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Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen.
Introduction: To date, no single most-appropriate factor or delivery method has been identified for the purpose of mesenchymal stem cell (MSC)-based treatment of cartilage injury. Therefore, in this study we tested whether gene delivery of the growth factor Indian hedgehog (IHH) was able to induce chondrogenesis in human primary MSCs, and whether it was possible by such an approach to modulate the appearance of chondrogenic hypertrophy in pellet cultures in vitro. Methods: First-generation adenoviral vectors encoding the cDNA of the human IHH gene were created by cre-lox recombination and used alone or in combination with adenoviral vectors, bone morphogenetic protein-2 (Ad.BMP- 2), or transforming growth factor beta-1 (Ad.TGF-b1) to transduce human bone-marrow derived MSCs at 5 × 102 infectious particles/cell. Thereafter, 3 × 105 cells were seeded into aggregates and cultured for 3 weeks in serumfree medium, with untransduced or marker gene transduced cultures as controls. Transgene expressions were determined by ELISA, and aggregates were analysed histologically, immunohistochemically, biochemically and by RT-PCR for chondrogenesis and hypertrophy. Results: IHH, TGF-b1 and BMP-2 genes were equipotent inducers of chondrogenesis in primary MSCs, as evidenced by strong staining for proteoglycans, collagen type II, increased levels of glycosaminoglycan synthesis, and expression of mRNAs associated with chondrogenesis. IHH-modified aggregates, alone or in combination, also showed a tendency to progress towards hypertrophy, as judged by the expression of alkaline phosphatase and stainings for collagen type X and Annexin 5. Conclusion: As this study provides evidence for chondrogenic induction of MSC aggregates in vitro via IHH gene delivery, this technology may be efficiently employed for generating cartilaginous repair tissues in vivo.