da-mit einhergehende Volumenzunahme nach Kompression sind für ein Nukleusersatzma-terial essentiell. Die hier verwendete Hyaluronsäure geht jedoch im offenen System der in vitro Inkubation innerhalb von 11 Tagen verloren. Dennoch zeigen sich weitere Vorteile gegenüber der Matrix ohne Hyaluronsäure-Zusatz innerhalb der Testungen heraus. Diese sind neben dem erhöhten Quellpotential z. B. eine gesteigerte Rate der Zellproliferation der verwendeten bovinen und humanen Bandscheibenzellen (bBSZ und hBSZ) sowie humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die über die Be-stimmung der Zellzahl und Viabilität ermittelt wird. Zudem zeigt sich eine gesteigerte mechanische Stabilität, die über die Spannungs-Kompressions-Messungen evaluiert wird. Über Lebend-/ Totfärbungen und Zytotoxizitätstests an Monolayerkulturen kann zudem nachgewiesen werden, dass die notwendige Endsterilisation durch γ-Bestrahlung zu keinen zytotoxischen Veränderungen der Matrix führt. Da die verdich-tete Implantatmatrix azellulär als Medizinprodukt der Klasse III eingesetzt werden soll, wird als ergänzende Matrix zur Füllung kleinster Hohlräume die zunächst flüssige ChondroFillerliquid Matrix (ein Knorpelersatzmaterial der Firma Amedrix GmbH, Esslin-gen) durch den Zusatz von Hyaluronsäure modifiziert und in der Zellkultur getestet. Da es sich hierbei um ein Zweikammerspritzensystem handelt, ist die Verwendung von Additiva wie z. B. Stammzellen technisch möglich. Die Ermittlung der maximalen Inku-bationszeit von Zellen in verschieden konzentrierten hyperosmotischen Neutralisations-lösungen ergibt eine Dauer von 5 min, bis irreversible Zellschäden auftreten. In Migra-tionsversuchen kann gezeigt werden, dass die ChondroFillerliquid Matrix als Konektiv zwischen nativem Nukleusgewebe und verdichteter Implantatmatrix fungiert. Des Wei-teren synthetisieren bBSZ, hBSZ und hMSC sulfatierte Glykosaminoglykane und behal-ten dabei ihr charakteristisches Genexpressionsprofil. Die chondrogene Differenzie-rung durch die Verwendung eines chondrogenen Differenzierungsmediums gelingt bei den hMSC bereits nach einer Kultivierungsdauer von 14 d. Die Zellverteilung in den Implantatmatrices und deren Morphologie entspricht dem nativen Nukleusgewebe. Die biomechanische Testung an einem international anerkannten Modellsystem für humane Wirbelsäulen – der Kalbswirbelsäule – ergibt, dass die Nukleotomie zu einer Erhöhung des Range of Motion (RoM) in alle Richtungen nach Flexion/Extension, Seit-neigung rechts/links und axiale Rotation rechts/links sowie zu einer Höhenreduktion des Segments im Vergleich zum Intaktzustand führt. Nach der Implantation der ver-dichteten Implantatmatrix wird der RoM deutlich reduziert. Das Segment weist dadurch eine hohe Steifigkeit ähnlich dem Intaktzustand auf. Die Höhenreduktion kann durch die Implantation beinahe vollständig wieder ausgeglichen werden. Im Rahmen der zyklischen Dauerbelastungen treten jedoch Implantatextrusionen auf. Zudem nimmt die Steifigkeit deutlich ab, der RoM hingegen wieder zu. Da das bovine Modell jedoch nicht der in vivo Situation entspricht und beispielsweise eine zunehmende In-tegration des Implantats durch Einwachsen nicht ermöglicht, ist die hohe Extrusionsra-te als nicht realistisch zu werten. Klinische Studien am Tier und Mensch müssen zeigen, inwieweit derartige Extrusionen ohne die Verwendung eines Anulusverschlußsystems auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen geeigneten Reaktor zu ent-wickeln und mit diesem eine biokompatible, stabile und quellfähige Matrix herzustel-len, die den Höhenverlust nach einer Nukleotomie auszugleichen vermag. Die modifi-zierte ChondroFillerliquid Matrix stellt eine ideale Ergänzung dar, da über diese Zellen oder andere Additiva verabreicht werden können und deren konektive Wirkung die Zellbesiedlung der azellulären Matrix begünstigt.