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Der menschliche Körper besitzt Anpassungsmechanismen, die es ihm ermöglichen, sich an verschiedene Belastungssituationen anzupassen. Es gab in letzter Zeit mehrere Hinweise darauf, dass diese Mechanismen durch die Ausschüttung von Zytokinen, bzw. Myokinen durch die betroffenen Zellen selbst ausgelöst werden. In dieser Arbeit wurden die Serumkonzentration von Myostatin, Follistatin, Follistatin-like-3, Interleukin 6, Interleukin 8 und Klotho vor und nach einer kurzen körperlichen Belastung bestimmt. Dabei konnte allerdings keine signifikante Änderung der Konzentrationen nachgewiesen werden, was die Frage aufwirft, ob mesenchymales Gewebe, insbesondere Muskelgewebe, überhaupt über einen klassischen endokrinen Sekretionsmechanismus verfügt.
Beim Multiplen Myelom handelt es sich um eine klinisch sehr heterogene Erkrankung, bei der eine genaue Prognoseabschätzung schwierig ist. In den letzten Jahrzehnten haben sich mehrere klinische, laborchemische sowie genetische Parameter als Risikofaktoren etabliert. Das Cystein-rich-Protein 61 (CYR61) ist ein Signalprotein, das bei verschiedensten Prozessen im menschlichen Körper eine Rolle spielt. Im Knochen ist CYR61 zuständig für die Angiogenese, die Proliferation und Migration mesenchymaler Stammzellen sowie für die Differenzierung von Osteoblasten und Endothelzellen. Im Zusammenhang mit dem Multiplen Myelom konnte in Studien gezeigt werden, dass CYR61 dort in signifikant höheren Konzentrationen vorliegt und hohe CYR61-Werte bei Myelom-Patienten mit einer besseren Prognose und einem längeren Überleben einherzugehen scheinen.
In der vorliegenden Dissertation, wurde die CYR61-Konzentration im peripheren Blut bei Myelom-, Osteoporose-Patienten und gesunden Probanden gemessen. Es zeigten sich signifikant höhere CYR61-Werte in der Gruppe der Myelom-Patienten im Vergleich zur Gruppe der Osteoporose-Patienten. Hohe CYR61-Konzentrationen in der Myelom-Gruppe waren assoziiert mit günstigen Prognosefaktoren wie einem Hämoglobin-Wert > 10 g/dl, einem normwertigen Serum-Albumin, einer niedrigen Laktatdehydrogenase, einer geringen Konzentration von Immunglobulinen im Serum und einer normwertigen free light chain ratio. Patienten in "complete response" oder "very good partial response" hatten signifikant höhere CYR61-Werte. Eine Therapie mit immunmodulatorischen Medikamenten ging mit höheren CYR61-Konzentrationen einher. Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren war dagegen mit niedrigeren CYR61-Werten assoziiert. In der Gruppe der Osteoporose-Patienten sowie bei den gesunden Probanden ergaben sich signifikant höhere CYR61-Konzentrationen bei fortgeschrittenem Alter.
Zusammenfassend lassen die Ergebnisse vermuten, dass eine hohe CYR61-Konzentration im Serum von Myelom-Patienten im Zusammenhang mit einer geringeren Krankheitsaktivität bzw. mit einer stattfindenden Regeneration des Knochens steht. Hohe CYR61-Werte bei Myelom-Patienten waren ausschließlich mit günstigen Risiko- und Prognosefaktoren assoziiert. Eine gesteigerte Ausschüttung von CYR61 scheint für einen anabolen Knochenstoffwechsel zu sprechen. Passend dazu zeigten sich bei Osteoporose-Patienten signifikant niedrigere CYR61-Werte. In Bezug auf die durchgeführten Therapien beim Multiplen Myelom ist ein komplexer Zusammenhang zwischen Wirkungsweise der Medikamente auf das Knochenmikromilieu und der Regulation der CYR61-Produktion anzunehmen. CYR61 sollte als sensibler Parameter angesehen werden, dessen Aussage sich mit dem Verlauf der Erkrankung und unter Berücksichtigung der durchgeführten Therapien ändern kann. Beim Einsatz von Proteasom-Inhibitoren kann CYR61 möglicherweise als Parameter für das Ansprechen der Therapie genutzt werden.
Die Arbeit zeigt, dass die Symptome der HPP sehr variabel und unterschiedlich stark auftreten können. Dies erschwert die klinische Diagnosestellung der Erkrankung. Nahezu alle Patienten berichteten von starken Knochen-, Gelenk,- und Muskelschmerzen, von Karies und Parodontose sowie von vermehrten Frakturen, die zum Teil weitere chronische Schmerzen und Wiederholungsfrakturen erzeugen. Eine deutlich verminderte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu Gleichaltrigen wurde ebenso häufig angegeben. Es konnte keine eindeutige Phänotyp - Genotyp Korrelation gefunden werden, allerdings geben die Daten einen deutlichen Hinweis, dass Patienten mit zwei Mutationen am stärksten symptomatisch betroffen sind.
Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen dominant negativen Mutationen und nicht dominant negativen Mutationen gefunden werden.
Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene, angeborene Knochen- und Systemerkrankung, welche Patienten allen Alters betrifft. Verursacht wird die Erkrankung durch Mutationen im ALPL-Gen, welches für die gewebeunspezifische Alkalische Phosphatase codiert und mit einem Funktionsverlust des Enzyms einhergeht. Die Ausprägung der klinischen Symptomatik ist sehr heterogen und reicht von milden und unspezifischen bis hin zu potenziell lebensbedrohlichen Symptomen, was die korrekte Diagnose zusätzlich erschwert und verzögert. Um das Verständnis der pädiatrischen HPP zu verbessern und die Dauer von Symptombeginn bis zur korrekten Diagnose zu verkürzen, haben wir den Verlauf der Erkrankung anhand einer retrospektiven Aufarbeitung der Daten von 50 pädiatrischen HPP Patienten, die in den letzten 25 Jahren an der Universitäts-Kinderklinik in Würzburg vorstellig waren, untersucht.
Diese Ergebnisse bestätigen den klinischen Eindruck der HPP als chronische Systemerkrankung, welche aufgrund ihrer unspezifischen klinischen Präsentation oftmals nur mit zeitlicher Verzögerung diagnostiziert wird. Dieser Verzögerung kommt insbesondere im Hinblick auf die 2015 zur Behandlung der pädiatrischen HPP zugelassenen Enzymersatztherapie mit dem Wirkstoff Asfotase alfa eine besondere Bedeutung zu, da die Patienten von einer frühzeitigen Diagnose und einem damit einhergehenden frühzeitigen Beginn der Behandlung profitieren können.
Diese Ergebnisse tragen einen Teil dazu bei, das Bewusstsein und die Kenntnis der Erkrankung zu verbessern, um so die die Zeitspanne zwischen Symptombeginn und Diagnosestellung zu verkürzen und die medizinische Versorgung der Patienten zu verbessern.
Osteozyten stehen vermehrt im Fokus als wesentliche Regulatoren der Knochenmineralisierung. Das ähnlich einem neuronalen Netzwerk aufgebaute lakunokanalikuläre Netzwerk der Osteozyten breitet sich im Knochen in drei Ebenen aus. Es wurde in dieser Arbeit ein 3D-Kollagengel-Modell verwendet und dort die Osteoblasten- bzw. Osteozytenzelllinien MLO-A5 und MLO-Y4, sowie humane mesenchymale Stammzellen aus Hüftköpfen eingebettet. Es wurden die optimalen Kulturbedingungen entwickelt und die Zellen über mehrere Wochen kultiviert, beobachtet und mit dem herkömmlichen 2D-Kulturmodell verglichen. MLO-A5 und MLO-Y4 bilden die zelltypischen Zellfortsätze. Die Gele kontrahieren, wenn hMSC und MLO-A5 eingebettet sind, mit MLO-Y4 zeigt sich über den gesamten Kultivierungszeitraum keinerlei Kontraktion der Kollagengele. Die Zellen wurden zudem osteogen differenziert und mit FGF23 und Klotho stimuliert. Es ergaben sich erste Hinweise auf eine FGF23 / Klotho-abhängige Inhibierung der lokalen Mineralisierung in osteogen differenzierten MLO-A5.
Es konnten einige osteogene Marker durch PCR und in den histologischen Schnitten mittels Antikörperfärbungen nachgewiesen werden, eindeutige Expressionsmuster und deren zeitliche Verläufe im Vergleich der osteogenen Differenzierungen und Zugabe von FGF23 und Klotho sind allerdings noch nicht identifizierbar und bedürfen womöglich höherer Fallzahlen und weiterer Untersuchungsmethoden. Insgesamt gesehen erweist sich das System aber als einfach und mit niederschwellig erreichbaren Methoden und Materialien durchzuführen.
Die Diagnose der Osteoporose stützt sich auch heute noch auf die radiologische Messung der Knochendichte (National Institutes of Health, 2000, National Osteoporosis Foundation, 2013, Dachverband Osteologie e. V., 2009a). Seine klinische Wertigkeit erreicht aber auch dieses Verfahren nur in gemeinsamer Betrachtung mit anderen klinischen Risikofaktoren. Mit dieser Methode ist es möglich Frakturrisiken abzuschätzen, die aktuelle Knochendichte zu bestimmen und Therapieverläufe zu dokumentieren. Radiologisch werden diese Veränderungen jedoch erst nach 12 bis 24 Monaten sichtbar (Delmas et al., 2000). Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Bestätigung der Tatsache, dass ein relevanter Anteil von Frakturen sich bereits bei PatientInnen mit Osteopenie oder sogar mit normaler Knochendichte ereignet, was sowohl für Frauen als auch für Männer gilt. Pathologische Knochendichteveränderungen finden sich jedoch nicht nur bei Osteoporose, sondern auch bei Erkrankungen wie beispielsweise Hyper- und Hypoparathyreoidismus, Hypophosphatasie, TIO, Rachitis und Morbus Paget.
Ziel dieser Arbeit war zunächst die Erstellung einer Datenbank aus vorliegenden Serumproben und die Analyse statistischer Zusammenhänge zwischen den ermittelten Parametern. Es konnten für Osteoporosen typische signifikante Zusammenhänge zwischen dem Alter und den T-Werten an Wirbelsäule und Hüfte ermittelt werden. Durch veränderte PTH-, AP- und 25(OH)-Vitamin D3-Konzentrationen kann erhöhter Knochenumbau erkannt werden (Jakob, 2007). In dieser Arbeit errechnete signifikante Zusammenhänge wie beispielsweise zwischen AP und NTx deuten auf erhöhten Knochenumbau hin, wodurch Rückschlüsse auf Erkrankungen wie beispielsweise Morbus Paget oder Knochenmetastasen gezogen werden können. Diese und andere Ergebnisse dieser Arbeit erscheinen für das Kollektiv einer osteoporotischen Spezialsprechstunde schlüssig. Der hier ermittelte Prozentsatz pathologischer Laborwerte im Gesamtkollektiv beweist auch, dass es sinnvoll und ökonomisch ist, bei entsprechend osteologischer Fragestellung die betreffenden Parameter zu untersuchen, da sich sehr häufig relevante differentialdiagnostische Fragestellungen ergeben.
In weiterführenden Untersuchungen soll auf diese Datenbank zurückgegriffen und Serumkollektive extrahiert bzw. analysiert werden. Diese können anschließend für genauere Untersuchungen (ELISA) auf weitere Parameter verwendet werden, um Zusammenhänge zwischen knochenrelevanten Parametern und Knochenerkrankungen darzustellen.
Um dies jedoch zu belegen, sind zusätzliche Untersuchungen mit weiteren Knochenmarkern wie OC, CTX, BAP in ähnlichen Kollektiven nötig. Es sollten hierfür zudem Serumproben und Knochendichtemessungen über längere Zeiträume (idealerweise zehn Jahre) analysiert werden, um möglichst genaue Ergebnisse zu erhalten und um mögliche Fremdeinflüsse erkennen zu können (Delmas et al., 2000). Zukünftig wäre es mit dieser Methode möglich, frühzeitig sensitives Risikoassessment zu betreiben, pathologische Knochenveränderungen und deren Ursachen zu diagnostizieren und vor Auftreten klinischer Symptome gezielt präventive Therapiemaßnahmen einzuleiten.
Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden.
DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden.
In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss mesenchymaler Stammzellen (MSC) auf verschiedene T-Zellsubpopulationen in vitro untersucht. Dazu wurden Naive- und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen aus humanen PBMCs von gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmun-Arthritis bei rheumatischen Erkrankungen isoliert und im Beisein/in Abwesenheit von MSCs unter Th-17-polarisierenden Bedingungen kultiviert. Nach einer 6 Tage umfassenden Inkubationszeit erfolgte die flowzytometrische Bestimmung des Phänotyps, der Proliferation, der Apoptose, des Zytokinprofils und der Chemokinrezeptorexpression Naiver und Nicht-Naiver-CD4+ T-Zellen im Beisein/in Abwesenheit von MSCs. Die Phänotypen wurden als CD45RA+CD27+ Naive-, CD45RA-CD27+ Gedächtnis-, CD45RA- CD27- Effektor- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen definiert und ihre jeweiligen prozentualen Anteile an allen CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach Beurteilung der Proliferation und Apoptose, erfolgte die Analyse der IFNγ-, IL-17-, IL-9- und IL-13-Produktion für jeden der vier Phänotypen. Zusätzlich wurde der prozentuale Anteil an FoxP3+CD25+CD127- Tregs und deren IL-10-Produktion bestimmt. Abschließend erfolgte die Messung der CCR5-, CCR6- und CXCR3- Expression. Insgesamt konnte sowohl in der Naiven CD4+- als auch in der Nicht-Naiven CD4+ T- Zellfraktion eine Hemmung der Proliferation und Apoptose CD4+ T-Zellen durch MSCs gemessen werden. Zudem supprimierten MSCs die Produktion der Zytokine IFNγ, IL-17, IL-9 und IL-10 und steigerten teilweise die Produktion von antiinflammatorischem IL-13. In den vier untersuchten Phänotypen verhielt sich die Zytokinproduktion variabel und war bei CD45RA-CD27+ Gedächtnis- und CD45RA-CD27- Effektor-Zellen am größten. Der hemmende Einfluss der MSCs war auf diese beiden Phänotypen ebenfalls am stärksten ausgeprägt. CD45RA+CD27+ Naive- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen produzierten in Kultur mit MSCs mitunter vermehrt proinflammatorische Zytokine. Analog zur Proliferation und Apoptose verminderten MSCs die Expression von CCR5, CCR6 und CXCR3 auf CD4+ T-Zellen. Die beschriebenen Effekte der MSCs konnten sowohl bei gesunden Probanden, als auch bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen nachgewiesen werden. Durch die Verwendung eines Transwell®-Systems konnte gezeigt werden, dass MSCs ihre Wirkung auf T-Lymphozyten nicht nur durch direkten Zell-Zell-Kontakt, sondern auch über lösliche Faktoren ausüben. Die Resultate dieser Arbeit verdeutlichen den immunsuppressiven Charakter der MSCs auf Naive und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen unter Th17-polarisierenden Bedingungen in vitro. Jedoch zeigt die Analyse der Zytokinproduktion in den untersuchten T-Zell-Phänotypen, dass MSCs neben ihrer immunsuppressiven Eigenschaft die Zytokinantwort einzelner T-Zellphänotypen steigern können. MSCs scheinen daher am ehesten eine immunmodulatorische Rolle zu spielen, indem sie übersteigerte Immunreaktionen herabsetzen und bei Bedarf immunstimulierend wirken.
Osteoporose wird definiert als erworbene, generalisierte Skeletterkrankung, die durch eine verminderte Knochenfestigkeit und einen pathologischen Knochenverlust charakterisiert wird. Durch die Störung der Mikroarchitektur kommt es zu strukturellen und funktionellen Defiziten im Sinne von Fragilitätsfrakturen. Mechanische Stimulation erhält die Gewebemasse und stimuliert deren kontinuierliche Anpassung. Östrogene spielen bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Regeneration des Knochens eine bedeutende Rolle und wirken über Bindung an die Östrogenrezeptoren ER und ER in bestimmten Zielgeweben. Östrogenrezeptoren sind unverändert sehr geeignete Targets für die Entwicklung von Medikamenten im Rahmen der Osteoporosetherapie wie z.B. die selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs). Die molekulare Klärung der Einflüsse von ER und ER ist unverändert von großer klinischer Bedeutung. Die Herstellung stabiler Zelllinien mit Überexpression von Reportergenkonstrukten und Rezeptoren kann dabei hilfreich sein. In dieser Arbeit wurde eine stabile Zelllinie mit Überexpression von ERβ etabliert, die unterschiedliche Wirkung von ER und ER wurden analysiert und die Effekte von zyklischer Dehnung auf Reportergenexpression unter der Kontrolle von mechanosensitiven responsiven Elementen wurden charakterisiert.
Technische Neuerungen und steigende Ansprüche an die Gesundheit stellen die moderne Medizin immer wieder vor neue Herausforderungen und führen zur Entwicklung von neuen Therapiekonzepten wie dem Tissue Engineering. Vielfach kommen dabei adulte pluripotente Stammzellen zum Einsatz. Bei der Regeneration mesenchymalen Gewebes wie Knochen, Knorpel und Muskulatur leisten Mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen entscheidenden Beitrag. Diese lassen sich aus allen mesenchymalen Geweben des Körpers gewinnen und stellen daher zwar keine homogene Zellpopulation dar, doch sie lassen sich aufgrund phänotypischer und molekularbiologischer Gemeinsamkeiten charakterisieren.
In großer Zahl lassen sich MSCs aus dem Knochenmark gewinnen und werden als stromale MSCs bzw. mhMSCs (marrow-derived human MSCs) bezeichnet. Auf der Suche nach homogenen Subpopulationen von MSCs wurde in dieser Arbeit eine Zellpopulation aus Knochentrabekeln gewonnen, sogenannte bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), und anhand ihrer Genexpression mit mhMSCs verglichen. Dafür wurde RNA aus beiden Populationen in einem Microarray mit anschließender SAM (significance analysis of microarrays) analysiert um unterschiedliche Expressionsmuster zwischen mhMSCs und bhMSCs aufzuzeigen. Diese Ergebnisse wurden durch konventionelle Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) bestätigt, wobei das Augenmerk vor allem auf solche Gene gerichtet wurde, die differentiell exprimiert waren und zudem als Markergene ein Differenzierungspotential in bestimmte Gewebe wie Muskel und Knochen vorhersagen. Dabei konnte sowohl eine gute Übereinstimmung zwischen Microarray und RT-PCR demonstriert als auch die Hoffnung auf eine homogene (trabekuläre) MSC-Population mit anderen Differenzierungseigenschaften geweckt werden.
Im Verlauf weitergehender Untersuchungen der SAM fiel eine unerklärlich hohe Expression von Immunglobulinketten in der mhMSC-Kultur (Passage 0) auf, die letztlich auf eine Kontamination der Zellkultur mit Plasmazellen schließen ließ.
Da die Ergebnisse des Microarrays (Passage 0 Kultur) somit zu hinterfragen waren, wurde die Kontamination der Plasmazellen durch Passagieren der mhMSC-Zellkultur (Passage 1) beseitigt und erneut ein Microarray mit SAM durchgeführt. Dabei relativierten sich fast alle Expressionsunterschiede, die somit auf die Kontamination der Plasmazellen zurückgeführt werden mussten.
Einzig drei Gene (CD24, TRIB2, AHNAK) wurden in diesem zweiten Array differentiell exprimiert, was sich bei CD24 und TRIB2 auch durch RT-PCR untermauern ließ.
Es lässt sich also schlussfolgern, dass bhMSCs wahrscheinlich in der Zukunft des Tissue Engineering keinen Stellenwert haben werden, zumal ihre Gewinnung im Vergleich zu mhMSC deutlich aufwendiger ist.