Refine
Has Fulltext
- yes (59)
Is part of the Bibliography
- yes (59)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (59)
Keywords
- Tissue Engineering (27)
- In vitro (4)
- Vaskularisierung (4)
- Biomaterial (3)
- Bioreaktor (3)
- Gewebekultur (3)
- Implantat (3)
- Kollagen (3)
- Mundschleimhaut (3)
- Regenerative Medizin (3)
Institute
- Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin (36)
- Graduate School of Life Sciences (32)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (5)
- Fakultät für Biologie (4)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (2)
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (1)
- Institut für Funktionsmaterialien und Biofabrikation (1)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (1)
- Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie (1)
- Klinik und Poliklinik für Thorax-, Herz- u. Thorakale Gefäßchirurgie (1)
Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline.
The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas. Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium.
The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits. Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely. Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues. When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used.
For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min. In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected. Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel. Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue.
The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application.
Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms are one of the largest socioeconomic burdens today. Although infectious diseases have been studied for decades, in numerous cases, the precise mechanisms involved in the multifaceted interaction between pathogen and host continue to be elusive. Thus, it still remains a challenge for researchers worldwide to develop novel strategies to investigate the molecular context of infectious diseases in order to devise preventive or at least anti-infective measures. One of the major drawbacks in trying to obtain in-depth knowledge of how bacterial pathogens elicit disease is the lack of suitable infection models to authentically mimic the disease progression in humans. Numerous studies rely on animal models to emulate the complex temporal interactions between host and pathogen occurring in humans. While they have greatly contributed to shed light on these interactions, they require high maintenance costs, are afflicted with ethical drawbacks, and are not always predictive for the infection outcome in human patients. Alternatively, in-vitro two-dimensional (2D) cell culture systems have served for decades as representatives of human host environments to study infectious diseases. These cell line-based models have been essential in uncovering virulence-determining factors of diverse pathogens as well as host defense mechanisms upon infection. However, they lack the morphological and cellular complexity of intact human tissues, limiting the insights than can be gained from studying host-pathogen interactions in these systems.
The focus of this thesis was to establish and innovate intestinal human cell culture models to obtain in-vitro reconstructed three-dimensional (3D) tissue that can faithfully mimic pathogenesis-determining processes of the zoonotic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni). Generally employed for reconstructive medicine, the field of tissue engineering provides excellent tools to generate organ-specific cell culture models in vitro, realistically recapitulating the distinctive architecture of human tissues. The models employed in this thesis are based on decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds of porcine intestinal origin. Reseeded with intestinal human cells, application of dynamic culture conditions promoted the formation of a highly polarized mucosal epithelium maintained by functional tight and adherens junctions. While most other in-vitro infection systems are limited to a flat monolayer, the tissue models developed in this thesis can display the characteristic 3D villi and crypt structure of human small intestine.
First, experimental conditions were established for infection of a previously developed, statically cultivated intestinal tissue model with C. jejuni. This included successful isolation of bacterial colony forming units (CFUs), measurement of epithelial barrier function, as well as immunohistochemical and histological staining techniques. In this way, it became possible to follow the number of viable bacteria during the infection process as well as their translocation over the polarized epithelium of the tissue model. Upon infection with C. jejuni, disruption of tight and adherens junctions could be observed via confocal microscopy and permeability measurements of the epithelial barrier. Moreover, C. jejuni wildtype-specific colonization and barrier disruption became apparent in addition to niche-dependent bacterial localization within the 3D microarchitecture of the tissue model. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D host environment deviated from those obtained with conventional in-vitro 2D monolayers but mimicked observations made in vivo. Furthermore, a genome-wide screen of a C. jejuni mutant library revealed significant differences for bacterial factors required or dispensable for interactions with unpolarized host cells or the highly prismatic epithelium provided by the intestinal tissue model. Elucidating the role of several previously uncharacterized factors specifically important for efficient colonization of a 3D human environment, promises to be an intriguing task for future research.
At the frontline of the defense against invading pathogens is the protective, viscoelastic mucus layer overlying mucosal surfaces along the human gastrointestinal tract (GIT). The development of a mucus-producing 3D tissue model in this thesis was a vital step towards gaining a deeper understanding of the interdependency between bacterial pathogens and host-site specific mucins. The presence of a mucus layer conferred C. jejuni wildtype-specific protection against epithelial barrier disruption by the pathogen and prevented a high bacterial burden during the course of infection. Moreover, results obtained in this thesis provide evidence in vitro that the characteristic corkscrew morphology of C. jejuni indeed grants a distinct advantage in colonizing mucous surfaces.
Overall, the results obtained within this thesis highlight the strength of the tissue models to combine crucial features of native human intestine into accessible in-vitro infection models. Translation of these systems into infection research demonstrated their ability to expose in-vivo like infection outcomes. While displaying complex organotypic architecture and highly prismatic cellular morphology, these tissue models still represent an imperfect reflection of human tissue. Future advancements towards inclusion of human primary and immune cells will strive for even more comprehensive model systems exhibiting intricate multicellular networks of in-vivo tissue. Nevertheless, the work presented in this thesis emphasizes the necessity to investigate host-pathogen interactions in infection models authentically mimicking the natural host environment, as they remain among the most vital parts in understanding and counteracting infectious diseases.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005).
Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen.
Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter
Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist
über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER)
unter 150
· cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte
von mehr als 1500
· cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die
Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick
auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial
von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier
das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der
BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann.
Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten
Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren
Bedingungen bereitzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden
in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A)
zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit
Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen
TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die
Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt
wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten
Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente
NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs
für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt.
Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren,
wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs
und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen.
Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der
neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten
die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten
Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte
von bis zu 2500
· cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter
Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für
weiterführende Studien ausgewählt.
Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin,
Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller
Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.
Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von
FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die
BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung
der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit
Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt.
Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten:
Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac
werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie
Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen
wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer
Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt.
Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen
an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke
konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen
ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening
von Medikamenten denkbar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro-
Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die
Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse,
eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen
einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt.
Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten
eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung
genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen
und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen
zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden.
