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Die Forschung mit induzierten pluripotenten Stammzellen (ipS) wurde in den letzten Jahren ein wichtiger Bestandteil der Stammzellforschung. Bisher sind nur wenige Möglichkeiten bekannt, wie man die unspezifische Proliferation der aus ipS differenzierten pan neuralen Progenitorzellen kontrollieren kann. Um dies weiter zu untersuchen, wurden murine induzierte Stammzellen, die mit den 4 Faktoren Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc reprogrammiert wurden, untersucht.
In diversen Forschungsreihen konnte zudem gezeigt werden, dass Erythropoetin (EPO) einen Einfluss auf das Zellüberleben, die Proliferation und die Differenzierung neuronaler Zellen hat. Ob dieser Einfluss auch bei induzierten pan neuralen pluripotenten Progenitorzellen zu beobachten ist, wird in dieser Arbeit untersucht.
Anhand eines Zellviabilitätsversuchs (MTT-Assay) wurde untersucht, ob die Stoffwechselaktivität durch EPO (0,1U/ml, 1 U/ml und 10 U/ml) im Vergleich zur Kontrollgruppe gesteigert werden kann. Dabei zeigte sich eine deutliche Zunahme nach 24 Stunden bei 1 und 10 U/ml EPO. Der Einfluss von EPO auf die Proliferation der Zellen wurde an Neurosphären unter Einsatz verschiedener EPO-Konzentrationen (0,1U/ml, 1U/ml und 10U/ml) sowie ohne EPO (Kontrollgruppe) untersucht. Dabei zeigte sich eine Reduzierung der Sphärenanzahl mit einem Durchmesser von >100µm bei zunehmender EPO-Konzentration. Im Gegensatz hierzu stieg die Anzahl der Sphären mit einem Durchmesser von 50-100µm. Die neuronale Differenzierung wurde durch den Zellfortsatz-Versuch mit Tuj1 positiven Zellfortsätzen in einer Monolayer-Kultur beobachtet. Dabei zeigte sich unter EPO eine Zunahme der Zellen mit einem Fortsatz. Ebenso wurde eine Durchflusszytometrie zum Nachweis der Proliferationshemmung durch EPO durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit CFSE markiert und mit einer EPO- oder Kontrolllösung versetzt. Dabei zeigte sich bei zunehmender EPO-Konzentration eine deutliche Zunahme der CFSE-Konzentration nach 48 und 72 Stunden. Der Nachweis, dass die Zellen auf EPO reagieren, wurde durch einen Western Blot erbracht. Dieser zeigte, dass die verwendeten 4F induzierte pan neurale Progenitorzellen (4F ipNP-Zellen) einen funktionellen EPO-Rezeptor besitzen, dessen Expression durch EPO deutlich gesteigert werden kann.
Es konnte gezeigt werden, dass EPO die Proliferation der Zellen vermindert, gleichzeitig aber auch die Zellviabilität und die Zelldifferenzierung erhöht. Diese Ergebnisse sind jedoch von vielen Faktoren abhängig, sodass noch einiges auf diesem Gebiet zu erforschen bleibt.
In Anbetracht der Tatsache, dass das SHT weltweit mit steigender Inzidenz die häufigste Todesursache für junge Erwachsene darstellt, in einer Vielzahl davon mit langfristigen Folgen assoziiert ist und dabei mit großen ökonomischen Kosten verbunden ist, spielt die Erforschung der pathophysiologischen Vorgänge bei einem SHT sowie die Entwicklung effektiver Therapiestrategien akuter und chronischer Natur eine große Rolle.
Da sich in den letzten Jahren gezeigt hat, dass die Reaktion des Immunsystems nach akuten Traumata ebenfalls eine bedeutsame Rolle spielt und somit in der Modulation der Immunantwort ein hilfreicher therapeutischer Ansatz liegen könnte, wurde in dieser Arbeit der als MS-Immuntherapeutikum zugelassene S1P Rezeptor Modulator FTY720 auf seine potentiellen neuroprotektiven Effekte im Rahmen eines murinen fokalen SHT-Modell untersucht.
So wurde das in unserer Arbeitsgruppe bereits seit langem etablierte Modell der fokalen kortikalen Kälteläsion genutzt um bei jungen adulten männlichen Mäusen die Effekte von FTY720 in Bezug auf die Akutphase 24 h nach lokalen SHT festzustellen. Hierbei konnte kein positiver Einfluss auf das Ausmaß des lokalen Schadens, gemessen anhand von TTC-Läsionsvolumen und neuronalem Zelltod, sowie für die Störung der BHS mit konsekutiver Ödembildung beobachtet werden. Dabei wurden keine funktionellen Parameter als Korrelat für die erhaltenen Ergebnisse getestet.
In Bezug auf die Immunzellinfiltration konnte eine signifikante Reduktion der immunhistochemisch untersuchten Zellpopulationen von Neutrophilen, Makrophagen und aktivierten Mikroglia 24 h nach Trauma festgestellt werden und somit zumindest die korrekte Applikation des Medikaments in adäquater Dosierung und die therapeutische Wirkung als Blockierer des Abwehrzell-Ausstroms von den lymphatischen Organen in die Blutbahn belegt werden.
Schädel-Hirn Trauma ist die führende Ursache von Tod und Behinderung unter jungen Erwachsenen in den USA und Europa. Darüber hinaus steigert Schädel-Hirn Trauma das Risiko eine Demenzerkrankung oder andere neurodegenerative Erkrankung zu erleiden. Aus diesem Grund stellt eine bessere Erkenntnis der subakuten und chronischen pathophysiologischen Prozesse eine wichtige Grundlage für eine mögliche zukünftige neuroprotektive Therapie dar. Ziel dieser Arbeit war es daher eine Übersicht von funktionellen Einschränkungen und zellulären Veränderungen in der subakuten Phase innerhalb der ersten drei Monate darzustellen. Dazu wurden Verhaltensexperimente zu kognitiven Leistungen wie räumliches Lernen, kognitive Plastizität, episodisches Gedächtnis, Angstverhalten und allgemeine Lokomotion durchgeführt. Dabei konnten funktionale Einschränkungen der Tiere im Bereich der kognitiven Flexibilität, dem räumlichen Lernen, dem belohnungsmotivierten Verhalten, sowie Hyperaktivität beobachtet werden. Weiterführend erfolgten histologische und immunhistologische Untersuchungen an den Mäusegehirnen. So konnten in unserem Tiermodell sowohl lokale neuroinflammatorische Veränderungen nachgewiesen werden, also auch generalisierte Veränderungen, welche sich auf Isocortex und Hippocampus erstreckten und beide Hemisphären gleichermaßen betrafen. Ebenso konnten demyelinisierende Prozesse im Bereich der Läsion beobachtet werden. Im Bereich des Cortex zeigte sich außerdem eine axonale Schädigung mit begleitender Neuroinflammation, sowie eine Infiltration von B-Zellen. Anschließend wurde eruiert, ob eine Korrelation von funktionalem Outcome und histologischen Veränderungen besteht. Dabei zeigte sich eine signifikante Korrelation neuroinflammatorischer Prozesse mit Einschränkungen im räumlichen Lernen und Umlernen, sowie Auffälligkeiten im Bereich des belohnungsmotivierten Verhaltens. Damit ordnet sich diese Arbeit in die bestehenden Erkenntnisse zur Pathophysiologie des SHTs ein und ergänzt diese weiter.
Die WHO-Klassifikation der Hirntumoren von 2016 ebnete den Weg für molekulare Marker und Therapie-Angriffspunkte. Der Transkriptionsfaktor ATF5 könnte ein solcher sein. Er unterdrückt die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen und wird in Glioblastomen (GBM) überexprimiert. Daten zur ATF5-Expression in WHO Grad II Gliomen (LGG) und GBM-Rezidiven sind nur spärlich vorhanden. Daher untersuchten wir 79 GBM, 40 LGG und 10 Normalhirnproben auf ihre ATF5-mRNA- und Proteinexpression mit quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Immunhistochemie und verglichen sie mit multiplen, retrospektiv erhobenen klinischen Charakteristika der Patienten. ATF5 war in LGG und GBM verglichen zum Normalhirn sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene überexprimiert. Obwohl die ATF5-mRNA-Expression im GBM eine erhebliche Fluktuationsrate zeigte, gab es keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen GBM-Gruppen unterschiedlicher biologischer Wachstumsmuster. ATF5-mRNA korrelierte mit dem Alter der Patienten und invers mit der Ki67-Färbung. Kaplan Meier- und Cox-Regressionsanalysen zeigten eine signifikante Korrelation der ATF5-mRNA-Expression mit dem Überleben nach 12 Monaten sowie dem progressionsfreien Überleben. Die Methylierung des Promotors der O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist ein etablierter Marker in der Therapie des GBMs. Sie ist mit dem therapeutischen Ansprechen auf Temozolomid und dem Überleben assoziiert. Uns fielen inzidentell Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung auf, woraufhin wir den aktuellen Wissensstand mittels einer ausführlichen Literatur-Metaanalyse zusammenfassten. Dabei fanden wir Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung bei 115 der 476 Patienten. Wir schlussfolgern, dass die ATF5-mRNA-Expression als prognostischer Faktor für das Überleben der Patienten dienen könnte. Da seine in vitro-Inhibition zu einem selektiven Zelltod von Gliomzellen führte und wir eine Überexpression in glialen Tumoren nachweisen konnten, zeigt ATF5 Potential als ubiquitäres Therapieziel in Gliomen. Zum aktuellen Zeitpunkt ergibt sich keine klare Indikation, den klinischen Standard der MGMT-Teststrategie zu verändern. Trotzdem könnte eine erneute Testung der MGMT-Promotormethylierung für zukünftige Therapieentscheidungen sinnvoll sein und wir regen an, dass dieses Thema in klinischen Studien weiter untersucht wird.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass aus uniparentalen, embryonalen
Stammzellen mit fehlender maternal geprägter Genexpression (AG-Zellen)
differenzierte neuronale Progenitorzellen (pNPCs) eine ähnliche neuronale
Kapazität wie wildtypische Progenitorzellen haben. Sie bilden nach
histomorphologischen Kriterien in vitro adulte Neurone mit Ausbildung eines
synaptischen Netzwerks. In elektrophysiologischen PatchClamp-
Untersuchungen wurde gezeigt, dass diese Zellen, ähnlich dem wildtypischen
Pendant, spannungsabhängige Natrium- und Kaliumkanälen besitzen, ein
negatives Membranpotential haben und bei Stimulation mit repetitiven
Aktionspotentialen reagieren. Nach Transplantation in einem Schädel-Hirn-
Trauma-Modell konnten nach drei Monaten in vivo Donorzellen mit neuraler
Morphologie und der Expression von jungen, neuronalen und glialen Proteinen
gefunden werden. Die Teratombildung ist im Vergleich zum Wildtyp unverändert,
eine maligne Entartung mit invasivem Wachstum oder ausgedehnter
Metastasierung konnte nicht gefunden werden. Aus AG-Zellen generierte
neuronale Progenitorzellen sind ein starkes Instrument, um neuronale
genomische Prägung zu untersuchen. Außerdem könnte die regenerative
Kapazität für eine patientenspezifische Zellersatztherapie genutzt werden.
In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit.
Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels.
Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere.