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In dieser Arbeit wurde die Krankheitsprogression im Parkinson-Mausmodell hm2α-SYN-39 mit zunehmendem Alter charakterisiert. Die Mäuse wurden in 4 Altersgruppen (2-3, 7-8, 11-12, 16-17 Monate) mit motorischen Verhaltenstests auf einen Parkinson-Phänotyp untersucht. Zudem erfolgten Untersuchungen des dopaminergen Systems zur Detektion von neurochemischen Veränderungen und einer Neurodegeneration im nigrostriatalen Trakt. Weiterhin wurden neuroinflammatorische Prozesse des adaptiven und angeborenen IS in der SN und im Striatum mittels immunhistochemischer Färbungen beurteilt.
Ein Parkinson-Phänotyp in diesem Mausmodell zeigte sich nur leicht ausgeprägt, sodass der Rotarod- und Zylinder-Test lediglich den Hinweis auf eine nicht-signifikante Einschränkung der Motorik erbrachte. Dennoch ergab die stereologische Quantifizierung TH- und Nissl-positiver Zellen in der SNpc der hm2α-SYN-39 Mäuse eine altersabhängige, signifikant-progrediente Reduktion der dopaminergen Neurone mit zunehmendem Alter. Eine signifikant niedrigere TH-positive Zellzahl dieser tg Mäuse zeigte sich ab einem Alter von 16-17 Monaten verglichen zu gleichaltrigen wt Tieren. Dagegen war die Neurodegeneration im Striatum etwas weniger ausgeprägt. Die tg Mäuse präsentierten im Alter von 16-17 Monaten eine nicht-signifikante Erniedrigung der dopaminergen Terminalen verglichen zu gleichaltrigen wt Tieren. Ein DA-Mangel im Striatum der tg Mäuse konnte mittels HPLC bestätigt werden. Bis zum Alter von 16-17 Monaten wurde eine signifikante Reduktion der DA-Level von 23,2 % verglichen zu gleichaltrigen wt Mäusen gezeigt. Außerdem erniedrigt waren die striatalen Level von NA und 5-HAT bei tg Mäusen, passend zu den bisherigen Ergebnissen bei Parkinson-Patienten.
Immunhistochemische Untersuchungen einer Neuroinflammation im nigrostriatalen Trakt ergaben eine tendenziell erhöhte Infiltration von CD4- und CD8-positiven T-Zellen bei hm2α-SYN-39 Mäusen mit zunehmendem Alter, wobei die Infiltration CD8-positiver Zellen ausgeprägter war als bei CD4-positiven Zellen. Eine noch deutlichere neuroinflammatorische Reaktion zeigte das angeborene IS. Hierbei ergab die immunhistologische Quantifizierung CD11b-positiver mikroglialer Zellen einen hochsignifikanten Anstieg im nigrostriatalen Trakt bei hm2α-SYN-39 Mäusen schon im jungen Alter.
Zusammenfassend präsentierte dieses Parkinson-Mausmodell eine langsam-progrediente Parkinson-Pathologie mit begleitender Neuroinflammation im nigrostriatalen Trakt während des Alterns, wobei die Immunantwort der mikroglialen Zellen zu einem früheren Zeitpunkt einsetzte als die T-Zellinfiltration und Neurodegeneration. Dieses Mausmodell bietet zahlreiche Möglichkeiten zur zukünftigen Erforschung der Pathophysiologie beim MP. Generell weist diese Arbeit auf eine bedeutende Rolle neuroinflammatorischer Prozesse in der Krankheitsprogression der Parkinsonerkrankung hin und soll dazu ermutigen Neuroinflammation durchaus intensiver in tg Tiermodellen zu untersuchen.