Cancer remains after cardiovascular diseases the leading cause of death worldwide and an estimated 8.2 million people died of it in 2012. By 2030, 13 million cancer deaths are expected due to the growth and ageing of the population. Hereof, colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men and the second in women with a wide geographical variation across the world. Usually, CRC begins as a non-cancerous growth leading to an adenomatous polyp, or adenoma, arising from glandular cells. Since research has brought about better understanding of the mechanisms of cancer development, novel treatments such as targeted therapy have emerged in the past decades. Despite that, up to 95% of anticancer drugs tested in clinical phase I trials do not attain a market authorisation and hence these high attrition rates remain a key challenge for the pharmaceutical industry, making drug development processes enormously costly and inefficient. Therefore, new preclinical in vitro models which can predict drug responses in vivo more precisely are urgently needed. Tissue engineering not only provides the possibility of creating artificial three-dimensional (3D) in vitro tissues, such as functional organs, but also enables the investigation of drug responses in pathological tissue models, that is, in 3D cancer models which are superior to conventional two-dimensional (2D) cell cultures on petri dishes and can overcome the limitations of animal models, thereby reducing the need for preclinical in vivo models. In this thesis, novel 3D CRC models on the basis of a decellularised intestinal matrix were established. In the first part, it could be shown that the cell line SW480 exhibited different characteristics when grown in a 3D environment from those in conventional 2D culture. While the cells showed a mesenchymal phenotype in 2D culture, they displayed a more pronounced epithelial character in the 3D model. By adding stromal cells (fibroblasts), the cancer cells changed their growth pattern and built tumour-like structures together with the fibroblasts, thereby remodelling the natural mucosal structures of the scaffold. Additionally, the established 3D tumour model was used as a test system for treatment with standard chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU). The second part of the thesis focused on the establishment of a 3D in vitro test system for targeted therapy. The US Food and Drug Administration has already approved of a number of drugs for targeted therapy of specific types of cancer. For instance, the small molecule vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™) which demonstrated impressive response rates of 50–80% in melanoma patients with a mutation of the rapidly accelerated fibrosarcoma oncogene type B (BRAF) kinase which belongs to the mitogen active protein kinase (MAPK) signalling pathway. However, only 5% of CRC patients harbouring the same BRAF mutation respond to treatment with vemurafenib. An explanation for this unresponsiveness could be a feedback activation of the upstream EGFR, reactivating the MAPK pathway which sustains a proliferative signalling. To test this hypothesis, the two early passage cell lines HROC24 and HROC87, both presenting the mutation BRAF V600E but differing in other mutations, were used and their drug response to vemurafenib and/or gefitinib was assessed in conventional 2D cell culture and compared to the more advanced 3D model. Under 3D culture conditions, both cell lines showed a reduction of the proliferation rate only in the combination therapy approach. Furthermore, no significant differences between the various treatment approaches and the untreated control regarding apoptosis rate and viability for both cell lines could be found in the 3D tumour model which conferred an enhanced chemoresistance to the cancer cells. Because of the observed unresponsiveness to BRAF inhibition by vemurafenib as can be seen in the clinic for patients with BRAF mutations in CRC, the cell line HROC87 was used for further xenografting experiments and analysis of activation changes in the MAPK signalling pathway. It could be shown that the cells presented a reactivation of Akt in the 3D model when treated with both inhibitors, suggesting an escape mechanism for apoptosis which was not present in cells cultured under conventional 2D conditions. Moreover, the cells exhibited an activation of the hepatocyte growth factor receptor (HGFR, c-Met) in 2D and 3D culture, but this was not detectable in the xenograft model. This shows the limitations of in vivo models. The results suggest another feedback activation loop than that to the EGFR which might not primarily be involved in the resistance mechanism. This reflects the before mentioned high attrition rates in the preclinical drug testing.
Hintergrund
Jede Implantation alloplastischer Materialien führt durch Aktivierung der körpereigenen Immunabwehr zu einer Fremdkörperreaktion. An der Synthese der Extrazellulärmatrix und der entstehenden Kollagenkapsel sind insbesondere Makrophagen und Fibroblasten beteiligt. Diese Reaktionen können die Material-Funktionsfähigkeit abschwächen, aufheben oder zu deren operativer Entfernung zwingen.
Fragestellung und Ziele
Spinnenseide ist ein Material mit hoher Biokompatibilität. Nachdem es gelungen ist, Spinnenseide rekombinant herzustellen, soll untersucht werden, wie sich die Verträglichkeit alloplastischer Materialien durch eine Beschichtung mit biotechnologisch hergestellter Spinnenseide beeinflussen lässt.
Eine weitere Möglichkeit ist der TGF-β-Synthese-Inhibitor Halofuginon, der ebenfalls hinsichtlich seiner Potenz, die Ausbildung einer Fibrosekapsel zu vermindern, untersucht werden soll.
Methodik
Anhand von in-vitro-Untersuchungen wurden die bei der Fremdkörperreaktion beteiligten Zelltypen auf ihr Proliferationsverhalten und die Expression unterschiedlicher Genprodukte hinsichtlich bestehender Unterschiede zwischen den jeweiligen Oberflächenbeschichtungen untersucht. Es wurden immunhistochemische Färbungen zum Nachweis spezifischer Oberflächenantigene, Bestimmungen von ATP- und DNA-Gehalt als Maß für die Zellzahl, sowie molekulargenetische Untersuchungen hinsichtlich der Expression relevanter Markergene (rtPCR) durchgeführt.
Ergebnisse
Eine Beschichtung mit rekombinanter Spinnseide führt - im Vergleich zu reinen Silikonimplantaten - zu einer verzögerten und reduzierten Immunreaktion. Die EZM-Synthese und die damit verbundene fremdkörperassoziierte Fibrose werden vermindert und so die Biokompatibilität alloplastischer Materialien gesteigert.
In Deutschland erkranken jährlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa
12.000 die Diagnose „Leukämie“ gestellt bekommen [1]. Unter den Leukämien weist
die akute myeloische Leukämie (AML) die ungünstigste Prognose auf, sodass hier
erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zusätzlich schnitten viele potentielle Therapeutika,
die sich in bisherigen präklinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen
haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die
Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells als verbessertes präklinisches
System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von
Leukämien beitragen sollen.
Das 3D Blutgefäßmodell bestand aus humanen primären Endothelzellen, welche
als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix
(SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-tägiger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz
entsprechend nichtadhärente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib
oder entsprechende Kontrolllösungen beziehungsweise bimolekulare Antikörperkonstrukte
mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-tägiger Inkubation
mit Tipifarnib beziehungsweise 24-stündiger Behandlung mit Antikörperkonstrukten
wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen
mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modellüberstände ermittelt. Zum
Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde,
stellvertretend für alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-Färbung durchgeführt,
welche negativ ausfiel. Mögliche Kollateralschäden am Endothel wurden
mittels histologischen Färbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht.
In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell
äquivalente, dosisabhängige und antileukämische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen.
Bei Applikation der Antikörperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich
bei konstanten Konzentrationen der Antikörperkonstrukte im 3D Modell deutlich
höhere Apoptoseraten (58%) als im 2D Modell (38%). Stellt man Vergleiche von
Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antikörperkonstrukten an, so ließen sich
im 2D Modell ähnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38% bei
Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger
konzentrierten Antikörperkonstrukte bei kürzerer Inkubationsdauer eine noch
höhere spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58%) als 500 nM
Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40%). Bezüglich der Nebenwirkungen ließ sich
im 3D Modell nach Applikation von Antikörperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss
auf das Endothel erkennen, während Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO
versetzten Kontrolllösungen zu einer dosisabhänigen Destruktion des ursprünglichen
Endothelzellmonolayers führten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische,
Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige
onkologische Therapien dar.
Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur
konventionellen Zellkultur eine natürlichere Mikroumgebung für Zellen geschaffen
und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf
die Gefäßstrukturen untersucht werden.
Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden...
Entwicklungsaspekte eines Medizinproduktes zur Prävention und Überwachung von Hydrierungszuständen
(2018)
Der demografische Wandel und das Populationswachstum stellen eine globale Herausforderung für die Gesundheitssysteme dar. Eine vielversprechende Lösungsstrategie liegt in der digitalen Überwachung, Prävention und Therapie akuter und chronischer Erkrankungen durch die Nutzung von innovativen Technologien aus dem Bereich der personalisierten Medizin.
Die Digitalisierung in der Überwachung von Vitalparametern mittels Sensorik besitzt großes Potential für die längere Gesunderhaltung der Patienten und somit die Entlastung der Gesundheitssyteme im Ganzen.
Da Wassermangel für eine Vielfalt von Krankheiten einen Katalysator darstellt, ist die Hydratation ein wichtiger aber bislang nur invasiv zugänglicher Vitalparameter. Zur Etablierung nicht invasiver Messungen des Wasserhaushaltes am Menschen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung der Mikrowellentechnologie untersucht.
Dehydratation resultiert in der Veränderung des Osmolythaushaltes und beeinflusst biochemische Prozesse, was zur Entstehung von Morbidität führen kann. Im Rahmen der Arbeit werden Teilbereiche der Entwicklung eines Medizinproduktes abgebildet. Zu diesem Zweck wird die Machbarkeit der mikrowellenbasierten Analyse des Wasserhaushaltes in einer technischen Machbarkeitsstudie untersucht, um im zweiten Prozessschritt einen technischen Demonstrator in vitro und in vivo am Probanden erproben zu können. Hochfrequente elektromagnetische Wellen interagieren mit Molekülen, speziell Wasser. Enthält eine Probe freie Wassermoleküle, kann dies im reflektierten Signal detektiert werden. Zur Überprüfung des Sensorsystems in vitro dienen humane 3D-Vollhautmodelle mit spezifischer Hydratation und Gewebedichte der Matrixkomponenten als standardisiertes Modell zur Untersuchung definierter Exsikkoseszenarien und des Einflusses verschiedener Modellkomplexitäten. Die Eignungsüberprüfung des Systems mit einem technischen Demonstrator des künftigen Medizinproduktes belegt die Anwendbarkeit des Messsystems zur Erfassung des relativen Wassergehaltes. Die Technologie zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität bei der Destinktion von Proben mittels Frequenz- und Signalreflektionsdifferenzen aus. Neben den In-vitro-Testungen wird das entwickelte Sensorsystem aus regulatorischer Sicht zur klinischen Leistungsüberprüfung vorbereitet und im Rahmen eines bewilligten Ethikvotums in vivo erprobt. Die Ergebnisse belegen die Machbarkeit der nichtinvasiven Erfassung des Wasserhaushaltes durch mikrowellenbasierte Messungen. Die Technologie birgt das Potential, in ein körpernahes Sensorsystem integriert zu werden, welches als Medizinprodukt zur persönlichen Gesundheitsüberwachung zugelassen werden kann.
Testung verschiedener Strategien für die Regeneration von Knorpeldefekten im Ex vivo-Testsystem
(2021)
Die Degeneration des Gelenkknorpels ist Hauptursache für chronische Schmerzen und eine dadurch bedingte Einschränkung der Lebensqualität. Für die Sozialversicherungssysteme ist dies mit steigenden Kosten verbunden. Gegenwärtige Behandlungsoptionen wie die Mikrofrakturierung oder die (matrix-assoziierte) Autologe Chondrozytentransplantation (M-) ACT führen zu einem minderwertigen Reparaturgewebe aus Faserknorpel mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften an der Defektstelle. Es besteht ein Bedarf an der Entwicklung und Testung neuer Knorpeltherapien, die ein funktionelles Reparaturgewebe für nachhaltige Beschwerdefreiheit erzeugen. Das hier verwendete kürzlich etablierte osteochondrale Ex vivo-Testsystem (EVTS) eignet sich zur Evaluation unterschiedlicher zellbasierter Behandlungsansätze für die Knorpelregeneration.
