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Bacterial glucuronidase as general marker for oncolytic virotherapy or other biological therapies
(2011)
Background: Oncolytic viral tumor therapy is an emerging field in the fight against cancer with rising numbers of clinical trials and the first clinically approved product (Adenovirus for the treatment of Head and Neck Cancer in China) in this field. Yet, until recently no general (bio)marker or reporter gene was described that could be used to evaluate successful tumor colonization and/or transgene expression in other biological therapies. Methods: Here, a bacterial glucuronidase (GusA) encoded by biological therapeutics (e.g. oncolytic viruses) was used as reporter system. Results: Using fluorogenic probes that were specifically activated by glucuronidase we could show 1) preferential activation in tumors, 2) rena l excretion of the activated fluorescent compounds and 3) reproducible detection of GusA in the serum of oncolytic vaccinia virus treated, tumor bearing mice in several tumor models. Time course studies revealed that reliable differentiation between tumor bearing and healthy mice can be done as early as 9 days post injection of the virus. Regarding the sensitivity of the newly developed assay system, we could show that a single infected tumor cell could be reliably detected in this assay. Conclusion: GusA therefore has the potential to be used as a general marker in the preclinical and clinical evaluation of (novel) biological therapies as well as being useful for the detection of rare cells such as circulating tumor cells
In der vorliegenden Arbeit wurde ein onkolytisches Vaccinia-Virus unter Ausnutzung seiner Eigenschaft als Vektorsystem mit dem Designer-Zytokin Hyper-IL-6 ausgestattet (GLV 1h90). Bei Hyper IL 6 handelt es sich um ein Fusionsprotein bestehend aus humanem Interleukin-6 und der Liganden-Bindungsdomäne des löslichen Interleukin-6-Rezeptors, welche kovalent über einen flexiblen Linker miteinander verbunden sind. Dieses chimäre Designer-Zytokin erlaubt die Untersuchung von IL-6-Effekten, welche über das IL-6-Trans-Signaling vermittelt werden. Daraus ergibt sich einerseits eine beträchtliche Erweiterung des Wirkspektrums und darüber hinaus weist Hyper-IL-6 sowohl in vitro als auch in vivo eine 100-1000fach verstärkte biologische Aktivität auf. Aufgrund der Tatsache, dass Hyper-IL-6, neben seiner Tumor-inhibierenden Wirkung, eine Vielzahl weiterer Effekte zugeschrieben wird, wurde in dieser Arbeit durch die Kombination des Designer-Zytokins mit einem onkolytischen Vaccinia-Virus nicht nur additive Effekte auf die Tumorregression, sondern darüber hinaus auch mögliche systemisch-vermittelte Hyper-IL-6-Effekte untersucht. Nach intravenöser Injektion von GLV-1h90 in DU-145-Tumor-tragende Mäuse konnte neben der intratumoralen Replikation des Virus und der Expression des Markerproteins Ruc-GFP zusätzlich die Expression des integrierten Designer-Zytokins Hyper-IL-6 im Tumor nachgewiesen werden. Von entscheidender Bedeutung war der zusätzliche Nachweis des Designer-Zytokins in Serum-Proben von GLV-1h90-injizierten Mäusen. Nach einer aktiven Hyper-IL-6-Sekretion von infizierten Tumorzellen, bildet der Transport in die Blutbahn die Voraussetzung für systemisch-vermittelte Hyper-IL-6-Effekte. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich durch die Überexpression von Hyper-IL-6 im Tumor, zusätzlich zu den onkolytischen Eigenschaften des Vaccinia-Virus, additive anti-Tumor-Effekte ergeben. Eine systemische Injektion von GLV 1h90 bzw. GLV 1h68 in DU-145-Tumor-tragende Mäuse führte zu einer signifikanten Reduktion des Tumorvolumens im Vergleich zu PBS-injizierten Mäusen. Neben Effekten, welche mit Entzündungsprozessen assoziiert sind, wie eine Rotfärbung der Haut, eine signifikanten Vergrößerung der Leber sowie eine massive Stimulation der Akute-Phase-Antwort in der Leber, konnte in GLV-1h90-injizierten Mäusen ein verbesserter Gesundheitszustand auf der Basis einer signifikanten Gewichtszunahme, verbunden mit einer beschleunigten Wundheilung Virus-induzierter Schwanzläsionen, beobachtet werden. Darüber hinaus konnte für Hyper-IL-6 eine Stimulierung der Megakaryopoese im Knochenmark nachgewiesen werden, welche zu einer signifikanten Erhöhung der Thrombozyten-Zahl im Blutkreislauf von GLV-1h90-injizierten Mäusen führte. Es ist von entscheidender Bedeutung