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Alzheimer´s disease (AD) is a neurodegenerative disease and the most common form of dementia with still no preventive or curative treatment. Besides several risk factors, age is one of the major risks for AD and with an aging society, there is an urgent need for disease modifying agents. The strategy to address only one target within the intertwined network of AD failed so far.
Natural products especially the phytochemical flavonoids, which are poly-phenolic natural products, have shown great potential as disease modifying agents against neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease (AD) with activities even in vivo. Flavonoids are produced by many plants and the native Californian plant Eriodictyon californicum is particularly rich in flavonoids. One of the major flavonoids of E. californicum is sterubin, a very potent agent against oxidative stress and inflammation, two hallmarks and drivers of AD and neurodegeneration. Herein, racemic sterubin was synthesized and separated into its pure (R)- and (S)-enantiomer by chiral HPLC. The pure enantiomers showed comparable neuroprotection in vitro with no significant differences. The stereoisomers were configurationally stable in methanol, but fast racemization was observed in culture medium. Moreover, the activity of sterubin was investigated in vivo, in an AD mouse model. Sterubin showed a significant positive impact on short- and long-term memory at low dosages.
A promising concept for the increase of activity of single flavonoids is hybridization with aromatic acids like cinnamic or ferulic acids. Hybridization of the natural products taxifolin and silibinin with cinnamic acid led to an overadditive effect of these compounds in phenotypic screening assays related to neurodegeneration and AD. Because there are more potent agents as taxifolin or silibinin, the hybrids were further developed, and different flavonoid cinnamic acid hybrids were synthesized. The connection between flavonoids and cinnamic acid was achieved by an amide instead of a labile ester to improve the stability towards hydrolysis to gain better “druggability” of the compounds. To investigate the oxidation state of the C-ring of the flavonoid part, the dehydro analogues of the respective hybrids were also synthesized. The compounds show neuroprotection against oxytosis, ferroptosis and ATP-depletion in the murine hippocampal cell line HT22. While no overall trend within the flavanones compared to the flavones could be assigned, the taxifolin and the quercetin derivative were the most active compounds in course of all assays. The quercetin derivate even shows greater activity than the taxifolin derivate in every assay. As desired no hydrolysis product was found in cellular uptake experiments after 4h, whereas different metabolites were found. The last part of this work focused on synthetic bioisoteres of the natural product curcumin. Due to the drawbacks of curcumin and flavonoids arising from poor pharmacokinetics, rapid metabolism and sometimes instability in aqueous medium, we have examined the biological activity of azobenzene compounds designed as bioisoteres of curcumin, carrying the pharmacophoric catechol group of flavonoids. These bioisosteres exceeded their parent compounds in counteracting intracellular oxidative stress, neuroinflammation and amyloid-beta aggregation. By incorporating an azobenzene moiety and the isosteric behaviour to the natural parent compounds, these compounds may act as molecular tools for further investigation towards the molecular mode of action of natural products.
Integrative, three-dimensional \(in\) \(silico\) modeling of gas exchange in the human alveolus
(2024)
The lung plays a vital role by exchanging respiratory gases. At the core of this gas exchange is a simple yet crucial passive diffusion process occurring within the alveoli. These balloon-like structures, connected to the peripheral airways, are surrounded by a dense network
of small capillaries. Here, inhaled air comes into close proximity with deoxygenated blood coming from the heart, enabling the exchange of oxygen and carbon dioxide across their concentration gradients.
The efficiency of gas exchange can be measured through indicators such as the diffusion capacity of the lung for oxygen and the reaction half-time. A notable discrepancy exists in humans between physiological estimates of diffusion capacity and the theoretical maximum capacity under optimal structural conditions (morphological estimate). This discrepancy is influenced by a range of interrelated factors, including structural elements like the surface area and thickness of the diffusion barrier, as well as physiological factors such as blood flow dynamics. To unravel the different roles of these factors, we investigated how morphological and physiological properties of the human alveolar micro-environment collectively and individually influence the process of gas exchange. To this end, we developed an integrative in silico approach combining 3D morphological modeling and simulation of blood flow and of oxygen transport.
At the core of our approach lies the simulation software Alvin, serving as an interactive platform for the underlying mathematical model of oxygen transport within the alveolus. Developed by integrating and expanding existing mathematical models, our spatio-temporal model produces results in agreement with experimental data. Alvin allows for real-time parameter adjustments and the execution of multiple simultaneous simulation instances and provides detailed quantitative feedback, offering an immersive exploration of the simulated gas exchange process. The morphological and physiological parameters at play were further investigated with a focus on the microvasculature. By compiling a stereological database from the literature and 3D geometric modeling, we created a sheet-flow model as a realistic representation of the morphology of the human alveolar capillary network. Blood flow was simulated using computational fluid dynamics. Our findings were in line with previous estimations and highlighted the crucial role of viscosity models in predicting pressure drop across the microvasculature. Furthermore, we showcased how our approach can be harnessed to explore structural details, such as the connectivity of the alveolar capillary network with the vascular tree, using blood flow indices. It is important to emphasize that
so far we have relied on different data sources and that experimental validation is needed to move forward.
Integration of our findings into Alvin allowed quantification of the simulated gas exchange process through the diffusion capacity for oxygen and reaction half-time. In addition to evaluating the collective influences of the morphological and physiological properties, our interactive software facilitates the assessment of individual parameter value changes. Exploring blood volume and surface area available for gas exchange revealed linear correlations with diffusion capacity. The blood flow velocity had a positive, non-linear effect on diffusion capacity. The reaction half-time confirmed that under normal conditions, the gas exchange process is not diffusion-limited. Collectively, our alveolar model yielded a diffusion capacity value that fell in the middle of previous physiological and morphological estimates, implying that alveolar-level phenomena contribute to 50% of the diffusion capacity limitations that occur in vivo.
In summary, our integrative in silico approach disentangles various structural and functional influences on alveolar gas exchange, complementing traditional investigations in respiratory
research. We further showcase its utility in teaching and the interpretation of published data. To advance our understanding, future work should prioritize obtaining a cohesive experimental data set and identifying an appropriate viscosity model for blood flow simulations.
Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert.
Thema dieser Thesis ist die Analyse sekretorischer Vesikelpools auf Ultrastrukturebene in unterschiedlichen biologischen Systemen. Der erste und zweite Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Analyse synaptischer Vesikelpools in neuromuskulären Endplatten (NME) im Modellorganismus Caenorhabditis elegans. Dazu wurde Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution angewandt, um eine unverzügliche Immobilisation der Nematoden und somit eine Fixierung im nahezu nativen Zustand zu gewährleisten. Anschließend wurden dreidimensionale Aufnahmen der NME mittels Elektronentomographie erstellt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden junge adulte, wildtypische C. elegans Hermaphroditen mit Septin-Mutanten verglichen. Um eine umfassende Analyse mit hoher Stichprobenzahl zu ermöglichen und eine automatisierte Lösung für ähnliche Untersuchungen von Vesikelpools bereit zu stellen wurde eine Software namens 3D ART VeSElecT zur automatisierten Vesikelpoolanalyse entwickelt. Die Software besteht aus zwei Makros für ImageJ, eines für die Registrierung der Vesikel und eines zur Charakterisierung. Diese Trennung in zwei separate Schritte ermöglicht einen manuellen Verbesserungsschritt zum Entfernen falsch positiver Vesikel. Durch einen Vergleich mit manuell ausgewerteten Daten neuromuskulärer Endplatten von larvalen Stadien des Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) konnte erfolgreich die Funktionalität der Software bewiesen werden. Die Analyse der neuromuskulären Endplatten in C. elegans ergab kleinere synaptische Vesikel und dichtere Vesikelpools in den Septin-Mutanten verglichen mit Wildtypen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden neuromuskulärer Endplatten junger adulter C. elegans Hermaphroditen mit Dauerlarven verglichen. Das Dauerlarvenstadium ist ein spezielles Stadium, welches durch widrige Umweltbedingungen induziert wird und in dem C. elegans über mehrere Monate ohne Nahrungsaufnahme überleben kann. Da hier der Vergleich der Abundanz zweier Vesikelarten, der „clear-core“-Vesikel (CCV) und der „dense-core“-Vesikel (DCV), im Fokus stand wurde eine Erweiterung von 3D ART VeSElecT entwickelt, die einen „Machine-Learning“-Algorithmus zur automatisierten Klassifikation der Vesikel integriert. Durch die Analyse konnten kleinere Vesikel, eine erhöhte Anzahl von „dense-core“-Vesikeln, sowie eine veränderte Lokalisation der DCV in Dauerlarven festgestellt werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht ob die für synaptische Vesikelpools konzipierte Software auch zur Analyse sekretorischer Vesikel in Thrombozyten geeignet ist. Dazu wurden zweidimensionale und dreidimensionale Aufnahmen am Transmissionselektronenmikroskop erstellt und verglichen. Die Untersuchung ergab, dass hierfür eine neue Methodik entwickelt werden muss, die zwar auf den vorherigen Arbeiten prinzipiell aufbauen kann, aber den besonderen Herausforderungen der Bilderkennung sekretorischer Vesikel aus Thrombozyten gerecht werden muss.
Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated.
Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits.
In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit.
Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels.
Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere.
The Role of Sphingosine 1-phosphate and S1PR1-3 in the Pathophysiology of Meningococcal Meningitis
(2024)
Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is an obligate human pathogen which causes live-threatening sepsis and meningitis. The fatality rate after meningococcal infection is high and surviving patients often suffer from severe sequelae. To cause meningitis, N. meningitidis must overcome the endothelium of the blood-brain barrier. The bacterium achieves this through the interaction with endothelial surface receptors leading to alternations of the cellular metabolism and signaling, which lastly results in cellular uptake and barrier traversal of N. meningitidis. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that belongs to the class of sphingolipids and regulates the integrity of the blood-brain barrier through the interaction with its cognate receptors S1P receptors 1-3 (S1PR1-3).
In this study, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to generate a time-resolved picture of the sphingolipid metabolism in a brain endothelial cell line (hCMEC/D3) upon meningococcal infection. Among various changes, S1P was elevated in the cellular compartment as well as in the supernatant of infected hCMEC/D3s. Analysis of mRNA expression in infected hCMEC/D3s with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) revealed that the increase in S1P could be attributed to the enhanced expression of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1). Antibody-based detection of SphK1 protein or phosphorylation at SphK1 residue Serine 225 in hCMEC/D3 plasma membrane fractions via Western Blot revealed that N. meningitidis also induced SphK1 phospho-activation and recruitment to the plasma membrane. Importantly, recruitment of SphK1 to the plasma membrane increases the probability of substrate encounter, thus elevating SphK activity. Enhanced SphK activity was also reflected on a functional level, as detected by a commercially available ATP depletion assay used for measuring the enzymatic activity of SphK. Infection of hCMEC/D3 cells with pilus-deficient mutants resulted in a lower SphK activation compared to the N. meningitidis wild type strain. hCMEC/D3 treatment with pilus-enriched protein fractions showed SphK activation similar to the infection with living bacteria and could be ascribed to pilus interaction with the membrane-proximal domain of cellular surface receptor CD147. Inhibition of SphK1 or SphK2 through pre-treatment with specific inhibitors or RNA interference reduced uptake of N. meningitidis into hCMEC/D3 cells, as measured with Gentamicin protection assays. Released S1P induced the phospho-activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) via S1PR2 activation, whose expression was also increasing during infection. Furthermore, S1PR2 blockage had a preventive effect on bacterial invasion into hCMEC/D3 cells. On the contrary, activation of S1PR1+3 also reduced bacterial uptake, indicating an opposing regulatory role of S1PR1+3 and S1PR2 during N. meningitidis uptake. Moreover, SphK2 inhibition prevented inflammatory cytokine expression as well as release of interleukin-8 after N. meningitidis infection. Taken together, this study demonstrates the central role of S1P and its cognate receptors S1PR1-3 in the pathophysiology of meningococcal meningitis.