Hintergrund dieser Doktorarbeit ist die ungeklärte Pathophysiologie der idiopathischen Dystonie. Die DYT1 Dystonie ist die häufigste hereditäre Dystonie und weist eine Mutation im Tor1a-Gen auf, welches das Protein TorsinA kodiert. Diese DYT1 Dystonie besitzt interessanterweise lediglich eine Penetranz von 30%. Ein gutes Nagermodell mit einem klinisch dystonen Phänotyp existiert bislang nicht. Diese Dissertation adressiert die Frage, ob sich eine Dystonie bei DYT1 relevanter genetischer Prädisposition durch peripheren Stress („second-hit“) manifestiert.
Bei Tor1a +/- Mäusen (50% TorsinA Expression, Tor1a +/-), die im naiven Zustand keinen dystonen Phänotyp haben, sowie bei Wildtyp (wt) Kontrolltieren im Alter von vier Monaten wurde eine rechtsseitige reversible N. ischiadicus Quetschläsion durchgeführt. Die Tiere wurden daraufhin in einem Beobachtungszeitraum von acht Wochen nach dem Trauma verhaltensanalytisch und morphologisch untersucht.
Folgende Ergebnisse wurden hierbei erzielt: Im „Tail-suspension-Test“ zeigte sich bereits ein Tag nach der Quetschläsion des N. ischiadicus eine passagere Parese des betroffenen rechten Hinterbeins bei wt und Tor1a +/- Mäusen. Die fokale Dystonie entwickelte sich ab der vierten Woche bei Tor1a +/- Mäusen stärker als bei den wt Kontrolltieren. Durch das computergestützte Ganganalysesystem (Catwalk™ XT 10.0) konnte bei wt und Tor1a +/- Tieren eine Woche nach der Quetschläsion eine Veränderung der Schrittfolgemuster mit einer Reduktion des Schrittfolge-Regularitäts-Index festgestellt werden. Die abnormale Schrittfolge beim Laufen führte bei Tor1a +/- Mäusen zu einer progredienten Abnahme des Schrittfolge-Regularitäts-Index, während sich wt Mäuse nach fünf Wochen aber wieder erholten. Bei der Überprüfung der Koordinationsfähigkeit beider Genotypen durch den Rotarod Test konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Immunhistochemische Färbungen des N. ischiadicus auf den Myelinmarker Myelinprotein Zero MPZ, den axonalen Marker Neurofilament und Makrophagen Marker F4/80+ vor der Nervenläsion und acht Wochen nach der Nervenläsion zeigten ebenso keine signifikanten Unterschiede zwischen wt und Tor1a +/- Tieren. Die Anzahl Nissl+ Neurone im lumbalen Rückenmark (L2-4), Striatum und zerebralen Kortex und zudem die Anzahl CD11b positiver Mikroglia im lumbalen Rückenmark (L2-4) wiesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede im Vergleich der beiden Genotypen nach Nervenläsion auf.
Abschließend wurden noch verschiedene Behandlungsexperimente durchgeführt, um zu klären, ob die gefundenen Unterschiede zwischen Tor1a +/- und Tor1a +/+ Mäusen dopaminerg verursacht sind. Hierfür wurden sowohl genetisch mutierte Tor1a +/- Mäuse als auch wt Mäuse nach der Quetschläsion entweder mit einem Kombinationspräparat aus L-Dopa und Benserazid oder mit AMPT acht Wochen lang behandelt.
Folgende Ergebnisse wurden hierbei ermittelt: Die Schrittfolgeregularität beim Catwalk™ XT 10.0 zeigte bei genetisch mutierten Mäusen eine deutliche Auswirkung der Medikation. Tor1a +/- AMPT Mäuse wiesen nach der Läsion eine progrediente Zunahme der Schrittfolgeregularität auf das Ausgangsniveau auf, Tor1a + /- L-Dopa Mäuse hingegen entwickelten auf die Läsion hin eine kontinuierliche Abnahme der Schrittfolgeregularität und konnten sich nicht auf ihr Ausgangsniveau erholen. Die Ergebnisse beim „Tail-suspension-Test“ zeigten ähnliche Resultate: Tor1a +/- Mäuse wiesen nach der Quetschläsion auf die Verabreichung von AMPT hin eine Reduktion der fokalen Dystonie auf, wohingegen die Behandlung mit L-Dopa bei Mutanten zu einer Verschlechterung der Dystonie führte.