anzumerken, dass alle beobachteten systemischen Hyper-IL-6-Effekte eine zeitliche Limitierung aufwiesen, welche sich höchstwahrscheinlich auf die Virus-bedingte Zerstörung Hyper IL 6-produzierender Tumorzellen zurückführen lässt. Dies impliziert zudem, dass eventuelle Komplikationen, welche durch die Überexpression des Designer-Zytokins hervorgerufen werden können, ebenfalls selbstlimitierend sind. Es konnte bereits mehrfach gezeigt werden, dass eine Kombinationstherapie aus onkolytischen Viren und Chemotherapie über synergistische Effekte zu einer signifikant verbesserten Tumorregression führt. Allerdings kommt es in Folge einer Chemotherapie oft zu einer Vielzahl von gefährlichen Nebenwirkungen, da alle schnell proliferierenden Zellen des Körpers betroffen sind. Thrombozytopenie ist eine der am häufigsten vorkommenden Nebenwirkung und beschreibt eine massive Reduktion der Thrombozyten-Zahl im Blut. Im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung von GLV 1h90 wurde deshalb untersucht, ob in einer Kombinationstherapie mit Mitomycin C, neben einer Verstärkung der therapeutischen Effekte des Virus, basierend auf den beobachteten Hyper-IL-6-Effekten, zusätzlich der Gesundheitszustand der behandelten Mäuse verbessert werden kann. Die Experimente belegen, dass eine Kombination onkolytischer Vaccinia-Virus-Konstrukte mit Mitomycin C zu einer signifikant verbesserten Tumorregression im Vergleich zu den jeweiligen Monotherapien führt. Von bedeutender Relevanz war die Beobachtung, dass in einer Kombinationstherapie von Mitomycin C und GLV-1h90, im Gegensatz zu GLV-1h68, eine signifikante zeitliche Verkürzung der auftretenden Thrombozytopenie erreicht wird. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine systemische Injektion von GLV-1h90 zu einer funktionellen Expression des Designer-Zytokins Hyper-IL-6 führte, welches in der Lage ist eine erfolgreiche Kombinationstherapie aus einem onkolytischen Vaccinia-Virus und dem Chemotherapeutikum Mitomycin C durch eine Reduktion der Nebenwirkungen zusätzlich zu optimieren.
Background: Combination of oncolytic vaccinia virus therapy with conventional chemotherapy has shown promise for tumor therapy. However, side effects of chemotherapy including thrombocytopenia, still remain problematic. Methods: Here, we describe a novel approach to optimize combination therapy of oncolytic virus and chemotherapy utilizing virus-encoding hyper-IL-6, GLV-1h90, to reduce chemotherapy-associated side effects. Results: We showed that the hyper-IL-6 cytokine was successfully produced by GLV-1h90 and was functional both in cell culture as well as in tumor-bearing animals, in which the cytokine-producing vaccinia virus strain was well tolerated. When combined with the chemotherapeutic mitomycin C, the anti-tumor effect of the oncolytic virotherapy was significantly enhanced. Moreover, hyper-IL-6 expression greatly reduced the time interval during which the mice suffered from chemotherapy-induced thrombocytopenia. Conclusion: Therefore, future clinical application would benefit from careful investigation of additional cytokine treatment to reduce chemotherapy-induced side effects.
Die von Proffit und Vig (1981) als Primary Failure of Eruption (PFE, Primäre Durchbruchstörung) klassifizierte Zahndurchbruchstörung resultiert klinisch häufig in schwergradigen Auswirkungen. Hierbei handelt es sich um Beeinträchtigungen des Wachstums des Alveolarfortsatzes, ebenso wie Dilazerationen, große vertikale Defekte und schwergradige lateral offene Bisse.
Die eindeutige Diagnostik und Abgrenzung der PFE von anderen Zahndurchbruchstörungen gestaltete sich bis zur Bestimmung der zugrunde liegenden Ursachen als sehr schwierig. Aufgrund von Fehldiagnosen kam es häufig zu Behandlungsmisserfolgen.
Um die PFE schneller und spezifischer diagnostizieren zu können, ist das Wissen über die zugrunde liegenden Mutationen des Parathormonrezeptor 1- Genes (PTHR1-Genes), welche bei PFE-Patienten isoliert wurden, von großer Bedeutung.
Im Zuge vorangegangener Studien wurden bereits einige Mutationen des PTHR1 als pathogen klassifiziert, hierzu zählt die PTHR1-Mutante W339*, eine Abbruchmutante, welche auf einem Basenaustausch beruht. Darüber hinaus liegen Daten zu potenziell pathogenen Genvariationen, wie die PTHR1-Mutante G452E, eine Aminosäureaustausch-Mutante, vor. Der Nachweis ihrer Pathogenität würde die Diagnosestellung sichern.