Aus der medialen Femurkondyle von Schweinen wurden zylindrische 8 mm große osteochondrale Explantate (OCE) isoliert. Es wurden Knorpel-Knochendefekte und reine Knorpeldefekte kreiert und mit autologen Schweine-Chondrozyten (CZ) bzw. einer Mischung aus CZ und mesenchymalen Stammzellen (MSC) gefüllt, die in Kollagen Typ I Hydrogel eingebettet waren. Nach vierwöchiger Kultivierung wurden die Proben histologisch und immunhistochemisch gefärbt (Safranin-O-Färbung, Kollagen Typ II, Aggrekan), die Zellvitalität (Lebend-Tot-Färbung) überprüft und die extrazelluläre Matrixproduktion analysiert. Nach vierwöchiger Kultur im EVTS in Normoxie und Hypoxie zeigten sich die in Kollagen-I-Hydrogel eingebetteten Zellen lebensfähig. Die Auswertung der verschiedenen Ansätze erfolgte über den standardisierten ICRS-II-Score der International Cartilage Repair Society (ICRS) mit drei unabhängigen Bewertern. Insgesamt resultierten bessere Ergebnisse im Hinblick auf die Matrixsynthese in den Monokulturen aus CZ im Vergleich zu den Co-Kulturen aus CZ und MSCs. Da dieser Unterschied nicht groß war, könnten MSCs zur Einsparung autologer CZ eine Alternative in der Behandlung von Knorpeldefekten darstellen. Hypoxie spielte eine Rolle bei reinen Knorpeldefekten, nicht bei Knorpel-Knochendefekten. Dies bestätigt die Bedeutung des physiologischen hypoxischen Milieus des Gelenkknorpels, das einen niedrigen Sauerstoffgehalt von 2-5
VII
% aufweist. Die Ergebnisse zeigen, dass die unterschiedlichen Faktoren aus Zellkombination, Knorpeldefektgröße und Kultivierung in Hypoxie oder Normoxie Einfluss auf die Ausbildung der extrazellulären Matrix haben. Weiterhin fehlt jedoch das Verständnis für die genauen Mechanismen des Knorpelregenerationsverhaltens. Ex vivo-Testsysteme können dabei helfen ein weiteres Verständnis zu erlangen und entsprechende Behandlungsstrategien zu evaluieren.
In dieser Arbeit konnten ethanolische Sole aus TEOT und der metabolisierbaren α-Hydroxycarbonsäure Milchsäure (LA) in spinnfähige viskose Spinnmassen überführt werden und erstmalig über die Methode des Druckspinnens zu Mikrofasern prozessiert werden.
Die hybriden Fasern sind intrinsisch stabil. Über FTIR- und 13C-MAS-NMR-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in der Faser der Koordinationsmodus von LA an Ti sowohl im mono- als auch im bidentaten Modus (Nomenklatur bezogen auf die Säureeinheit) vorliegt.
Die nähere Untersuchung des Degradationsverhaltens einer LA-Faser zeigte hauptsächlich die Freisetzung von Lactat und Ethanol innerhalb weniger Stunden. Danach kann kaum noch ein Massenverlust der Fasern nachgewiesen werden. Vermutlich ist die Degradationsgeschwindigkeit abhängig von der Sättigungskonzentration der wasserlöslichen Titanoxid-Spezies Ti(OH)4 und Ti(O)(OH)2. Die Löslichkeit dieser Verbindungen beträgt ca. 1 µmol/L. Die Freisetzung von Titanverbindungen an das Degradationsmedium konnte über ICP-Messungen und indirekt auch über NMR-Messungen der Degradationsprodukte in Lösung nachgewiesen werden. Nach ca. einer Woche in Lösung bildet sich der wasserlösliche metallorganische Komplex TiBALDH. Dieser Komplex zeigt keinen negativen Einfluss auf die Umwelt, so dass Zellkulturmedien, die in Kontakt mit den Fasermaterialien getreten sind, in Zukunft nach dem Autoklavieren gefahrlos entsorgt werden können.
Zudem sollte keines der detektierten Abbauprodukte in den abgegebenen Mengen toxisch auf den humanen Organismus bei in vivo-Anwendungen wirken. Lactat und Ethanol können im menschlichen Organismus verstoffwechselt werden. TIBALDH ist dem im menschlichen Serum nachweisbaren Titan(IV)citrat-Komplex strukturell sehr ähnlich. Aufgrund der Tatsache, dass die Bildung von TiBALDH ca. 1 Woche dauert, ist die vorherige Bildung des Titan(IV)citrat-Komplexes im humanen Organismus wahrscheinlich.
Weiterhin konnte das hybride Fasermaterial durch den Zusatz von basischen Stoffen neutralisiert werden und nach Vorkonditionierung der Fasern als nicht zytotoxisch eingestuft werden. Als Gegenionen wurde Ammonium, das biogene Amin Phenethylamin, die Aminosäure Phenylalanin und das Biopolymer CHI getestet. Für zukünftige Weiterentwicklungen können auch basische Wirkstoffe als Gegenionen herangezogen werden. Somit könnte das hybride Zellträgermaterial zusätzlich eine Drug-Delivery-Funktion erhalten.
Die LA-Fasern verhalten sich nach dem Verspinnen sehr flexibel. Bei einer Lagerung bei RT jedoch verspröden diese sehr schnell innerhalb von 3 d. Diese Materialeigenschaft wurde im zweiten Teil der Arbeit näher untersucht und optimiert.
Tempern des Fasermaterials bei 170 °C bewirkte eine Umlagerung der LA-Liganden zu AA-Liganden, aber keine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Versuche einer getemperten LA-Faser mit CHI als Gegenion zeigte durchwegs positive Eigenschaften in den Zytotoxizitätstests und auf deren Oberfläche konnten Zellen der Zelllinien L929, 16HBE, HTB94 und MG63 erfolgreich kultiviert werden.
Durch die Verwendung anderer metabolisierbarer α Hydroxycarbonsäuren konnten Rückschlüsse auf die chemische Zusammensetzung der Fasern gezogen werden. Die Fasern scheinen aus wenig untereinander vernetzen Titan-oxo-carboxo-Clustern der Summenformel [Ti6O6(OR)6(Carboxylat)6] (mit R = H2+, H, Et oder „Ti6O6(OR)5(Carboxylat)6“) zu bestehen. Durch Variation der verwendeten Säuren konnten die Wechselwirkungen der Cluster untereinander verstärkt werden, so dass beispielsweise eine Faser mit MA bedeutend flexiblere Eigenschaften – auch bei einer Lagerung für 3d bei RT aufweist. Des Weiteren konnte durch Lagerung dieser Faser bei 4 °C der Versprödungsprozess für mind. 1 Monat gestoppt werden. Eine Lagerung von Medizinprodukten bei 4 °C stellt in Ländern mit ausreichender Infrastruktur kein Problem dar.
Aufbauend auf diesen Tatsachen und TGA-MS-Messungen konnte die These aufgestellt werden, dass sich zwischen den wenig untereinander vernetzten Titan-oxo-carboxo-Cluster direkt nach dem Verspinnen noch Wassermoleküle befinden. Diese Reste an Wasser verleihen – vermutlich aufgrund der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen – der Faser flexible Eigenschaften. Bei einer Lagerung bei RT entweichen diese Wasserreste und die Faser versprödet; bei einer Lagerung bei 4°C wird das Verdampfen des restlichen Wassers bedeutend verlangsamt.
Die Faser mit den flexibelsten Eigenschaften konnte letztendlich durch die Verwendung des zweizähnigen Carboxylat-Liganden MalA erhalten werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuartiges faserförmiges Material auf Basis von Titan-oxo-carboxo-Clustern produziert werden, welches großes Potential besitzt als Zellträgermaterial Anwendung zu finden. Aufbauend auf den hier gewonnenen Ergebnissen können die mechanischen Eigenschaften weiter optimiert und die Anforderungen des gewünschten Zielgewebes feinjustiert werden. Zudem besteht die Möglichkeit dem Material Drug-Delivery-Eigenschaften zu verleihen. Somit könnte das Scaffold aus Mikrofasern neben den bereits integrierten chemischen und physikalischen Stimuli (die Oberflächenfunktionalitäten und die Oberflächentopographie der Fasern) auch durch freigesetzte Wirkstoffe Zellen zur gewünschten Differenzierung anregen.
Kritische Knochendefekte stellen heutzutage ein ungelöstes Problem in der klinischen Praxis dar, da die verfügbaren prothetischen Optionen oft die mechanische Anpassung an das Gewebe nicht gewährleisten oder zu wichtigen immunologischen und Implantat-bedingten Komplikationen führen.
In diesem Kontext ermöglichen Tissue Engineering-Ansätze neue Strategien, um in vitro Zell-Material Interaktionen zu untersuchen und so die Implantatmaterialien zu optimieren.
In dieser Arbeit habe ich Zell-Material Interaktionen eines neuen Kollagen-basierten Scaffolds untersucht, das langfristig als Trägerstruktur für eine zellbasierte Therapie für kritische Knochendefekte entwickelt werden soll. Im Rahmen der Dissertation konnte ich belegen, dass die Kollagen-basierten makroporöse Mikrocarrier für die Zellvermehrung humaner mesenchymaler Stammzellen (MSC) und deren osteogene Differenzierung unter GMP Bedingungen verwendet werden können. Außerdem habe ich die die Kokultur von hämatopoietischen Stammzellen des Knochenmarks und multiplen Myelomzellen funktionell charakterisiert. Ich konnte erstmals Kulturbedingungen etablieren, die die Langzeitkultur ohne die Verwendung von Zytokinen ermöglicht. Mittels dieser Kokultur konnte ich ein Knochenmarknischen-Modell etablieren und die Untersuchung der Expression von zentralen Signalkaskaden der Homöostase dieser Nische untersuchen. Ich konnte die Expression von zwei verschiedenen Isoformen von Osteopontin nachweisen, die in Tiermodellen nicht gefunden werden. Diese Isoformen des Osteopontins habe ich kloniert und die rekombinanten Isoformen exprimiert und ihre Rollen in der Homöostase der Knochenmarknische untersucht.
Critical size bone defects represent nowadays an unresolved problem in the clinical practice, where the available prosthetic options often lack adequate mechanical matching to the host tissue or lead to important immunological and implant-related complications.
In this context, Tissue Engineering approaches promise more effective strategies to study cell-material interactions in vitro and consequently optimize implant materials.
In this work, I investigated the cell-scaffold interactions of a new collagen-based scaffold for a putative cell-based therapy for critical size defects to be developed. In the context of this thesis, I could demonstrate that the collagen-based macroporous microcarriers could be employed for the expansion and osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) under GMP-compliant conditions. Moreover, I functionally characterized the co-culture of bone marrow hematopoietic stem cells and multiple myeloma cells. I was for the first time able to establish culture conditions allowing their long-term culture in absence of externally supplemented cytokines. Using this co-culture, I was able to establish a bone marrow niche model to investigate the expression of key signaling pathways involved in the niche´s homeostasis. I was able to demonstrate the expression of two different isoforms of Osteopontin, that could not previously be detected in animal models. Finally, I cloned these Osteopontin isoforms, expressed recombinant versions of the isoforms, and investigated their roles in the homeostasis of the bone marrow niche.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vaskularisierten, autologen Implantats zur Behandlung von schweren Verletzungen der Trachea im Umfeld der guten Herstellungspraxis. Die Matrix besteht aus einem circa 14 cm langen Stück porcinen, azellularisierten Dünndarm und BioVaSc (Biological Vascularized Scaffold) genannt wird. Dieses wird dann mit isolierten und kultivierten Zellen des Patienten besiedelt und reift für zwei Wochen in einem speziell hierfür entwickelten Bioreaktorsystem. Danach erfolgt die Analyse bzw. die Implantation in den Patienten.
Nach der Präparation und Überprüfung der Qualität, erfolgte die Azellularisierung der BioVaSc zur Entfernung der porcinen Zellen und der enzymatische Abbau der DNS, unter Erhalt des natürlichen Gefäßsystems. Hierfür ist Natriumdesoxycholat verwendet worden, wobei Rückstände davon das Ansiedeln der autologen Zellen negativ beeinflussen könnten. Deshalb wurde ein Test etabliert, mit dessen Hilfe, das Auswaschen der Azellularisierungsdetergenz bis zur Sterilisation nachweisbar war. Des Weiteren könnten in der BioVaSc natürlicherweise enthaltene Endotoxine Immunreaktionen im späteren Empfänger auslösen. Die gesetzlichen Grenzwerte konnten durch Modifikationen des Protokolls, unter Berücksichtigung der guten Herstellungspraxis, erreicht werden. Weiterhin konnte histologisch eine weitgehende DNS- und Zellfreiheit nachgewiesen werden, in der quantitativen Analyse ergab sich eine Abreicherung von 97% im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Zur Bestimmung der funktionellen Stabilität der azellularisierten Matrix wurde die maximal tolerable Zugspannung bestimmt.
Zur Besiedlung der Gefäße der Matrix wurden mikrovaskuläre Endothelzellen und für das Lumen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen verwendet. Die Protokolle zur Isolation und Kultur sind hierzu unter den Bedingungen der guten Herstellungspraxis etabliert, optimiert und mit, soweit möglich, zertifizierten Reagenzien durchgeführt worden. Zur genauen Charakterisierung der Zellen wurden diese immunhistologisch über vier Passagen analysiert, wobei sich je nach Zelltyp und Differenzierungsstadium unterschiedliche Expressionsmuster ergaben.
Zur Herstellung des autologen Implantats wurden zunächst die mikrovaskulären Endothelzellen in das vorhandene Gefäßsystem der BioVaSc eingebracht und dann für sieben Tage im etablierten Bioreaktorsystem kultiviert. Danach erfolgte die Besiedlung des Lumens mit Skelettmuskelzellen und Fibroblasten und die weitere siebentägige Kultur im Bioreaktorsystem.
Die Besiedlung des Gefäßsystems musste optimiert werden, um sowohl die Besiedlungsdichte zu steigern als auch die Effizienz zu erhöhen. Das Lumen konnte mit der etablierten Methode vollständig besiedelt werden. Nach vierzehntägiger Kultur im Bioreaktorsystem erfolgte die Kontrolle der Zellvitalität, wobei sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen der BioVaSc vitale Zellen nachweisbar waren. Histologische Analysen zeigten, dass die mikrovaskulären Endothelzellen in den verbliebenen vaskulären Strukturen CD31 und den vWF exprimieren. Wohingegen die histologische Unterscheidung zwischen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen nicht möglich ist.
Zusätzlich wurde die BioVaSc mit upcyte mvEC der Firma Medicyte besiedelt. Nach der vierzehntägigen Kultur im Bioreaktorsystem waren die Zellen sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen und im Bindegewebe vital nachweisbar. In der histologischen Analyse konnte die Ausbildung von CD31, eNOS und vWF nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Matrix mit mesenchymalen Stammzellen besiedelt, um zu analysieren, ob die Scherkräfte die Ausbildung endothelialer Marker stimulieren können. Nach vierzehntägiger Kultur konnte in den histologischen Analysen keine Ausbildung von CD31 oder dem vWF gefunden, allerdings vitale Zellen nachgewiesen werden.
The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed.
In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the “gold standard” in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs.
In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes.
Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture.
Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive.
With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies.
Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies.
Durch Methoden des Tissue Engineerings hergestellte dreidimensionale Hautäquivalente bilden die native humane Haut hinsichtlich ihrer histologischen Architektur, zellulären Zusammensetzung und metabolischen Aktivität ab. Diese Gewebe eignen sich daher als zellbasierte Wundauflagen für großflächige Hautdefekte oder als In-vitro-Testsysteme für den Ersatz von Tierversuchen. Bei bisherigen Hautäquivalenten fehlt jedoch ein funktionelles Blutgefäßsystem. Wird solch ein Gewebe als Implantat eingesetzt, führt das Fehlen von Blutgefäßen zu einer unzureichenden Versorgung mit Nährstoffen und zur Nekrose. Neben dieser klinischen Limitation ist auch das Anwendungsspektrum als In-vitro-Testsystem begrenzt. Bei nicht vaskularisierten Hautmodellen kann eine transdermale Penetration von Substanzen nicht akkurat abgeschätzt werden, da die zusätzliche Barriere, welche die gefäßauskleidenden Endothelzellen bilden, nicht enthalten ist. In Studien zur Integration eines Gefäßsystems in Hautäquivalente konnte bislang lediglich gezeigt werden, dass sich Endothelzellen zu gefäßartigen Strukturen zusammenlagern. Die Bildung von funktionellen perfundierbaren Gefäßen in einem in vitro generierten Hautäquivalent ist bisher jedoch noch nicht belegt. Entsprechend ist eine direkte Anastomose mit dem Blutkreislauf eines Patienten bei einem klinischen Einsatz als Hautimplantat nicht möglich. Bei einer Anwendung in In-vitro-Studien ist zudem das Gefäßsystem experimentell nicht zugänglich.
In der vorliegenden Arbeit kann durch die Kombination einer biologischen, vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc) mit einem neu entwickelten Bioreaktorsystems, ein Hautäquivalent mit einem perfundierbaren Gefäßsystem hergestellt werden. Die Generierung dieser sogenannten SkinVaSc erfolgt über die Besiedlung der BioVaSc mit humanen Keratinozyten (hEK) und Fibroblasten. Parallel dazu werden die eingebetteten Gefäßstrukturen der BioVaSc mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hDMEC) rebesiedelt. Durch eine Anastomose zwischen den Gefäßen der BioVaSc und dem Bioreaktorsystem ist eine Perfusion mit physiologisch, gepulsten Drücken zwischen 80 und 120 mmHG möglich. Optimale Kulturbedingungen für die Haut- zellen können ferner durch zwei Kulturmodi generiert werden. Zur optimalen Versorgung der hEK innerhalb einer Proliferationsphase, die sich an die Zellaussaat anschließt, erfolgt eine kontinuierliche Versorgung der Oberfläche der SkinVaSc mit Medium. Der zweite Modus stimuliert die Differenzierung der hEK durch eine Kultivierung des Modells an der Grenzfläche zwischen Luft und Medium.
Nach einer vierzehntägigen Kultivierung der SkinVaSc an der Luft Medium Grenzfläche lässt sich die Bildung einer hautspezifischen histologischen Architektur durch Hämalaun/Eosin und immunhistologische Färbungen belegen. Eine natürlich differenzierte Epidermis wird durch eine Basalmembran, die Kollagen Typ IV und Laminin 5 enthält von einen dermalen Teil getrennt. Die Dermale-Epidermale-Verbindung erscheint durch die Mikrostrukturierung der BioVaSc wellenförmig. Damit bildet die SkinVaSc die papillare Struktur der nativen humanen Haut ab. Innerhalb des dermalen Anteils können zudem Gefäßstrukturen ausgemacht werden. Die Innenseite der Gefäße sind durch eine Schicht aus hDMEC ausgekleidet, die endothelzellspe-
zifische Oberflächenmarker wie "platelet endothelial cell adhesion molecule 1“ und "von Willebrand Faktor“ aufweisen.
Eine zerstörungsfreie Überwachung der SkinVaSc hinsichtlich der epidermalen Differenzierung ist durch eine integrierte Sensortechnologie auf Basis der Impedanz-spektroskopie möglich. Dabei erlaubt ein entwickeltes mathematisches Modell die Extraktion von biologisch relevanten Informationen aus Impedanzspektren in einem Frequenzbereich zwischen 1 Hz und 100 kHz. Innerhalb dieser Studien ließ sich zeigen, dass die epidermale Differenzierung zu einer signifikanten Steigerung des ohmschen Widerstandes von 245,3 Ohm*cm2 zu 1108,1 Ohm*cm2 führt. Gleichzeitig sinkt die zelluläre Kapazität von 131,5µF/cm2 auf 5,4µF/cm2 ab. Durch diese Parameter
ist es möglich die epidermale Barriere zerstörungsfrei über die Kultivierungszeit zu überwachen.
Das Gefäßsystem der SkinVaSc ermöglicht es mehr dermatologische Fragestellungen in vitro zu untersuchen und damit Tierversuche zu ersetzen. Zudem kann auf Basis der SkinVaSc ein vaskularisiertes Hautimplantat entwickelt werden, das es ermöglicht tiefe Hautverletzungen zu behandeln.
Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert.
In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist.
Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente.
Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern.
Gonorrhea is the second most common sexually transmitted infection worldwide and is caused by Gram-negative, human-specific diplococcus Neisseria gonorrhoeae. It colonizes the mucosal surface of the female reproductive tract and the male urethra. A rapid increase in antibiotic resistance makes gonorrhea a serious threat to public health worldwide. Since N. gonorrhoeae is a human-specific pathogen, animal infection models are not able to recapitulate all the features of infection. Therefore, a realistic in vitro cell culture model is urgently required for studying the gonorrhea infection. In this study, we established and characterized three independent 3D tissue models based on the porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold by co-culturing human dermal fibroblasts with human colorectal carcinoma, endometrial epithelial, and male uroepithelial cells. The histological, immunohistochemical, and ultra-structural analysis showed that the 3D SIS scaffold-based models closely mimic the main characteristics of the site of gonococcal infection in the human host including the formation of epithelial monolayer, underlying connective tissue, mucus production, tight junction (TJ), and microvilli. In addition, functional analysis such as transepithelial electrical resistance (TEER) and barrier permeability indicated high barrier integrity of the cell layer. We infected the established 3D tissue models with different N. gonorrhoeae strains and derivatives presenting various phenotypes regarding adhesion and invasion. The results showed disruption of TJs and growing the interleukins production in response to the infection, which depends on the type of strain and cell. In addition, the 3D tissue models supported bacterial survival, which provided an appropriate in vitro model for long-term infection study. This could be mainly because of the high resilience of the 3D tissue models based on the SIS scaffold to the infection in terms of alteration in permeability, cell destruction, and bacterial transmigration.
During gonorrhea infection, a high level of neutrophils migrates to the site of infection. The studies also showed that N. gonorrhoeae can survive or even replicate inside the neutrophils. Therefore, studying the interaction between neutrophils and N. gonorrhoeae is substantially under scrutiny. For this purpose, we generated a 3D tissue model by triple co-culturing of human primary fibroblast cells, human colorectal carcinoma cells, and human umbilical vein endothelial cells. The tissue model was subsequently infected by N. gonorrhoeae. A perfusion-based bioreactor system was employed to recreate blood flow in the side of endothelial cells and consequently study human neutrophils transmigration to the site of infection. We observed neutrophils activation upon the infection. Furthermore, we demonstrated the uptake of N. gonorrhoeae by human neutrophils and reverse transmigration of neutrophils to the basal side carrying N. gonorrhoeae. In summary, the introduced 3D tissue models in this research represent a promising tool to investigate N. gonorrhoeae infections under close-to-natural conditions.
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a valuable technique analyzing electrochemical behavior of biological systems such as electrical characterization of cells and biomolecules, drug screening, and biomaterials in biomedical field. In EIS, an alternating current (AC) power signal is applied to the biological system, and the impedance of the system is measured over a range of frequencies.
In vitro culture models of endothelial or epithelial barrier tissue can be achieved by culturing barrier tissue on scaffolds made with synthetic or biological materials that provide separate compartments (apical and basal sides), allowing for further studies on drug transport. EIS is a great candidate for non-invasive and real-time monitoring of the electrical properties that correlate with barrier integrity during the tissue modeling. Although commercially available transendothelial/transepithelial electrical resistance (TEER) measurement devices are widely used, their use is particularly common in static transwell culture. EIS is considered more suitable than TEER measurement devices in bioreactor cultures that involve dynamic fluid flow to obtain accurate and reliable measurements. Furthermore, while TEER measurement devices can only assess resistance at a single frequency, EIS measurements can capture both resistance and capacitance properties of cells, providing additional information about the cellular barrier's characteristics across various frequencies. Incorporating EIS into a bioreactor system requires the careful optimization of electrode integration within the bioreactor setup and measurement parameters to ensure accurate EIS measurements. Since bioreactors vary in size and design depending on the purpose of the study, most studies have reported using an electrode system specifically designed for a particular bioreactor. The aim of this work was to produce multi-applicable electrodes and established methods for automated non-invasive and real-time monitoring using the EIS technique in bioreactor cultures. Key to the electrode material, titanium nitride (TiN) coating was fabricated on different substrates (materials and shape) using physical vapor deposition (PVD) and housed in a polydimethylsiloxane (PDMS) structure to allow the electrodes to function as independent units. Various electrode designs were evaluated for double-layer capacitance and morphology using EIS and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The TiN-coated tube electrode was identified as the optimal choice. Furthermore, EIS measurements were performed to examine the impact of influential parameters related to culture conditions on the TiN-coated electrode system. In order to demonstrate the versatility of the electrodes, these electrodes were then integrated into in different types of perfusion bioreactors for monitoring barrier cells. Blood-brain barrier (BBB) cells were cultured in the newly developed dynamic flow bioreactor, while human umblical vascular endothelial cells (HUVECs) and Caco-2 cells were cultured in the miniature hollow fiber bioreactor (HFBR). As a result, the TiN-coated tube electrode system enabled investigation of BBB barrier integrity in long-term bioreactor culture. While EIS measurement could not detect HUVECs electrical properties in miniature HFBR culture, there was the possibility of measuring the barrier integrity of Caco-2 cells, indicating potential usefulness for evaluating their barrier function. Following the bioreactor cultures, the application of the TiN-coated tube electrode was expanded to hemofiltration, based on the hypothesis that the EIS system may be used to monitor clotting or clogging phenomena in hemofiltration. The findings suggest that the EIS monitoring system can track changes in ion concentration of blood before and after hemofiltration in real-time, which may serve as an indicator of clogging of filter membranes. Overall, our research demonstrates the potential of TiN-coated tube electrodes for sensitive and versatile non-invasive monitoring in bioreactor cultures and medical devices.
Aktueller Goldstandard bei der Rekonstruktion des ACL des Menschen sind au-tologe Transplantate. Diese sind allerdings je nach Entnahmeort mit einer mehr oder weniger hohen Entnahmemorbidität und dem Risiko für Folgeerkrankungen verbunden. Um dies zu umgehen, wurde ein xenogenes Kollagenimplantat aus
Kollagen-I-Fasern von Ratten entwickelt und das native Konstrukt bereits in einer Vorläuferstudie getestet.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Kreuzbandkonstrukte mit Hilfe diverser
Crosslinker modifiziert und hinsichtlich ihrer Biomechanik, Biokompatibilität und ihres in-vivo Verhaltens untersucht.
Bewusst wurde dabei auf die Zellbesiedlung dieser Konstrukte verzichtet, da un-ter Berücksichtigung wirtschaftlicher Gesichtspunkte eines späteren humanen
Einsatzes hierfür eine Arzneimittelzulassung notwendig gewesen wäre. Mit Hilfe der Crosslinker wurde versucht, die mechanische Stabilität sowie die Resistenz gegen kollagenabbauende Enzyme der Synovia zu erhöhen, um die Gefahr post-operativer Instabilitäten zu verringern. Dabei sollten Fragen bezüglich Immun-antwort, Biokompatibilität sowie Biodegradierbarkeit genau berücksichtigt wer-den. Als Crosslinker wurden für einen Vergleich in vitro neben 0,5 % Genipin auch 10 % HMDI sowie Glukose und EDC/NHS herangezogen.
Dabei zeigten die Genipin-gecrosslinkten Einzelfasern die größte Reißfestigkeits-zunahme, wohingegen auf Minikonstruktbasis 10 % HMDI zu den höchsten UTS-Werten führte. Ebenso ließen sich bezüglich der Biokompatibilutät in vitro bei den Crosslinkern 0,5 % Genipin und 10 % HMDI Vorteile gegenüber den beiden an-deren erkennen.
Schließlich erfolgte im Rahmen eines Tierversuchs an 16 Minipigs der Einbau von 0,5 % Genipin-gecrosslinkten Konstrukten als Kreuzbandersatz und an-schließend die biomechanische Testung sowie nach Paraffineinbettung auch eine durchlichtmikrokopische deskriptive Auswertung der Transplantate.
Während nach 6 Wochen eine deutliche Reißfestigkeitsabnahme zu verzeichnen war, erreichte diese nach 6 Monaten wieder fast 60 % ihrer ursprünglichen UTS.
Somit konnte ein Remodeling des eingesetzten Implantats angenommen wer-den. Dies bestätigte sich in der durchgeführten histologischen Untersuchung.
Hier war das Implantat deutlich vaskularisiert, von zahlreichen Fibroblasten durchsetzt und wies eine synoviale Deckschicht auf. Allerdings scheint vor allem wegen der Schwäche der Konstrukte nach 6 Wochen sowie den vermutlich auf-grund des Crosslinkers auftretenden Reaktionserscheinungen innerhalb des
Kniegelenks ein Einsatz im humanen Bereich zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausgereift.
Dennoch lässt sich gerade anhand des stattfindenden Remodelings das große Potential kollagenbasierter Materialien für den Kreuzbandersatz erkennen. Eine weitere Optimierung des bestehenden Konstrukts sollte deshalb forciert werden.
Biomechanische Eigenschaften eines biomaterialbasierten Kreuzbandkonstruktes in-vivo und in-vitro
(2023)
Kreuzbandrupturen stellen nach wie vor eine Herausforderung in der klinischen Praxis hinsichtlich kurz- und langfristiger unerwünschter Nebenwirkungen dar (z.B. Reruptur und Arthrosebildung).
In der vorliegenden Arbeit wird der entwickelte Ansatz eines Kollagen-I-basierten künstlichen Kreuzbandkonstruktes hinsichtlich der Reißfestigkeit, Lagerung, Verstärkungsmöglichkeit mittels Fiber-tape und langfristigen Arthroseentstehung untersucht mittels in-vitro und in-vivo Untersuchungen unter zur Hilfe nahme des Minipig Tiermodels.
Die Ergebnisse zeigen keinen Einfluss der Lagerungstemperatur sowie des Lagerungszeitraums auf die Reißfestigkeit des Konstruktes, sowie eine mögliche initiale Verstärkung mittels Fibertape im Minipig. Darüber hinaus wurde mikroskopisch wie makroskopische Arthroseentstehung nachgewiesen. Das Ausmaß der Arthroseentstehung ist diesbezüglich mit einer Abweichung der Konstruktimplantation von der ursprünglichen Kreuzbandinsertion mittels MRT bestätigt worden.