Schlussfolgernd zeigt die vorliegende Dissertation, dass ein peripheres Trauma bei genetisch prädispositionierten Mäusen im Sinne eines „second-hits“ zur klinischen Ausprägung einer DYT1 Dystonie führt. Die verstärkte fokale Dystonie in Tor1a +/- Mäusen ist nicht durch ein unterschiedliches Ausmaß an Nervenschädigung nach N. ischiadicus Quetschläsion oder durch morphologische Veränderungen der Tor1a +/- Mäuse im Bereich des N. ischiadicus, Rückenmarks, Striatums oder des Kortex zu begründen.
Auch wenn die Ätiopathogenese von Morbus Parkinson bis heute nicht vollständig geklärt ist, scheint α-Synuclein (α-Syn) eine zentrale Rolle zu spielen. Die Entdeckung als genetische Ursache der Erkrankung, als Hauptbestandteil der Lewy-Körper (LK) und seine Assoziation mit verschiedenen anderen potenziellen ätiologischen Faktoren verdeutlichen dies.
Bei Ratten und Affen führte eine AAV1/2-vermittelte Überexpression von A53T-α-Syn zu einer Degeneration dopaminerger Neurone in der Substantia nigra (SN), einem striatalen dopaminergen Defizit sowie Verhaltensauffälligkeiten. In Anbetracht bestimmter Vorteile der Mausspezies, war es das Ziel dieser Dissertation - die im Rahmen eines kollaborativen Projektes mit dem Toronto Western Research Institut in Ontario, Kanada entstanden ist - dieses auf AAV1/2-A53T-α-Syn basierende Parkinson-Modell auf Mäuse zu übertragen.
Dazu wurde AAV1/2-A53T-α-Syn oder leerer AAV1/2-Vektor in einer Dosis von 1,5 µl mit einer Konzentration von 5,16 x 10^12 gp/ml stereotaktisch einseitig in die rechte SN von C57BL/6-wt-Mäusen injiziert. Über einen Zeitraum von 11 Wochen wurden verschiedene Verhaltensexperimente durchgeführt und die beiden Versuchstiergruppen miteinander verglichen. Post-mortem erfolgten verschiedene immunhistochemische Untersuchungen.
Es konnte gezeigt werden, dass die einseitige Injektion von AAV1/2-A53T-α-Syn in die SN bei Mäusen eine weit verbreitete Überexpression von A53T-α-Syn in dopaminergen Neuronen der SN induzierte, die innerhalb von 10 Wochen zu signifikanten frühen und persistierenden motorischen Verhaltensauffälligkeiten, nigrostriataler Degeneration und Entwicklung einer Lewy-ähnlichen Pathologie führte.
Durch die Generierung und Charakterisierung dieses neuen Parkinson-Mausmodells, das klinische und histopathologische Merkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt, besteht nun die Möglichkeit es weiterzuentwickeln und z.B. auf transgene Mäuse zu übertragen, um u.a. molekulare Mechanismen der Parkinson-Krankheit zu entschlüsseln und präklinische Tests von krankheitsmodifizierenden Therapien durchzuführen.
