Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Journal article (2)
- Doctoral Thesis (1)
Keywords
- Biologie (1)
- Chromatin Immunoprecipitation (1)
- Chromatinimmunpräzipitation (1)
- Embryonalentwicklung (1)
- Gen notch (1)
- Hey (1)
- Kardiovaskuläres System (1)
- Microarray (1)
- T cells (1)
- Transkriptionsfaktor (1)
Institute
Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen.
Physiological Notch Signaling Maintains Bone Homeostasis via RBPjk and Hey Upstream of NFATc1
(2012)
Notch signaling between neighboring cells controls many cell fate decisions in metazoans both during embryogenesis and in postnatal life. Previously, we uncovered a critical role for physiological Notch signaling in suppressing osteoblast differentiation in vivo. However, the contribution of individual Notch receptors and the downstream signaling mechanism have not been elucidated. Here we report that removal of Notch2, but not Notch1, from the embryonic limb mesenchyme markedly increased trabecular bone mass in adolescent mice. Deletion of the transcription factor RBPjk, a mediator of all canonical Notch signaling, in the mesenchymal progenitors but not the more mature osteoblast-lineage cells, caused a dramatic high-bone-mass phenotype characterized by increased osteoblast numbers, diminished bone marrow mesenchymal progenitor pool, and rapid age-dependent bone loss. Moreover, mice deficient in Hey1 and HeyL, two target genes of Notch-RBPjk signaling, exhibited high bone mass. Interestingly, Hey1 bound to and suppressed the NFATc1 promoter, and RBPjk deletion increased NFATc1 expression in bone. Finally, pharmacological inhibition of NFAT alleviated the high-bone-mass phenotype caused by RBPjk deletion. Thus, Notch-RBPjk signaling functions in part through Hey1-mediated inhibition of NFATc1 to suppress osteoblastogenesis, contributing to bone homeostasis in vivo.
HEY bHLH transcription factors have been shown to regulate multiple key steps in cardiovascular development. They can be induced by activated NOTCH receptors, but other upstream stimuli mediated by TGFß and BMP receptors may elicit a similar response. While the basic and helix-loop-helix domains exhibit strong similarity, large parts of the proteins are still unique and may serve divergent functions. The striking overlap of cardiac defects in HEY2 and combined HEY1/HEYL knockout mice suggested that all three HEY genes fulfill overlapping function in target cells. We therefore sought to identify target genes for HEY proteins by microarray expression and ChIPseq analyses in HEK293 cells, cardiomyocytes, and murine hearts. HEY proteins were found to modulate expression of their target gene to a rather limited extent, but with striking functional interchangeability between HEY factors. Chromatin immunoprecipitation revealed a much greater number of potential binding sites that again largely overlap between HEY factors. Binding sites are clustered in the proximal promoter region especially of transcriptional regulators or developmental control genes. Multiple lines of evidence suggest that HEY proteins primarily act as direct transcriptional repressors, while gene activation seems to be due to secondary or indirect effects. Mutagenesis of putative DNA binding residues supports the notion of direct DNA binding. While class B E-box sequences (CACGYG) clearly represent preferred target sequences, there must be additional and more loosely defined modes of DNA binding since many of the target promoters that are efficiently bound by HEY proteins do not contain an Ebox motif. These data clearly establish the three HEY bHLH factors as highly redundant transcriptional repressors in vitro and in vivo, which explains the combinatorial action observed in different tissues with overlapping expression.