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- Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendpsychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie (1)
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- Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin und Schmerztherapie des Universitätsklinikums Würzburg (1)
- Neurologische Klinik, Universitätsklinikum Würzburg (1)
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- Zentrum für Interdisziplinäre Medizin der Uni Würzburg (1)
Plexus injury often occurs after motor vehicle accidents and results in lifelong disability with severe neuropathic pain. Surgical treatment can partially restore motor functions, but sensory loss and neuropathic pain persist. Regenerative medicine concepts, such as cell replacement therapies for restoring dorsal root ganglia (DRG) function, set high expectations. However, up to now, it is unclear which DRG cell types are affected by nerve injury and can be targeted in regenerative medicine approaches.
This study followed the hypothesis that satellite glial cells (SGCs) might be a suitable endogenous cell source for regenerative medicine concepts in the DRG. SGCs originate from the same neural crest-derived cell lineage as sensory neurons, making them attractive for neural repair strategies in the peripheral nervous system. Our hypothesis was investigated on three levels of experimentation. First, we asked whether adult SGCs have the potential of sensory neuron precursors and can be reprogrammed into sensory neurons in vitro. We found that adult mouse DRG harbor SGC-like cells that can still dedifferentiate into progenitor-like cells. Surprisingly, expression of the early developmental transcription factors Neurog1 and Neurog2 was sufficient to induce neuronal and glial cell phenotypes. In the presence of nerve growth factor, induced neurons developed a nociceptor-like phenotype expressing functional nociceptor markers, such as the ion channels TrpA1, TrpV1 and NaV1.9. In a second set of experiments, we used a rat model for peripheral nerve injury to look for changes in the DRG cell composition. Using an unbiased deep learning-based approach for cell analysis, we found that cellular plasticity responses after nerve injury activate SGCs in the whole DRG. However, neither injury-induced neuronal death nor gliosis was observed. Finally, we asked whether a severe nerve injury changed the cell composition in the human DRG. For this, a cohort of 13 patients with brachial plexus injury was investigated. Surprisingly, in about half of all patients, the injury-affected DRG showed no characteristic DRG tissue. The complete entity of neurons, satellite cells, and axons was lost and fully replaced by mesodermal/connective tissue. In the other half of the patients, the basic cellular entity of the DRG was well preserved. Objective deep learning-based analysis of large-scale bioimages of the “intact” DRG showed no loss of neurons and no signs of gliosis.
This study suggests that concepts for regenerative medicine for restoring DRG function need at least two translational research directions: reafferentation of existing DRG units or full replacement of the entire multicellular DRG structure. For DRG replacement, SGCs of the adult DRG are an attractive endogenous cell source, as the multicellular DRG units could possibly be rebuilt by transdifferentiating neural crest-derived sensory progenitor cells into peripheral sensory neurons and glial cells using Neurog1 and Neurog2.
In my thesis, I characterized aGPCRs Adgrl1 and Adgrl3, tight junction proteins and the blood-DRG-barrier in rats’ lumbar dorsal root ganglions after traumatic neuropathy. In contrast to the otherwise tightly sealed barriers shielding neural tissues, the dorsal root ganglion’s neuron rich region is highly permeable in its healthy state. Furthermore, the DRG is a source of ectopic signal generation during neuropathy; the exact origin of which is still unclear. I documented expression of Adgrl1 and Adgrl3 in NF200 + , CGRP + and IB4 + neurons. One week after CCI, I observed transient downregulation of Adgrl1 in non-peptidergic nociceptors (IB4+). In the context of previous data, dCirl deletion causing an allodynia-like state in Drosophila, our research hints to a possible role of Adgrl1 nociceptive signal processing and pain resolution in neuropathy. Furthermore, I demonstrated similar claudin-1, claudin-12, claudin-19, and ZO-1 expression of the dorsal root ganglion’s neuron rich and fibre rich region. Claudin-5 expression in vessels of the neuron rich region was lower compared to the fibre rich region. Claudin-5 expression was decreased one week after nerve injury in vessels of the neuron rich region while permeability for small and large injected molecules remained unchanged. Nevertheless, we detected more CD68+ cells in the neuron rich region one week after CCI. As clinically relevant conclusion, we verified the high permeability of the neuron rich regions barrier as well as a vessel specific claudin-5 downregulation after CCI. We observed increased macrophage invasion into the neuron rich region after CCI. Furthermore, we identified aGPCR as potential target for further research and possible treatments for neuropathy, which should be easily accessible due to the blood-DRG-barriers leaky nature. Its precise function in peripheral tissues, its mechanisms of activation, and its role in pain resolution should be evaluated further.