Um die Pathogenität der PTHR1-Variationen nachweisen zu können, wurde ihre RNA in X. laevis Oozyten injiziert. Der PTHR1 wurde zusammen mit mTRESK, einem Kaliumkanal, exprimiert und im Anschluss auf sein Verhalten bei Zugabe von 100 nM Parathormon (PTH) mit elektrophysiolgischen Messungen untersucht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bei nicht an PFE erkrankten Menschen vorkommende Variante des PTHR1 (PTHR1-WT) eine Aktivierung von 260,47% im Vergleich zu den Ausgangswerten unter einer physiologischen Lösung (ND96) zeigte. Im Gegensatz dazu konnte bei der bereits als pathogen klassifizierten PTHR1-Variation W339* kein signifikanter Anstieg der Aktivität unter PTH-Zugabe nachgewiesen werden. Für die potenziell pathogene PTHR1-Mutante G452E konnte ebenfalls keine signifikante Aktivitätssteigerung als Reaktion auf die Zugabe des Agonisten PTH nachzuweisen ermittelt werden.
Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der PTHR1-Mutante G452E ebenfalls um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt, genauso wie bei der als pathogen klassifizierten Variation W339* des PTHR1, da beide in den durchgeführten Messungen dasselbe Verhalten zeigen.
Die als Kontrollgruppe künstlich erzeugte Mutante G452A des PTHR1 zeigte hingegen eine signifikante Aktivierung von 91,02% im Vergleich zu den gemessenen Ausgangswerten unter physiolgischem ND96. Durch einen einfachen Aminosäureaustausch wurde die Basensequenz des Rezeptors so verändert, dass die Funktion trotz der Mutation wieder hergestellt werden konnte. Dies geschah durch den Einbau eines Alanins anstelle des natürlich vorkommenden Glycins. Im Gegensatz zu dem Einbau von Glutamat, bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E, bei welcher die Funktionsfähigkeit nicht mehr vorliegt.
Die gemessene Aktivität ist zwar geringer als beim WT, legt aber nahe, dass es im Falle dieser künstlichen Mutation nicht zu einer Krankheitsausprägung kommt, da die Reaktion in ihrer Gesamtheit der des PTHR1-WT entspricht. Dies wird auch durch die signifikante Erhöhung des auswärts-gerichteten K+-Stromes deutlich, der sich analog zum gesunden PTHR1 verhält. . Es konnte somit die Funktionsfähigkeit der künstlichen PTHR1-Mutante G452A nachgewiesen werden. Die gesamten erzielten Ergebnisse waren durch die Abbildung von klinischen Befunden auf molekularer Ebene in Oozyten möglich. Durch die Kombination eines Kalium-Kanales mit dem krankheitsspezifischen Rezeptor konnte das Verhalten des Rezeptors anhand des mittels TEVC-Messungen ermittelten Verhaltens des Kalium-Kanales abgebildet werden.
Bei dem verwendeten Kalium-Kanal handelte es sich um mTRESK, welcher mit dem Parathormonrezeptor 1 zusammen exprimiert wurde. Durch die Zugabe des spezifischen Rezeptoragonisten PTH kam es bei den funktionsfähigen Variationen des Rezeptors zu einer Konformationsänderung des G-Proteins. Diese resultierte im weiteren Verlauf in einem Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels und einer Aktivierung von Calcineurin. Die Dephosphorilierung des Kalium-Kanales mTRESK, welche zu einer Aktivitätssteigerung des Kanals führte, war die Folge.
Dies verdeutlicht, wie auch zukünftig durch die Kooexpression von krankheitsspezifischen Rezeptoren und elektrophysiologisch ableitbaren Strömen, die Bedeutungen und Auswirkungen von Mutationen auf molekularer Ebene funktionell nachgewiesen werden können.
Die vorliegende Arbeit erbringt somit unter Verwendung dieses Expressionssystems den Nachweis dafür, dass es sich bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt. Zudem konnten die vorangegangenen Ergebnisse, wonach es sich bei der ebenfalls im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante W339* um eine pathogene Mutation handelt bestätigt werden.
Patienten mit diesen Genvariationen können somit eindeutig die Diagnose PFE erhalten und entsprechend zielführend therapiert werden.
Metastatic tumor cells in body fluids are important targets for treatment, and critical surrogate markers for evaluating cancer prognosis and therapeutic response. Here we report, for the first time, that live metastatic tumor cells in blood samples from mice bearing human tumor xenografts and in blood and cerebrospinal fluid samples from patients with cancer were successfully detected using a tumor cell-specific recombinant vaccinia virus (VACV). In contrast to the FDA-approved CellSearch system, VACV detects circulating tumor cells (CTCs) in a cancer biomarker-independent manner, thus, free of any bias related to the use of antibodies, and can be potentially a universal system for detection of live CTCs of any tumor type, not limited to CTCs of epithelial origin. Furthermore, we demonstrate for the first time that VACV was effective in preventing and reducing circulating tumor cells in mice bearing human tumor xenografts. Importantly, a single intra-peritoneal delivery of VACV resulted in a dramatic decline in the number of tumor cells in the ascitic fluid from a patient with gastric cancer. Taken together, these results suggest VACV to be a useful tool for quantitative detection of live tumor cells in liquid biopsies as well as a potentially effective treatment for reducing or eliminating live tumor cells in body fluids of patients with metastatic disease.
PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling
(2016)
Aim
Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet.
Materials and Methods
In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes.
Results
In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished.
Conclusions
PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement.