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Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion von moDCs und T-Zellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
(2021)
Die invasive Aspergillose ist eine gefürchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer hämatologischen Grunderkrankung wie einer Leukämie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerstören und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. Während dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose häufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abhängen. Häufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypoxämie aufgrund einer Diffusionsstörung in den entzündeten Lungenabschnitten.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsstück zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen übernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden näher untersucht werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu befähigt, eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie könnte somit als zusätzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Ursächlich für die verstärkte Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verstärkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein.
Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können.
The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens.
This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly.
Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells.
CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus.
Während der letzten Jahrzehnte ist eine steigende Inzidenz von Infektionen durch Pilze der Ordnung Mucorales zu beobachten. Rhizopus arrhizus ist der häufigste Erreger dieser lebensbedrohlichen Infektionen, die vor allem immunsupprimierte Patienten betreffen. Aufgrund der oft schwierigen Diagnosestellung und limitierter therapeutischer Optionen liegt derzeit die Letalität von Mucormykosen zwischen 50 bis 100 %. Eine Voraussetzung für die Etablierung neuer Biomarker oder immuntherapeutischer Strategien ist ein verbessertes Verständnis der immunpathologischen Prozesse bei der Abwehr von Mucorales.
In dieser Arbeit wurden daher verschiedene Immunzellpopulationen durch ruhende und ausgekeimte Stadien von R. arrhizus stimuliert und anschließend deren proinflammatorische Immunantwort gemessen. Als Vergleich diente die proinflammatorische Immunantwort der untersuchten Immunzellen nach Stimulation mit Aspergillus fumigatus. Darüber hinaus war es Gegenstand dieser Arbeit, zu charakterisieren welche Pattern Recognition Receptors (PRRs) an der Erkennung von Mucorales durch verschiedene innate Immunzellen beteiligt sind. Zugleich wurde untersucht, ob unterschiedliche Morphotypen der Pilzspezies Auswirkungen auf die Stimulation der jeweiligen PRRs haben. Hierfür wurden Koinkubations-Experimente mit neutrophilen Granulozyten sowie Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs), Monozyten und monocyte derived dendritic cells (moDCs) mit verschiedenen Morphotypen von R. arrhizus durchgeführt. Die Rezeptoren TLR2, TLR4 und/oder Dectin-1 wurden dabei durch neutralisierende Antikörper oder RNA-Interferenz blockiert.
Ausgekeimte Stadien von A. fumigatus sowie R. arrhizus induzierten eine erhöhte ROS-Freisetzung in Neutrophilen, die durch isolierte oder kombinierte Blockade von TLR2, TLR4 und Dectin-1 abgeschwächt wurde. Ebenso wurde die Phagozytoseaktivität neutrophiler Granulozyten gegenüber R. arrhizus-Konidien durch Blockade von TLR4 und Dectin-1 deutlich reduziert.
Im Gegensatz zu A. fumigatus induzierten sowohl ruhende Konidien als auch ausgekeimte Stadien (Keimschläuche und Hyphen) von R. arrhizus eine robuste pro-inflammatorische Zytokinantwort durch moDCs. Nach Inhibition der Dectin-1 Expression durch RNA-Interferenz zeigte sich die Transkription und Sekretion von Interleukin-1β in Gegenwart aller drei untersuchten Morphotypen von
R. arrhizus deutlich vermindert (Transkription um 46 bis 68 % und Sekretion um 75 bis 79 % vermindert). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Dectin-1 ein wichtiger Mediator bei der Einleitung der innaten Immunantwort verschiedener Zelltypen gegen R. arrhizus ist. Diese Beobachtung sollte in weiteren Studien eingehender untersucht werden, z. B. um die Eignung von Dectin-1 als Rezeptor für zelltherapeutische Ansätze wie T-Zell-Konstrukte mit chimären Antigen-Rezeptoren zu evaluieren.