Refine
Has Fulltext
- yes (23)
Is part of the Bibliography
- yes (23)
Document Type
- Doctoral Thesis (23)
Keywords
- Arteriosklerose (6)
- Atherosklerose (4)
- Dendritische Zelle (4)
- Atherosclerosis (3)
- Herzhypertrophie (2)
- Herzinfarkt (2)
- 7-Dehydrocholesterol (1)
- ABC-Transporter (1)
- Atherogenese (1)
- Biomaterial (1)
Institute
- Graduate School of Life Sciences (11)
- Institut für Experimentelle Biomedizin (6)
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (2)
- Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (DZHI) (1)
- Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie (1)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (1)
- Kinderklinik und Poliklinik (1)
- Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie (ab 2004) (1)
- Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkrankheiten, plastische und ästhetische Operationen (1)
- Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin (1)
CCR6 kontrolliert selektiv die Monozyten-vermittelte Entzündungsreaktion in der Atherosklerose
(2019)
Der Chemokinrezeptor CCR6 wird von einer Vielzahl unterschiedener Zelltypen exprimiert,
wie zum Beispiel Monozyten, Th17-Zellen und regulatorische T-Zellen,
die im Zusammenhang mit der Entstehung von Atherosklerose stehen. Um die
Bedeutung von CCR6 in der Pathogenese der Atherosklerose bestimmen zu können,
wurden CCR6-defiziente (Ccr6-/- ) Mäuse mit low-density lipoprotein receptordefizienten
(Ldlr-/-) Mäusen gekreuzt, um Tiere zu erhalten, die anfällig für Atherosklerose
und zudem CCR6-defizient sind. Nach acht Wochen pro-atherogener, fettreicher
western-type diet war die Ausprägung der atherosklerotischen Läsionen im
Aortensinus und der gesamten Aorta, sowie deren Gehalt an Plaquemakrophagen in
den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren im Vergleich zu den Ldlr-/- Kontrolltieren signifikant vermindert.
Die lokale und die systemische Verteilung von T-Zellen sowie die Häufigkeit
von Th1-, Th17-Zellen und regulatorischen T-Zellen blieb hingegen unverändert. Im
Gegensatz dazu reduzierte sich die Zahl der im Blut zirkulierenden Gr-1high und
Gr-1low Monozyten in den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren deutlich. Weiter konnte gezeigt werden,
dass über CCR6 in vitro die Adhäsion von Monozyten an inflammatorisch
verändertem Endothel und in vivo die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel
der Karotiden vermittelt wird. Des Weiteren wurden in einem air pouch-Modell für
akute Entzündungsreaktionen mittels CCR6 spezifisch Monozyten, aber keine TZellen
rekrutiert.
Summa summarum konnte die Bedeutung von CCR6 auf verschiedenen Ebenen
der Pathogenese der Atherosklerose gezeigt werden: Während CCR6 für die Hypercholesterinämie
assoziierte adaptive Immunantwort entbehrlich ist, reguliert es
die Mobilisierung, Adhäsion und Rekrutierung von Monozyten und kontrolliert über
diese Mechanismen die Akkumulation von Makrophagen und Genese atherosklerotischer
Läsionen. CCR6 und sein Ligand CCL20 könnten somit vielversprechende
Ziele neuer pharmakologischer Therapieansätze sein, um auch die Atherogenese im
Menschen zu unterbinden.
Die Ergebnisse der Dissertation wurden im Dezember 2013 im Journal Thrombosis
and Haematostasis unter dem Titel “CCR6 selectively promotes monocyte mediated
inflammation and atherogenesis in mice“ in geteilter Erstautorenschaft von
Helga Manthey, Clément Cochain und Stefanie Barnsteiner veröffentlicht (PMID:
24114205).
Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung. Dabei sind alle entscheidenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems involviert. Besonders dendritische Zellen (DCs) expandieren subendothelial während der Progression einer Atherosklerose. Diese können Antigene aufnehmen und daraufhin Zytokine produzieren oder andere Immunzellen aktivieren. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende Stränge aus Ribonukleinsäure, welche als weitere Ebene der Genregulation wichtige Zellvorgänge beeinflussen können. Diese Arbeit zeigt mögliche Zielproteine des miRNA 17-92 Clusters in dendritischen Zellen auf und schlägt mögliche Modelle vor, wie dadurch Zellvorgänge von DCs in der Atherosklerose reguliert werden könnten.