Die wichtigsten Barrieren des peripheren Nerven sind die Myelin-Barriere und die Blut-Nerven-Schranke. Sie übernehmen eine bedeutende Aufgabe beim Schutz des Nerven vor externen Einflüssen, dem Bewahren der nervalen Homöostase und der Aufrechterhaltung der Nervenleitungsgeschwindigkeit. Eine Öffnung der peripheren Barriere wird oft mit neuropathischen Schmerzen assoziiert. Im Rahmen dieser Dissertation habe ich mittels Immunfluoreszenzfärbung, Permeabilitätstest, Western Blot und Polymerase-Kettenreaktion die Barrierefunktion des peripheren Nervensystems bei weiblichen Cldn12-KO Mäusen untersucht. Sowohl bei den WT Mäusen als auch bei den Cldn12-KO Mäusen konnte eine intakte Barrierefunktion des peripheren Nerven nachgewiesen werden.
Charcot-Marie-Tooth Neuropathien sind die häufigsten hereditären Erkrankungen des peripheren Nervensystems und dennoch bis heute nicht therapierbar. Die Lebensqualität der Patienten ist durch motorische und sensorische Defizite der Extremitäten häufig stark eingeschränkt. Ursache können unter anderem Mutationen in Schwann-Zellen sein, die zu dem typischen Bild von Demyelinisierung und axonalem Schaden führen. In den letzten Jahren konnte in Mausmodellen das Immunsystem als wichtiger Mediator in der Pathogenese der CMT 1 Subtypen A, B und X identifiziert werden. Insbesondere Makrophagen spielen eine tragende Rolle bei dem Verlust der axonalen Integrität, bei der Schädigung der Myelinscheiden, sowie bei der Dedifferenzierung von Schwann-Zellen. Entscheidender Faktor für Proliferation und Aktivierung der Makrophagen ist hierbei das Zytokin CSF-1, dessen korrespondierender Rezeptor auf Makrophagen exprimiert wird. Der CSF-1/CSF1R Signalweg bietet somit einen vielversprechenden Angriffspunkt.
In der vorliegenden Arbeit wurden Mausmodelle der CMT 1 Subtypen A, B und X mit einem niedermolekularen CSF-1-Rezeptor Inhibitor behandelt. Anschließend erfolgte eine funktionelle und strukturelle Auswertung der peripheren Nerven.
Das beste Ansprechen auf die Therapie zeigten Cx32def Mutanten. Strukturell fielen ein verringerter axonaler Schaden und eine verbesserte axonale Regenerationsfähigkeit sowie erhaltene neuromuskuläre Synapsen auf. Funktionell äußerte sich dies in verbesserten elektrophysiologischen Parametern und einem Krafterhalt, welcher als klinischer Parameter die größte Relevanz für betroffene Patienten hat und somit besonders hervorzuheben ist.
Auch P0het Mutanten zeigten Verbesserungen nach der CSF1RI Behandlung. Anders als bei Cx32def Tieren zeigte sich hier jedoch vor allem ein Erhalt der Myelinintegrität. Weiterhin wirkte sich die Therapie positiv auf elektrophysiologische Parameter und Krafttests aus. Vor allem besonders stark betroffene Individuen schienen hierbei von der CSF1RI Behandlung zu profitieren.
Bei PMP22tg Mutanten hingegen konnten keine positiven Effekte der CSF1RI Behandlung nachgewiesen werden. Strukturelle und funktionelle Parameter behandelter Tiere unterschieden sich nicht von unbehandelten.
Diese Ergebnisse unterstreichen die Relevanz der sekundären Entzündungsreaktion in CMT 1 Neuropathien als wichtigen Mediator in der Pathogenese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Intervention im CSF-1/CSF1R Signalweg einen vielversprechenden möglichen Ansatz für die Therapie der bisher nicht behandelbaren CMT 1 Subypen X und B darstellt. Unausweichlich ist hierbei ein möglichst früher Therapiestart vor Ausprägung der ersten molekularen und histologischen Veränderungen. Im Hinblick auf die nicht die Lebenserwartung reduzierende Erkrankung muss ferner eine Minimierung der Nebenwirkungen der Therapie gewährleistet sein. Besonders hervorzuheben ist hier die Verwendung eines Inhibitors, welcher nicht in das zentrale Nervensystem vordringen kann und somit die Funktion der Mikroglia nicht beeinträchtigt.
Autoantikörper gegen nodo-paranodale Proteine des Ranvier’schen Schnürrings wie
Neurofascin-155 (NF-155), Contactin-1 und Caspr wurden in der Literatur bei
Patienten/Patientinnen mit Immunneuropathien beschrieben. Bei zwei bis zehn Prozent
der Patienten/Patientinnen mit Immunneuropathien können Autoantikörper gegen
Isoformen des Neurofascin detektiert werden. Patienten/Patientinnen mit
Autoantikörpern gegen NF-155 weisen gemeinsame klinische Merkmale auf, unter
anderem einen schweren Verlauf mit subakutem Beginn, vorwiegend motorischen
Defiziten, Tremor und einem schlechten Ansprechen auf eine Therapie mit intravenösen
Immunglobulinen (IVIG). Ein Grund für Letzteres könnte sein, dass es sich überwiegend
um Autoantikörper der Subklasse IgG4 handelt, die als anti-inflammatorisch gelten und
kein Komplement aktivieren. Neben der IgG4-Subklasse können bei manchen
Erkrankten auch die proinflammatorischen IgG-Subklassen 1 bis 3 nachgewiesen
werden. Bei der Anti-Pan-Neurofascin (155/140/186) Polyneuropathie zeigt sich klinisch
häufig ein fulminanter Phänotyp mit IgG3 Prädominanz. Das Ziel dieser Studie war, die
Autoantikörper-induzierte Komplementablagerung zu detektieren, sowie die Rolle der
IgG Subklasse und die Effekte von IVIG auf Antikörperbindung, Komplementaktivierung
und Effektorfunktionen zu untersuchen.
Hierzu wurde das Serum von 212 Probanden/-innen mit der Verdachtsdiagnose einer
entzündlichen Neuropathie auf Autoantikörper gegen NF-155 mittels ELISA und
Bindungsversuchen an Mäusezupfnerven gescreent. Im Fall eines positiven
Ergebnisses dienten zellbasierte Bindungsversuche mit NF-155-transfizierten HEK-293-
Zellen als Bestätigungstest. Die Effekte unterschiedlicher IVIG Konzentrationen auf die
Antikörperbindung und Komplementablagerung wurden in ELISA,
Komplementbindungsassays und zellbasierten Verfahren getestet. Außerdem wurde
mithilfe von LDH-Zytotoxizitätsmessungen die Komplement-induzierte Zelllyse sowie die
Effekte von IVIG untersucht. Klinische Daten wurden retrospektiv ausgewertet.
Fünf Patienten/Patientinnen mit hohen Autoantikörpertitern gegen NF-155 und ein
Patient mit Anti-Pan-Neurofascin Autoantikörpern konnten in der Studie detektiert
werden. Der Patient mit Autoantikörpern gegen alle drei Isoformen des Neurofascins und
IgG3-Prädominanz zeigte die deutlichste Komplementablagerung. Bei drei
Patienten/Patientinnen, die IgG1, IgG2 und IgG4 aufwiesen, war eine Aktivierung des
Komplementsystems zu beobachten, während bei zwei Patienten mit prädominanter
IgG4-Antikörpersubklasse keine Komplementablagerung nachweisbar war. Bei
Letzteren war eine Therapie mit IVIG in der Vorgeschichte erfolglos, während es bei zwei
der Patienten/Patientinnen mit anderen IgG-Subklassen und Komplementbindung unter
IVIG Therapie zu einer mäßigen bis deutlichen Symptombesserung in der Akutphase
kam. Eine Koinkubation mit IVIG führte in den ELISA basierten und zellbasierten
Versuchen zu keinem Effekt auf die Autoantikörperbindung an das Zielantigen, jedoch
zu einer deutlichen Reduktion der Antikörper-vermittelten Komplementbindung. Diese
Reduktion war sowohl bei Koinkuabtion von IVIG mit dem Komplementfaktor C1q als
auch bei Präinkubation von IVIG vor C1q Gabe zu sehen. Bei zwei der
Patienten/Patientinnen mit hohen Komplementablagerungen konnte eine erhöhte
Zytotoxizität nachgewiesen werden, welche bei Zugabe von IVIG verringert wurde.
Schlussfolgernd ist die Autoantikörper-induzierte Komplementablagerung abhängig von
der prädominanten IgG Subklasse. IVIG führt zu einer deutlichen,
konzentrationsabhängigen Reduktion der Komplementablagerung, sowie möglicher
zytotoxischer Effektorfunktionen wie die Zytolyse myelinisierter Schwannzellen oder
Nervenaxonen. Darüber hinaus könnte die Subklassenanalyse von Erkrankten das
Therapieansprechen auf IVIG vorhersagen und sollte daher eine wichtige Rolle in der
Diagnostik der Nodo-Paranodopathie spielen. IVIG sowie andere über das
Komplementsystem wirkende Therapeutika können in der Behandlung der schwer
betroffenen Patienten/Patientinnen, insbesondere bei Anti-Pan-Neurofascin positiver
Neuropathie, in Betracht gezogen werden.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.
Hintergrund: Patienten, die einen Herz-Kreislaufstillstand erleiden haben eine geringere Überlebensrate wenn Reanimationsmaßnahmen nicht suffizient durchgeführt werden. Innerhalb einer Klinik sind die Ersthelfer meistens Mitarbeiter der Pflege, die nur über geringe Kenntnisse in der Herzrhythmusanalyse verfügen. In solchen Fällen kann ein Automatischer Externer Defibrillator (AED) hilfreich sein um die Durchführung der Reanimationsmaßnahmen zu verbessern. Aus diesem Grund wurde im Jahr 2007 das AED-Programm am Universitätsklinikum Würzburg (Deutschland) eingeführt.
Ziel dieser Studie war die Auswirkungen der Automatischen Externen Defibrillatoren auf die innerklinischen Herz-Kreislaufstillstände und die Reanimationsmaßnahmen zu untersuchen.
Methodik: Die Datenerfassung erfolgte im Rahmen von Qualitätssicherungsmaßnahmen am Universitätsklinikum Würzburg. Daten zur Thoraxkompressionstiefe (CCD), Thoraxkompressionsfrequenz (CCR) und zur No-Flow-Fraktion (NFF), zum Zeitintervall vom Einschalten des AED bis zur ersten Thoraxkompression (TtC), zum Zeitintervall vom Einschalten des AED bis zur ersten Schockabgabe (TtS) und zum Zeitintervall nach Schockabgabe bis zum Beginn der Thoraxkompression (TtCS) wurden mit Hilfe der aufgezeichneten Daten des AED ausgewertet. Ein Fragebogen wurde von den Ersthelfern ausgefüllt.
Ergebnisse: Zwischen 2010 und 2012 wurden insgesamt 359 innerklinische Notrufe registriert. Davon waren 53 Herz-Kreislaufstillstände mit Gebrauch eines AED, in 46 Fällen waren vollständige Datensätze vorhanden. Die mittlere CCD lag bei 5,5 +/- 1 cm, die mittlere CCR betrug 107 +/- 11/min. Die NFF lag bei 41%.
Die TtC lag bei 34 (32-52) Sekunden (Median und IQR), die TtS betrug 30 (28-32) Sekunden (Median und IQR) und die TtCS lag bei 4 (3-6) Sekunden (Median und IQR).
21 Patienten (45%) erreichten einen ROSC, 8 Patienten (17%) verstarben vor Ort und 17 Patienten (37%) wurden unter laufender Reanimation auf eine Intensivstation (ITS) verlegt.
Zusammenfassung: Sowohl die TtC als auch die TtS verdeutlichen die durch den Anwender verursachte Zeitverzögerung. Diese Zeitintervalle können erheblich verkürzt werden sofern der Anwender die Sprachanweisungen des AED unterbricht und die Paddles direkt auf dem Thorax des Patienten anbringt. Der AED schaltet unmittelbar in den Analysemodus.
Häufige Schulungen der Mitarbeiter und regelmäßig angepasste Schulungsinhalte sind notwendig um den Umgang mit dem AED und somit die Reanimationsmaßnahmen zu verbessern.
Neuropathische Schmerzen treten in der klinischen Praxis häufig auf und
beeinträchtigen in hohem Maße die Lebensqualität der Patienten. Bedingt durch eine
Schädigung somatosensorischer Nervenstrukturen im peripheren oder zentralen
Nervensystem ist der Schmerz meist durch eine Allodynie, Hyperalgesie oder
einschießende Schmerzen charakterisiert. Diese Symptome lassen sich durch
gängige Schmerzmittel kaum lindern. In jüngerer Zeit rückte die Blut-Rückenmarkschranke immer mehr in den Fokus verschiedener Untersuchungen, da auch
einige nicht-schmerzhafte Erkrankungen (z.B. Multiple Sklerose und Amyotrophe
Lateralsklerose) zur Veränderung dieser Barriere mit folgender Permeabilitätserhöhung
durch reduzierte Tight Junction-Protein-Expression führen. Die Blut-
Rückenmarkschranke dichtet Gefäße des Rückenmarks ab und verhindert das
Eindringen toxischer oder proanalgetischer Mediatoren in das zentrale Nervensystem.
Dafür ist die Funktion der Tight Junction-Proteine zur Aufrechterhaltung dieser Barriere
essentiell. Dennoch konnte die Rolle der Blut-Rückenmarkschranke bei Neuropathie
noch nicht vollständig erörtert werden. Die Untersuchungen meiner Arbeitsgruppe
konnten bereits zeigen, dass eine lockere Ligatur des N. ischiadicus bei Ratten (CCI;
chronic constriction injury) zur Entwicklung einer thermischen und mechanischen
Hyperalgesie sowie eingeschränkten motorischen Funktionen führt. Zudem konnte
eine Störung der Blut-Rückenmarkschranke nach einer CCI nachgewiesen werden, da
es Tracern unterschiedlicher molekularer Größe möglich war das Rückenmark zu
penetrieren. Daher sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht werden, inwieweit
es zu einer Veränderung unterschiedlicher Tight Junction-Proteine nach peripherer
Nervenverletzung (CCI) kommt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine CCI zu einer
Herabregulation der mRNA-Expression von Claudin-1, Claudin-19, Tricellulin und
Occludin im Rückenmark führt, wobei diese Veränderungen insbesondere 7 und 14 d
nach der CCI auftraten. Die membranäre Expression dieser Proteine im Rückenmark
blieb bis auf Occludin unverändert, das 7 d nach der CCI signifikant reduziert war. Am
deutlichsten waren jedoch Claudin-5 und ZO-1 verändert. Folglich vermindert eine CCI
signifikant die Claudin-5-mRNA sowie die Immunreaktivität in isolierten Kapillaren des
Rückenmarks. Das Ankerprotein ZO-1 war sogar auf allen Ebenen, also in der Genals
auch Proteinexpression, und darüber hinaus in den Rückenmarkskapillaren
signifikant reduziert.
Die Interpretation dieser Ergebnisse legt nahe, dass ZO-1, und zum Teil auch
Claudin-5, für die gestörte Blut-Rückenmarkschranke verantwortlich sind und die
anderen untersuchten Proteine vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Die
Bedeutung der Tight Junction-Proteine in der Blut-Rückenmarkschranke konnte somit
weiter untermauert werden. In zukünftigen Untersuchungen wäre es wichtig den
Signalweg, der zur Veränderung der Tight Junction-Proteine führt sowie die
subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, um Möglichkeiten zum Wiederverschluss
der Barriere zu finden. Somit könnten Therapien zur Aufrechterhaltung der Blut-
Rückenmarkhomöostase den neuropathischen Schmerz unter Umständen kausal, und
nicht nur symptomatisch, behandelbar machen.
Differenzierte β-Arrestin2 Rekrutierung am μ-Opioid Rezeptor durch klinisch eingesetzte Opioide
(2021)
Opioide gehören zu den potentesten Analgetika für die Behandlung akuter und chronischer Schmerzen, werden jedoch in ihrer Anwendung durch analgetische Toleranz aber auch Nebenwirkungen wie Abhängigkeit, Atemdepression und Obstipation limitiert. Opioid-Analgetika vermitteln dabei nahezu alle klinisch relevanten Wirkungen durch Stimulation des μ-Opioidrezeptors, einem G- Protein-gekoppelten Rezeptor. Die „klassische“ Signaltransduktion durch Aktivierung inhibitorischer Gi/0-Proteine kann durch G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) und β-Arrestine negativ reguliert werden. Zusätzlich können durch β-Arrestin-Bindung an den Rezeptor G-Protein-unabhängige Signalwege aktiviert werden. Die genauen Mechanismen wie β-Arrestin- assoziierte Rezeptordesensibilisierung, -internalisierung und G-Protein- unabhängige Signalwege an der physiologischen Antwort und insbesondere an Toleranzentwicklung und Abhängigkeit von Opioid-Analgetika beteiligt sind, können bislang nicht ausreichend erklärt werden.
In dieser Arbeit konnte in HEK293-Zellen mit Lebendzell-Konfokalmikroskopie und Luciferase-Komplementierung für 17 Opioide eine differenzierte β-Arrestin2- Rekrutierung zum μ-Opioidrezeptor gezeigt werden. Von den untersuchten Opioiden sind 13 häufig eingesetzte Opioid-Analgetika. Durch die Erstellung detaillierter pharmakologischer Profile ließen sich die Opioide bezüglich ihres β- Arrestin2-Rekrutierungsvermögens in Voll-, Partial und Antagonisten eingruppieren. Bemerkenswert war die fehlende β-Arrestin2-Rekrutierung für Buprenorphin, Tramadol und Tilidin, sodass diese interessante Substanzen für weitere Untersuchungen in physiologischerem Kontext sind. Durch Überexpression von GRK2 konnte die β-Arrestin2-Rekrutierung insbesondere für Partialagonisten gesteigert werden, was die Abhängigkeit der β-Arrestin- Rekrutierung vom GRK-Expressionslevel, das in verschiedenen Assays und Gewebetypen variieren kann, zeigt. Außerdem konnte ein heterogenes Bild der Rezeptorregulierung demonstriert werden, welches indirekt durch Endozytosehemmung unter Verwendung von Dynamin-Inhibitoren erfasst wurde. Die erhobenen Daten dienen als Anknüpfungspunkt für weiteren Arbeiten auf dem Gebiet der μ-Opioidrezeptorregulation. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen ist nötig, um sichere und nebenwirkungsärmere Opioid-Analgetika entwickeln zu können.