Die dem Formenkreis der Dystonien zugrundeliegenden, pathophysiologischen Grundlagen sind bislang nicht abschließend geklärt. Für die DYT-TOR1A Dystonie ist bekannt, dass eine 3-bp Deletion eines GAG-Codons im TOR1A-Gen auf Chromosom 9 einen Funktionsverlust des Proteins TorsinA bewirkt. Dieser Funktionsverlust wird als auslösender Faktor für die Entstehung der DYT-TOR1A Dystonie angenommen. Nichtsdestotrotz entwickeln lediglich circa 30% der Mutationsträger eine dystone Bewegungsstörung. Als Grund dafür wird eine Two-hit Hypothese diskutiert, die zusätzlich zur genetischen Prädisposition einen Umweltfaktor wie ein peripheres Trauma für die Entstehung von Symptomen postuliert. Durch eine standardisierte Quetschläsion des N. ischiadicus konnte mit dieser Arbeit bei DYT1KI Mäusen, die die ∆GAG-Mutation im endogenen Genom tragen, ein dystoner Phänotyp hervorgerufen werden. Mit den Aufzeichnungen der Mäuse im TST wurde ein neuronales Netzwerk mittels der Software „DeepLabCut“ trainiert, sodass die Dystonie-ähnlichen Bewegungen automatisiert erfasst und ausgewertet werden konnten. Das Netzwerk trägt dazu bei, dem vorwiegend klinischen Syndrom der Dystonie eine objektive kinematische Charakterisierung zu bieten und kann auf andere TSTs anderer Nagermodelle übertragen werden. Ferner wurde überprüft, ob die beobachteten Bewegungen durch Unterschiede in der Regeneration nach der Nervenquetschung zustande kamen. Elektroneurographien zeigten jedoch diesbezüglich keine Unterschiede zwischen wt und DYT1KI Tieren. Darüber hinaus sind mikromorphologische Prozesse im zentralen und peripheren Nervensystem Gegenstand dieser Studie. Einerseits konnten wir mittels Immunzellfärbungen von T-, B-Zellen, Makrophagen und Mikroglia feststellen, dass sowohl zentral als auch peripher kein Anhalt darauf besteht, dass die beim DYT1KI Mausmodell entstandenen Dystonie-ähnlichen Bewegungen auf einer Dysfunktion oder Aktivierung des Immunsystems, wie es bei anderen neurologischen Erkrankungen bereits nachgewiesen wurde, eine Rolle spielt. Andererseits konnte anhand stereologischer Messungen gezeigt werden, dass bei den naiven DYT1KI Tieren im Vergleich zu wt Tieren dopaminerge Neurone der SN in der Anzahl verringert und im Volumen vergrößert sind, was auf einen Endophänotypen hinweist. Bei den symptomatischen, nervengequetschten DYT1KI Mäusen zeigte sich wiederum eine weitere, signifikante Zunahme der Hypertrophie der dopaminergen Neurone als Hinweis auf eine unmittelbar mit dem dystonen Phänotypen in Zusammenhang stehende Veränderung. Zusammenfassend konnte ein symptomatisches Mausmodell von hoher translationaler Bedeutung etabliert werden, in dem sich Hinweise für eine dopaminerge Dysregulation ergaben und welches für weitere Studien, insbesondere therapeutischer Art, eingesetzt werden könnte.
Early-onset torsion dystonia (DYT-TOR1A, DYT1) is an inherited hyperkinetic movement disorder caused by a mutation of the TOR1A gene encoding the torsinA protein. DYT-TOR1A is characterized as a network disorder of the central nervous system (CNS), including predominantly the cortico-basal ganglia-thalamo-cortical loop resulting in a severe generalized dystonic phenotype. The pathophysiology of DYTTOR1A is not fully understood. Molecular levels up to large-scale network levels of the CNS are suggested to be affected in the pathophysiology of DYT-TOR1A. The reduced penetrance of 30% - 40% indicates a gene-environmental interaction, hypothesized as “second hit”. The lack of appropriate and phenotypic DYT-TOR1A animal models encouraged us to verify the “second hit” hypothesis through a unilateral peripheral nerve trauma of the sciatic nerve in a transgenic asymptomatic DYT-TOR1A rat model (∆ETorA), overexpressing the human mutated torsinA protein. In a multiscale approach, this animal model was characterized phenotypically and pathophysiologically.
Nerve-injured ∆ETorA rats revealed dystonia-like movements (DLM) with a partially generalized phenotype. A physiomarker of human dystonia, describing increased theta oscillation in the globus pallidus internus (GPi), was found in the entopeduncular nucleus (EP), the rodent equivalent to the human GPi, of nerve-injured ∆ETorA rats. Altered oscillation patterns were also observed in the primary motor cortex. Highfrequency stimulation (HFS) of the EP reduced DLM and modulated altered oscillatory activity in the EP and primary motor cortex in nerve-injured ∆ETorA rats. Moreover, the dopaminergic system in ∆ETorA rats demonstrated a significant increased striatal dopamine release and dopamine turnover. Whole transcriptome analysis revealed differentially expressed genes of the circadian clock and the energy metabolism, thereby pointing towards novel, putative pathways in the pathophysiology of DYTTOR1A dystonia.
In summary, peripheral nerve trauma can trigger DLM in genetically predisposed asymptomatic ΔETorA rats leading to neurobiological alteration in the central motor network on multiple levels and thereby supporting the “second hit” hypothesis. This novel symptomatic DYT-TOR1A rat model, based on a DYT-TOR1A genetic background, may prove as a valuable chance for DYT-TOR1A dystonia, to further investigate the pathomechanism in more detail and to establish new treatment strategies.
Neurodegeneration plays an essential role in Parkinson’s disease (PD). Several crucial neuronal pro-and antidegeneration markers were described to be altered in disease models accompanied by neurodegeneration. In the AAV1/2-A53T-aSyn PD rat model progressive time-dependent motor impairment and neurodegeneration in the nigrostriatal tract starting from 2 weeks after PD model induction could be found. Downregulation of Nrf2 in SN and nigrostriatal axon localization, a trend of Tau downregulation in SN and upregulation in axon localization in the AAV1/2-A53T-aSyn PD rat model were observed, indicating potential therapeutic value of these two molecular targets in PD. No alterations of SARM1 and NMNAT2 could be detected, indicating little relevance of these two molecules with our AAV1/2-A53T-aSyn rat model.
Schwerpunktmäßig befasst sich diese Arbeit mit den praktischen Vorgängen zur Zählung von Neuronen mit dem optischen Fraktionator unter dem Mikroskop, wobei zur Veranschaulichung die Neuronen in der Substantia Nigra an C57BL/6-Mäusen gezählt wurden. Es wurde erläutert, wie die Einstellungen der jeweiligen Methode vorzunehmen sind und auf die angestrebten Ziele angepasst werden können, um ein effizientes Zählen von Neuronen unter Berücksichtigung grundlegender Zählregeln zu gewährleisten. Gleichzeitig wurde gezeigt, wie die Methoden des optischen Fraktionators die gewünschten präzisen Ergebnisse anhand des CE-Wertes liefern können.
Die in dieser Arbeit präsentierte Axiophot-2-Methode ist in der Lage, selbst mit einem einfachen, kommerziell erhältlichen Lichtmikroskop und einem Standbildaufnahmeprogramm die Gesamtanzahl von Zellen einer gegebenen Struktur unter Beachtung aller stereologischen Regeln zu zählen – und zwar genauso effizient und mit vergleichbaren Ergebnissen wie mit einem speziell für stereologische Untersuchungen vorgefertigtes Komplettsystem. Vergleiche beider Methoden zueinander ergeben folgende Schlussfolgerungen: bei dem Stereo Investigator, ist die Untersuchung zwar wesentlich schneller, da die Bildaufnahme und Auswertung mittels voreingestellten Programmes automatisch durchgeführt werden. Allerdings ist solch ein Komplettsystem sehr kostspielig (ca. 60.000 Euro Anschaffungskosten) und nicht flexibel auf andere Untersuchungsbereiche einsetzbar.
Die Axiophot-2-Methode weist zwar einige Nachteile aufgrund der manuellen Vorarbeiten auf, ist aber dafür wesentlich günstiger und zugänglicher, da sie nur ein konventionelles Mikroskop mit einem Standardprogramm erfordert.