Ziel dieser Dissertation war es Resektate von Harnblasenkarzinomen mit der Frage zu analysieren, inwieweit sog. Tumorstammzellen nachzuweisen sind. Hierfür wurden Operationspräparate mechanisch/enzymatisch bearbeitet über eine magnetische Zellseparation für Tumorzellen angereichert und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. Es wurde zudem ein funktioneller Assay durchgeführt, der die Aktivität der Aldehyddehydrogenase untersucht.
Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient. Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt.
Hierfür wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat.
Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie.
Im WS wurden erhöhte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine veränderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalität nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Veränderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden.
Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT).
Als mögliche Auslöser dieser Veränderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage.
Cardiovascular diseases represent the leading cause of death worldwide, with myocardial infarction and strokes being the most common complications. In both cases, the appearance of an enlarged artery wall as a consequence of a growing plaque is responsible for the disturbance of the blood flow. The formation of plaques is driven by a chronic inflammatory condition known as atherosclerosis, characterized by an initial step of endothelial cell (EC) dysfunction followed by the recruitment of circulating immune cells into the tunica intima of the vessel. Accumulation of lipids and cells lead to the formation of atheromatous plaques that will define the cardiovascular outcome of an individual.
The role of the immune system in the progression of atherosclerosis has been widely recognized. By far, macrophages constitute the most abundant cell type in lesions and are known to be the major source of the lipid-laden foam cell pool during the course of the disease. However, other immune cells types, including T cells, dendritic cells (DCs) or mast cells, among others, have been described to be present in human and mouse plaques. How these populations can modulate the atherogenic process is dependent on their specialized function.
DCs constitute a unique population with the ability to bridge innate and adaptive immune responses, mainly by their strong capacity to present antigens bound to a major histocompatibility complex (MHC) molecule. Given their ability to polarize T cells and secrete cytokines, their role in atherosclerosis has gained attention for the development of new therapeutic approaches that could impact lesion growth. Hence, knowing the effect of a specific subset is an initial key step to evaluate its potential for clinical purposes. For example, the basic leucine zipper ATF-like 3 transcription factor (Batf3) controls the development of conventional dendritic cells type 1 (cDCs1), characterized by the expression of the surface markers CD8 and CD103. Initially, they were described to promote both T-helper 1 (Th1) and regulatory T cell (Treg) responses, known to accelerate and to protect against atherosclerosis, respectively. The first part of this thesis aimed to elucidate the potential role of Batf3-dependent DCs in atherosclerosis and concluded that even though systemic immune responses were mildly altered they do not modify the course of the disease and may not represent an attractive candidate for clinical studies.
DCs also have the ability to impact lesion growth through the release of a broad range of cytokines, which can either directly impact atherosclerotic plaques by modulating resident cells, or by further polarizing T cell responses. Among others, interleukin (IL) 23, a member of the IL-12 family of cytokines, has received much attention during the past year due to its connection to autoimmunity.
IL-23 is known to induce pathogenicity of Th17 cells and is responsible for the development of several autoimmune diseases including multiple sclerosis, psoriasis or rheumatoid arthritis. Interestingly, these patients often present with an accelerated course of atherosclerosis and thus, are at higher risk of developing cardiovascular events. Several epidemiological studies have pointed toward a possible connection between IL-23 and its receptor IL-23R in atherosclerosis, although their exact contribution remains to be elucidated. The second part of this thesis showed that resident antigen-presenting cells (APCs) in the aorta produced IL-23 during the steady state but this secretion was greatly enhanced after incubation with oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). Furthermore, disruption of the IL-23R signaling led to decreased relative necrotic plaque area in lesions of Ldlr-/-Il23r-/- mice fed a high-fat diet (HFD) for 6 and 12 weeks compared to Ldlr-/- controls. A proposed mechanism involves that increased IL-23 production in the context of atherosclerosis may promote the pathogenicity of IL-23-responding T cells, especially IL-23R+ γδ T cells in the aortic root. Response to IL-23 might increase the release of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and IL-17 and alter the pro- and anti-inflammatory balance of cytokines in the aortic root. Altogether, these data showed that the IL-23 / IL-23R axis play a role in plaque stability.
Die Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine der häufigsten chronischen Lebererkrankungen der westlichen Welt. Die Pathogenese der Erkrankung ist noch nicht vollständig erforscht und wirksame medikamentöse Therapien sind bisher nicht zugelassen. Wachsende Evidenz zeigt, dass das Interleukin-6-Typ-Zytokin Oncostatin M (OSM) eine wichtige Rolle in der Pathogenese der NAFLD spielt. Die japanische Arbeitsgruppe um Komori et al. zeigte an OSM-Rezeptor-β-defizienten (Osmr-KO-) Mäusen sowie durch OSM-Behandlung von genetisch und ernährungsbedingt adipösen Mäusen, dass OSM vor einer hepatischen Steatose und metabolischer Komorbidität schützen kann. Andere Publikationen suggerieren, dass OSM an NAFLD-Entwicklung und -Progression beteiligt ist, indem es die Expression von Genen der β-Oxidation und Very-Low-Density-Lipoprotein (VLDL-) Sekretion reprimiert und die Expression profibrogenetischer Gene fördert. Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-defiziente- (Ldlr-KO-) Mäuse sind seit Langem als Atherosklerose-Modell etabliert und wurden zuletzt auch als physiologisches Modell für NAFLD identifiziert.
Um die Rolle von OSM in der NAFLD-Pathogenese zu beleuchten, wurden Osmr-KO-Mäuse auf Wildtyp- (WT-) und Ldlr-KO-Hintergrund untersucht, die über 12 Wochen eine fett- und cholesterinreiche Western Diet erhielten und anschließend für die Organentnahme geopfert wurden. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden Körpergewicht, Blutglukose, Serum-Cholesterin und Lebergewicht der Tiere gemessen. Hierbei zeigte sich ein erhöhtes Körpergewicht, unveränderte Blutglukose, erhöhtes Serum-Cholesterin sowie ein erhöhtes Lebergewicht in Osmr-KO- gegenüber WT-Mäusen. Andersherum waren Körpergewicht, Blutglukose, Serum-Cholesterin und Lebergewicht in Ldlr-Osmr-KO- gegenüber Ldlr-KO-Mäusen vermindert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte die histologische Untersuchung des Lebergewebes, die Messung von Serum-Triglyzeriden und Fettsäuren sowie die Untersuchung der hepatischen Genexpression. An kultivierten Zellen der humanen Hepatom-Zelllinie HepG2 wurde eine mögliche Regulation der CYP7A1-Genexpression durch OSM untersucht. CYP7A1 ist als Schrittmacherenzym der Gallensäuresynthese an der hepatischen Cholesterin-Clearance beteiligt.
Osmr-KO-Mäuse zeigten gegenüber WT-Mäusen histologisch eine verstärkte hepatische Steatose. Bei der Untersuchung der mRNA-Expression von Genen mit Beteiligung an der hepatischen Lipidhomöostase zeigte sich eine Minderexpression von Ldlr in Osmr-KO-Mäusen. Weiterhin zeigte sich eine etwas geringere Expression von Cyp7a1 in Osmr-KO-Mäusen. Die Expression aller anderen untersuchten Gene, die an Fettsäuresynthese, Cholesterintransport und –metabolismus beteiligt sind, lieferten keine Erklärung für eine erhöhte hepatische Lipidakkumulation in Osmr-KO-Mäusen. Ldlr-Osmr-KO-Mäuse hatten gegenüber Ldlr-KO-Mäusen eine geringer ausgeprägte hepatische Steatose. Die mRNA-Expression von Genen der Fettsäuresynthese, der Cholesterinbiosynthese und des Cholesterintransports waren in Ldlr-Osmr-KO- gegenüber Ldlr-KO-Mäusen nicht wesentlich verändert. Allerdings fiel eine deutliche Hochregulation von Cyp7a1 in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen auf. Darüber hinaus war Osm in Ldlr-KO-Mäusen gegenüber WT-Mäusen stärker exprimiert. Um eine Regulation von CYP7A1 durch OSM nachzuweisen, wurde die Genexpression in HepG2-Zellen nach Stimulation mit OSM untersucht. Hierbei zeigte sich, dass OSM die mRNA-Expression von CYP7A1 supprimierte. Dieser Effekt war durch die Zugabe von Inhibitoren der Januskinasen (JAK), Mitogen Activated Protein Kinase/ERK-Kinase (MEK) und Extracellular-signal Regulated Kinase ½ (ERK1/2) reversibel. Die CYP7A1-Suppression durch OSM ging mit einer verminderten Expression des Transkriptionsfaktor-Gens HNF4A einher.
Osmr-KO-Mäuse zeigten gegenüber WT-Mäusen nach 12 Wochen Western Diet verstärkte Adipositas, Dyslipidämie sowie eine hepatische Steatose. Die Analyse der hepatischen mRNA-Expression legt nahe, dass die Minderexpression von Ldlr in Osmr-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zur Verstärkung der Dyslipidämie und hepatischen Steatose beigetragen hat. Weiterhin kann die geringere Expression von Cyp7a1 in Osmr-KO-Mäusen durch daraus resultierende Akkumulation von Cholesterin zur erhöhten hepatischen Lipidakkumulation in diesen Mäusen beigetragen haben. Ldlr-KO-Mäuse zeigten nach 12 Wochen Western Diet ebenfalls eine hepatische Steatose. Diese war in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen gegenüber Ldlr-KO-Mäusen geringer ausgeprägt. Die erhöhte Expression von Cyp7a1 in Ldlr-Osmr-KO-Mäusen kann die Verbesserung von hepatischer Lipidakkumulation und Dyslipidämie durch erhöhte Cholesterinmetabolisierung zu Gallensäuren erklären. Übereinstimmend mit der Cyp7a1-Regulation in LDLR-defizienten Mäusen zeigte sich in vitro, dass OSM die Expression von CYP7A1 in HepG2-Zellen vermindert und sich so negativ auf die hepatische Lipidhomöostase auswirken kann. Insgesamt implizieren diese Ergebnisse eine divergierende Rolle von OSM bei der Entwicklung einer hepatischen Steatose abhängig vom genetischen Hintergrund. OSM scheint bei WT-Mäusen für die Erhaltung der metabolischen Gesundheit wichtig zu sein. Bei Ldlr-KO-Mäusen hingegen scheint OSM die Entwicklung von Adipositas, Dyslipidämie und hepatischer Steatose zu fördern. Die differenzielle Rolle in WT- und Ldlr-KO-Mäusen könnte durch unterschiedliche Osm-Expressionsspiegel zustande kommen: Während basale OSMRβ-Signaltransduktion durch geringe OSM-Spiegel in WT-Mäusen für die Lipidhomöostase essenziell zu sein scheint, könnte erhöhte oder prolongierte OSMRβ-Signaltransduktion durch höhere OSM-Spiegel in Ldlr-KO-Mäusen das Fortschreiten der hepatischen Steatose fördern. Dies stellt OSM als mögliches NAFLD-Therapeutikum in Frage. Um die Hypothese zu überprüfen, dass OSM abhängig von der Höhe und Kinetik der Spiegel günstige oder ungünstige Effekte auf die NAFLD-Entwicklung hat, sollte in zukünftigen Experimenten der Einfluss kurz- und langfristiger Behandlung von WT-Mäusen mit OSM unterschiedlicher Konzentrationen auf die Entwicklung einer hepatischen Steatose untersucht werden.
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
Dem Endothel, welches die luminale Oberfläche aller Blutgefäße auskleidet, kommt eine wichtige Barrierefunktion zwischen Blut und Gewebe zu. Nur durch eine bedarfsgerechte Justierung dieser Barriere, die den Durchtritt von Molekülen und Zellen reguliert, kann die Gewebehomöostase aufrechterhalten werden. Dabei ist das Endothel nicht nur passive Barriere, sondern auch an dieser dynamischen Regulation aktiv beteiligt. Störungen oder Fehlregulationen dieser Prozesse führen zu Pathologien, z.B. Arteriosklerose.
Es ist seit längerem bekannt, dass Carcinoembryonic antigen–related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, die Bildung und Morphogenese neuer Blutgefäße beeinflusst. Die spontane Entwicklung kleiner Arteriosklerose-ähnlicher Läsionen in CEACAM1 knockout (Cc1-/-) Mäusen zeigt, dass CEACAM1 auch für die Homöostase ausgereifter Blutgefäße von Bedeutung ist. Ziel dieser Dissertationsarbeit war daher, den Einfluss von CEACAM1 auf wesentliche Aspekte der Endothelfunktion in Aorten in situ bzw. in Endothelzellkulturen in vitro zu analysieren.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass CEACAM1-defiziente Endothelzellen im Vergleich zu Wildtyp (WT) Endothelzellen eine rundlichere Zellmorphologie mit meanderförmigen Zellgrenzen und interzellulären Lücken aufweisen. Diese morphologischen Unterschiede stimmen mit Befunden in situ an Aorten von WT und Cc1-/- Mäusen überein.
Weiterhin wurde eine Translokation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) von der Zellmembran in den peri-nukleären Bereich bei CEACAM1-Defizienz festgestellt. Die erhobenen Daten bieten zwei mögliche Erklärungen dafür. Einerseits könnte CEACAM1 durch Interaktion mit eNOS als Membrananker fungieren. Daneben wiesen CEACAM1-defiziente Endothelzellen eine erhöhte Expression des Enzyms APT1 auf, welches eNOS depalmitoyliert. Die daraus resultierende, ebenfalls nachgewiesene geringere Palmitoylierung könnte auch zur verminderten Membran-lokalisation von eNOS beitragen.
Zur endothelialen Funktion gehört, die Adhäsion von Blutzellen an die Gefäßwand weitestgehend zu beschränken. CEACAM1-defiziente Endothelzellen zeigten im Vergleich zu WT Endothelzellen eine verstärkte Adhäsivität gegenüber murinen und humanen Monozyten. Ähnliche Unterschiede wurden für Aortenexplantate aus WT und Cc1-/- Mäusen festgestellt. Dies ist einerseits mit einer verstärkten Expression des Zelladhäsionsmoleküls ICAM-1 bei CEACAM1-Defizienz erklärbar. Darüber hinaus vermittelt die Glykokalyx anti-adhäsive Eigenschaften. Aus Vorbefunden war bekannt, dass die endotheliale Glykokalyx in der Aorta von Cc1-/- Mäuse reduziert ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies auf eine verstärkte Expression der Glykokalyx-degradierenden Enzyme MMP9, Chondroitinase sowie Hyaluronidase-2 in Cc1-/- Endothelzellen zurückgeführt werden.
Eine erhöhte Permeabilität stellt einen Indikator für ein dysfunktionales Endothel, eines der initialen Schritte in der Pathogenese der Arteriosklerose, dar. Zur Analyse der aortalen Permeabilität wurde ein modifizierter Miles-Assay etabliert. Unter Verwendung etablierter muriner Arteriosklerosemodelle konnte gezeigt werden, dass dieser Assay eine Störung der vaskulären Permeabilität bereits vor Auftreten makroskopischer Veränderungen zuverlässig detektiert.
Im Rahmen der folgenden Analysen an WT und Cc1-/- Mäusen zeigte sich ein altersabhängiger Effekt von CEACAM1 auf die Gefäßpermeabilität: Aorten von 3 Monate alten Cc1-/- Mäuse wiesen eine im Vergleich zum WT erhöhte Gefäßpermeabilität auf, welche wahrscheinlich Folge einer verzögerten Gefäßreifung ist. Im Alter von 9 Monaten zeigte sich dagegen ein entgegengesetztes Bild. Dies wurde auf eine verstärkte Expression des die Barriere schädigenden Inflammationsmediators TNF-α in 9 Monate alten WT Mäusen zurückgeführt.
Außerdem modulierte CEACAM1 die TNF-α-vermittelte Lockerung der endothelialen Barriere, indem es die Phosphorylierung von Adherens Junction Proteinen beeinflusste. Basal stabilisierte CEACAM1 die endotheliale Barriere durch Hemmung der Phosphorylierung von Caveolin-1, welches Adherens Junctions destabilisiert. Unter Einfluss von TNF-α war CEACAM1 verstärkt im Bereich von Adherens Junctions lokalisiert und rekrutierte dort Src-Kinase. Src-Kinase wiederum destabilisierte Adherens Junctions durch Phosphorylierung von β-Catenin, was in verstärkter Gefäßpermeabilität resultierte. Dagegen führte TNF-α in CEACAM1-defizienten Endothelzellen zu einer Dephosphorylierung von Caveolin-1 und β-Catenin, wodurch Adherens Junctions und damit die endotheliale Barriere stabilisiert wurden. Diese CEACAM1-abhängige differenzielle Regulation der Stabilität von Adherens Junctions unter TNF-α trägt wahrscheinlich maßgeblich zu den Unterschieden der vaskulären Permeabilität in 3 bzw. 9 Monate alten WT und Cc1-/- Mäusen bei.
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass CEACAM1 zentrale Funktionen des Endothels und hierüber die Homöostase reifer Gefäße beeinflusst. Da eine Expression von CEACAM1 auch in arteriosklerotischen Plaques nachgewiesen werden konnte, soll in weiteren Untersuchungen auch der Beitrag von CEACAM1 zur arteriosklerotischen Plaquebildung analysiert werden.
Die Atherosklerose ist als Ursache kardiovaskulärer Erkrankungen, welche die häufigste Todesursache weltweit darstellen, von großer klinischer und wissenschaftlicher Relevanz. Atherosklerose ist charakterisiert durch Einlagerungen von Lipiden in die Gefäßwand, welche zur Ausbildung von Plaques führen. Als Folge wird eine chronische Entzündungsreaktion eingeleitet, die durch spezifische Immunzellen, unter anderem T-Lymphozyten, und komplexe molekulare Prozesse aufrechterhalten wird. Durch eine verminderte Sauerstoffdiffusionskapazität und eine hohe Zelldichte ist das Milieu in den Plaques hypoxisch. Zur zellulären Anpassung an ein solches hypoxisches Milieu werden Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIF) in den Immunzellen stabilisiert. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches die Transkription bestimmter Zielgene initiiert, die den Zellen notwendige Adaptationen des Zellstoffwechsels an ein vermindertes Sauerstoffangebot ermöglichen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, inwiefern sich ein Ausschalten des Transkriptionsfaktor HIF-1α selektiv in T-Lymphozyten auf Atherosklerose und Myokardinfarkt auswirkt. Die funktionelle Bedeutung von HIF-1α in T-Zellen in der Pathogenese dieser Erkrankungen wurde an zwei Mausmodellen untersucht.
Im Atherosklerose Modell wurde Biomaterial von LDLR-/- Mäusen mit T-Zell spezifischem Knockout von HIF-1α nach achtwöchiger fettreicher Western-Typ Diät untersucht. Histologisch zeigte sich eine vermehrte Plaqueausprägung und ein verminderter Makrophagenanteil in den Plaques. Durchflusszytometrisch und mittels qPCR konnten keine Unterschiede in der Lymphozytendifferenzierung in Milz und Lymphknoten dieser Mäuse nachgewiesen werden.
Im Myokardinfarkt-Modell mit T-Zell spezifischem HIF-1α Knockout konnte in früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe eine vergrößerte Infarktzone mit eingeschränkter kardialer Funktion nachgewiesen werden. Histologisch konnte im Rahmen dieser Arbeit hierfür kein zellmorphologisches Korrelat in Kardiomyozytengröße oder der Vaskularisation des Myokards gefunden werden.
In Zukunft könnte HIF-1α in T-Lymphozyten ein möglicher Angriffspunkt zur medikamentösen Prävention oder Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen sein.
Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden.