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Osteoporose wird definiert als erworbene, generalisierte Skeletterkrankung, die durch eine verminderte Knochenfestigkeit und einen pathologischen Knochenverlust charakterisiert wird. Durch die Störung der Mikroarchitektur kommt es zu strukturellen und funktionellen Defiziten im Sinne von Fragilitätsfrakturen. Mechanische Stimulation erhält die Gewebemasse und stimuliert deren kontinuierliche Anpassung. Östrogene spielen bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Regeneration des Knochens eine bedeutende Rolle und wirken über Bindung an die Östrogenrezeptoren ER und ER in bestimmten Zielgeweben. Östrogenrezeptoren sind unverändert sehr geeignete Targets für die Entwicklung von Medikamenten im Rahmen der Osteoporosetherapie wie z.B. die selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs). Die molekulare Klärung der Einflüsse von ER und ER ist unverändert von großer klinischer Bedeutung. Die Herstellung stabiler Zelllinien mit Überexpression von Reportergenkonstrukten und Rezeptoren kann dabei hilfreich sein. In dieser Arbeit wurde eine stabile Zelllinie mit Überexpression von ERβ etabliert, die unterschiedliche Wirkung von ER und ER wurden analysiert und die Effekte von zyklischer Dehnung auf Reportergenexpression unter der Kontrolle von mechanosensitiven responsiven Elementen wurden charakterisiert.
Die Arbeit stellt mögliche Einflüsse durch 1,25- Dihydroxy-Vitamin D3 (1,25-VitD3) und Retinsäure (RA) in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) sowohl während der adipogenen und osteogenen Differenzierung als auch während der Kurzzeit- und Langzeitstimulation auf das Mikromilieu dar. Die Stimulation mit 1,25-VitD3 und RA verlangsamt das Wachstumsverhalten und verändert die Zellmorphologie von hMSC. Effekte auf die Genexpression werden auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR dargestellt. Der Phänotyp als auch teilweise die Genexpression der osteogenen und adipogenen Differenzierung wird durch 1,25-VitD3 induziert und durch RA inhibiert. Zudem wird sowohl die „Mikromilieu-Zusammensetzung“ als auch das „Transkriptionssignal“ von 1,25-VitD3 und RA gegenseitig beeinflusst.
Die Enzyme TNSALP (Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase), ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1) und ANKH (Ankylosis, progressive human homolog) bilden zusammen eine zentrale Regulierungseinheit für den Pyrophosphat (PPi)-Stoffwechsel der Zelle [1, 2].
Störungen dieses genau geregelten Prozesses resultieren in schwerwiegenden Erkrankungen, wie z.B. bei der Hypophosphatasie [3]. Dieser meist autosomal rezessiv vererbten Erkrankung liegt eine durch genetische Mutationen beeinträchtigte Funktion der TNSALP zugrunde, wodurch sich die PPi- Konzentration im Microenvironment der Zelle erhöht. Diese kann im Knochengewebe zu schweren Mineralisierungsstörungen führen [1, 2].
Andere Krankheiten, mit erniedrigten PPi- Konzentrationen, werden mit pathologischen Verkalkungen in verschiedensten Geweben in Verbindung gebracht [4, 5]. Diese gehen unter anderem auf genetische Defekte von ENPP1 zurück[4].
Auch der Mevalonat-Pathway trägt zur Komposition des Microenvironments bezüglich der Homöostase von Phosphaten bei [6, 7]. Hier bestehen auch medizinisch relevante Einflussmöglichkeiten, zum Beispiel durch Bisphosphonate, bei der sogenannten Volkskrankheit Osteoporose.
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer PPi-Belastung auf die in vitro Mineralisierung von Mesenchymalen Stammzellen untersucht, wobei Modulatoren der Enzymaktivität für ALP und ENPP1 und der Aktivität des PPi-Kanals ANKH sowie des Mevalonatstoffwechsels zum Einsatz kamen (PPi, Pyridoxalphosphat (PLP), Probenecid, Vitamin D, PPADS (Pyridoxalphosphat-6-azophenyl-2‘,4‘-disulfid Säure) und ß-γmeATP (ß-γ Methylentriphosphat)).
Die Resultate zeigen, dass die Modulation der PPi-Konzentration bei der osteogenen Differenzierung von hMSCs in vitro keine eindeutigen Effekte bewirkt. Geringe Änderungen des Genexpressionsmusters sind letztlich nicht auszuschliessen, blieben jedoch aufgrund der hohen Spendervariabilität durch eine erhöhte Anzahl von Experimenten zu beweisen.
Diese Arbeit zeigt insgesamt eine unerwartet geringe Auswirkung einer exogenen und endogenen Modulation der PPi-Konzentration sowohl mit Blick auf die rein physikalischen Phänomene der Mineralisierung, als auch mit Blick auf die untersuchte Genregulation der wichtigsten beteiligten Proteine, was möglicherweise die hohe Kompensationskapazität der Systeme unter physiologischen Bedingungen reflektiert. Untersuchungen auf proteomischer Ebene, besonders mit Blick auf die Prozessierung von Polypeptiden mit Mineralisierungs-modulierender Wirkung würden möglicherweise genaueren Einblick vermitteln.
Eine genauere Untersuchung der Einflüsse von ENPP1 erscheint für die Zukunft vielversprechend. Allerdings treten hier, besonders auch durch die verwendeten Hemmstoffe der ENPP1, die Phänomene der Vernetzung des Stoffwechsels der Phosphate (inklusive ATP und seiner Metabolite) mit dem Purinergen Signalling deutlich zutage. Diese Vernetzung generiert durch ihre Komplexität sowohl klinisch als auch zellbiologisch/biochemisch erhebliche Interpretationsprobleme, die zukünftige Arbeiten auflösen müssen. Dabei sollte besondere Aufmerksamkeit auf zwei für HPP-PatientInnen klinisch in Zukunft potentiell bedeutsame Ergebnisse gelegt werden, die möglicherweise ungünstigen Auswirkungen einer Therapie mit Probenecid auf die ALPL Expression und die Steigerung der ALPL Expression unter Hemmstoffen des Enzyms ENPP1.
1. Dympna Harmey, L.H., Sonoko Narisawa, Kirsten A. Johnson, Robert Terkeltaub, José Luis Millán, Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and osteopontin by Akp2, Enpp1 and Ank. American Journal of Pathology, 2003. 164, No. 4: p. 1199-1209.
2. Manisha C Yadav, A.M.S.S., Sonoko Narisawa, Carmen Huesa, Marc D McKee, Colin Farquharson, José Luis Millán, Loss of Skeletal Mineralization by the Simultaneous Ablation of PHOSPHO1 and Alkaline Phosphatase Function: A Unified Model of the Mechanisms od Initiation of Skeletal Calcification. Journal of Bone and Mineral Research, 2011. 26, No2: p. 286-297.
3. Beck, C., Hypophosphatasia. Klin Padiatr, 2009: p. 219-226.
4. Harmey, D.e.a., Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and Osteopontin by Akp2, Enpp1, and Ank. American Journal of Pathology, 2004. 164: p. 1199-1209.
5. Peter Nürnberg, H.T., David Chandler et all, Heterozygous mutations in ANKH, the human ortholog of the mouse progressive ankylosis gene, result in craniometaphyseal dysplasia. Nature Genetics, May 2001. 28: p. 37-41.
6. Löffler, P., Heinrich, ed. Biochemie & Pathobiochemie. Vol. 8. 2007, Springer Verlag.
7. Joseph L. Goldstein, M.S.B., Regulation of the mevalonate Pathway. Nature Genetics, 1990. 343: p. 425-430.