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Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen.
In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung.
In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen.
Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle.
Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden.
Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorgängen verschiedener Gewebe beteiligt. So fördert es in T-Lymphozyten über Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Phänotyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch über eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Auslösung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifität und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen.
Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gefärbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ näher betrachten zu können.
In Annexin V-PE- und 7-AAD-Färbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose fördert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabhängigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ veränderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren.
So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose fördern kann, dies über eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod schützen konnte. Insgesamt lässt sich aber, obwohl nicht alle Details geklärt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch für Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.
Die Neuralentwicklung wird durch eine Vielzahl von Genen reguliert. Hierbei scheint der Notch-Signaltransduktionsweg eine wichtige Rolle zu spielen. Die primären Zielgene der Notch-Signalkaskaskade sind die Hes- und Hey-Gene. Die genaue Bedeutung der Signalkaskade, der Hes- und insbesondere der Hey-Gene für den Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ist noch nicht bekannt.
Ziel dieser Arbeit war es, die Aufgaben von Notch und der Hey-Gene beim Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen genauer zu untersuchen.
Da das gezielte Ausschalten eines Gens eine aussagekräftige Methode zur Erforschung seiner Funktion ist, wurden zunächst neurale Stamm- und Vorläuferzellen in Form von sogenannten Neurosphären von Hey1-/- und Hey2-/- Mäuseembryonen mit denen von Wildtyp-Mäuseembryonen verglichen. Dabei differenzierten bei den Hey1-/- Neurosphärenkulturen ca. 6,6% (bei den Kontrollen 6,6%) und bei den Hey2-/- Kulturen 10,9% (Kontrollen 8,7%) der Zellen zu Neuronen. Eine komplette Inhibierung der Notch-Signalkaskade wurde durch das Etablieren von RBP-Jκ-/- Kulturen erreicht. RBP-Jκ-/- Zellen waren jedoch während der Differenzierung nur noch zu einem kleinen Teil in der Lage zu adhärieren, was weitere Experimente mit den Zellen unmöglich machte. Als nächstes sollten Neurosphären mit einer Überexpression von Hey1 mit Wildtyp-Neurosphären verglichen werden. Es gelang allerdings aufgrund einer schon hohen Ausgangsexpression von Hey1 in Neurosphären nur, die Expression zu verdreifachen, was für weitere Experimente nicht ausreichend schien.
Um die Prozesse, die auf Genebene während der Differenzierung neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ablaufen, besser zu verstehen, wurden die Expression von Genen, die in der Neuralentwicklung und in der Notch-Signalkaskade eine Rolle spielen, in Wildtyp-Neurosphärenzellen mittels qRT-PCR zu verschiedenen Differenzierungszeitpunkten quantifiziert. Die Genexpression von Hes1 und Hes5, sowie Hey2 wurde während der Differenzierung zum Teil deutlich herunterreguliert. Die Gene Hes3, Hey1 und Id4 hingegen stiegen zunächst bis Tag 3 stark an, um dann an Tag 7 und 14 etwa wieder den Ausgangswert zu erreichen. Die Regulation der Gene war insgesamt recht uneinheitlich und nicht immer nachvollziehbar. Da diese teils widersprüchlichen Ergebnisse auf die vorgegebene Heterogenität einer Neurosphärenkultur zurückzuführen sein könnten, wurde nach einer Alternative zur Neurosphärenkultur gesucht.
Deshalb wurde im Weiteren versucht homogene Monolayerkulturen nach einem Protokoll von Conti et al. (2005) zu etablieren. Das Protokoll musste aber an einigen Stellen angepasst werden, um adäquate Kulturen zu erhalten. Da die Monolayerkulturen auf Gelatine nicht gut hafteten wurde auf eine Polyornithin-Beschichtung umgestellt. Außerdem wurde das NS-A Medium mit N-2 Zusatz aufgrund schlechter Proliferation der Zellen auf Neurobasalmedium mit B-27 Zusatz umgestellt. Färbungen dieser Monolayerkulturen zeigten, dass sich fast alle Zellen mit dem Stammzellmarker Nestin anfärben ließen und keine Zellen Tuj1+ (Neuronen) und nur einige wenige Zellen Gfap+ (Astrozyten) waren. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass die Zellen in einer Monolayerkultur unter den oben beschriebenen Bedingungen hauptsächlich undifferenziert sind und neuralen Stamm- bzw. Vorläuferzellcharakter haben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der Rolle von PCGF6 und E2F6 in murinen embryonalen Stammzellen (mESCs) und zu Beginn der Differenzierung Knockout-Zelllinien beider Proteine und in Kombination durch das CRISPR/Cas9n Systems erstellt. Die Charakterisierung dieser Knockout-Zelllinien erfolgte durch Wachstumsanalysen in mESCs und differenzierenden murinen Stammzellen (EBs). Es konnte festgestellt werden, dass Zellen des Pcgf6 Knockout (KO) kleinere Ebs bildeten, die zudem nicht über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden konnten. Zur Klärung dieses spezifischen Phänotyps wurden weitere molekulare Analysen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Zellen des Pcgf6 KO wiesen während der Differenzierung einen erhöhten Anteil an Zellen in der G1-Phase sowie eine erhöhte apoptotische Frequenz auf. Unterstützend zur Annahme eines Zellzyklusdefekts wurden RNASeq-Daten analysiert. Die Auswertung ergab, dass Zellen des Pcgf6 KO zeitlich unkontrolliert differenzierten. Die Auswertung differenziell exprimierter Gene ergab zudem, dass die Expression von E2f6, ein Regulator des Zellzyklus und weitere Untereinheit des nicht-kanonischen PRC1.6, in mESC und EB-Kulturen herunter reguliert war, während Zellzyklus-spezifische Targets der E2F6-abhängigen Genregulation an Tag 2 der Differenzierung hochreguliert waren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine Deletion von Pcgf6 zu Beginn der Differenzierung Auswirkungen auf eine E2F6-abhängige Zellzyklusregulation haben muss. Auf Grund einer zu diesem Zeitpunkt aufgetretenen Mykoplasmenkontamination in der Zellkultur musste die Pcgf6 KO-Zelllinie neu erstellt werden. Zusätzlich wurden KO-Zelllinien von E2f6 in Wt und in Pcgf6 KO mESCs erstellt. Die anschließende Wiederholung der zellulären Charakterisierung des Phänotyps ergab, dass EB-Kulturen des Pcgf6 KO und des Doppelknockout von Pcgf6 und E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) während der Differenzierung eine verringerte Zellzahl aufwiesen. Die molekularen Charakterisierungen des Phänotyps ergaben, dass der erhöhte Anteil an Zellen in der G1-Phase des Pcgf6 KO, welche vor der Mykoplasmenkontamination detektiert wurde, nicht reproduziert werden konnte. Es wurde jedoch eine erhöhte Frequenz an Zellen in der G2-Phase des dKOPcgf6/E2f6 in der mESC-und EB-Kultur ermittelt. Die Analyse der apoptotischen Frequenz in allen KO-Zelllinien zeigte einen Anstieg während der Differenzierung. Zur Unterstützung der bis dahin durchgeführte Analysen wurden RNASeq-Daten zweier Publikationen zu PCGF6 und E2F6 herangezogen (Qui et al., 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichtment Analysen dieser Daten ergaben, dass in beiden KO-Zelllinien in mESCs unabhängig voneinander Keimbahngene hochreguliert waren. Beide KO-Zelllinien zeigten aber auch eine Schnittmenge gemeinsam hochregulierter Keimbahngene. In Anlehnung an diese Veröffentlichungen, ergaben Genexpressionsanalysen einzelner Keimbahngene, dass ein Verlust von E2f6 zu einer De-Repression von Genen führt, die eine Bindestelle für E2F6 besitzen. Der Verlust von Pcgf6 hingegen hatte keine Auswirkung auf Expression dieser Targets. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es unterschiedliche Subkomplexe gibt, die die Expression von Keimbahngenen in mESC- und EB-Kulturen regulieren.
Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2 (extrazellulär Signal-regulierte Kinase 1 und 2) sind die Effektorkinasen der Raf/MEK/ERK-Kaskade und verknüpfen externe Stimuli mit der intrazellulä-ren Antwort, wodurch sie wichtige Schlüsselmoleküle der zellulären Signaltransduktion darstellen. Zahlreiche Studien belegen die Beteiligung von ERK1/2 an der Entstehung pathologischer kardialer Hypertrophie. Genauso ist bekannt, dass ERK1/2 anti-apoptotische, kardioprotektive Eigenschaften besitzen.
So führte, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine Hemmung der katalytischen ERK1/2-Aktivität durch den MEK-Inhibitor PD98059 zu einer signifikanten Reduktion der hypertrophen Antwort von Kardiomy-ozyten auf den Stimulus Phenylephrin. Dies war allerdings mit einem Anstieg der Apoptoserate in diesen Zellen verbunden, wodurch sich eine Hemmung der totalen ERK-Aktivität als nicht praktika-bel für die Behandlung pathologischer kardialer Hypertrophie herauskristallisierte. In früheren Un-tersuchungen wurde eine Autophosphorylierung von ERK an Threonin 188 (murines ERK2) entdeckt und als Trigger für ERK1/2-vermitteltes hypertrophes Wachstum identifiziert. Diese Autophospho-rylierung steuert die nukleäre Lokalisation von ERK1/2 und ermöglicht so die Aktivierung nukleärer ERK-Zielproteine sowie hypertrophes Wachstum. Eine Interferenz mit der ERKThr188-Phosphorylierung konnte schon in vitro und in vivo erfolgreich einer pathologischen Hypertrophie entgegenwirken, ohne Einfluss auf physiologisches Herzwachstum oder die zytosolischen, anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 zu nehmen. Einen initialen Schritt für das Zustandekommen dieser Autophosphorylierung an Threonin 188 stellt dabei die Dimerisierung von ERK dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Inhibition der ERK-Dimerisierung im Hinblick auf die Behand-lung ERKThr188-vermittelter pathologischer Hypertrophie untersucht. Dabei sollte die endogene ERK-Dimerisierung mithilfe eines selbst generierten Peptids unterbunden werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu einer dimerisierungsdefizienten ERK2-Mutante (ERK2-Δ4) konnte das Peptid in vitro und in vivo erfolgreich pathologisch hypertrophes Herzwachstum mindern. Dabei führte es sogar zu einem Rückgang des apoptotischen Zelltodes, ausgelöst durch eine Aortenligation, füh-ren. Es zeigte sich, dass das Peptid die nukleäre Translokation von ERK2 verhindert und dadurch nukleäre ERK-Substrate geringer aktiviert werden. Da eine Dysregulation in der Raf/MEK/ERK-Kaskade auch die Entstehung von Tumoren begünstigen kann, sollte schließlich untersucht wer-den, ob das Prinzip der Hemmung nukleärer ERK-Effekte auch die Proliferation von Krebszellen beeinflussen kann. Es stellte sich heraus, dass die Peptid-vermittelte Hemmung der ERK-Dimerisierung auch die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien mit unterschiedlichen Mutations-stadien der Raf/MEK/ERK-Kaskade reduziert.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit die Intervention mit der ERK-Dimerisierung als Target der ERKThr188-Autophosphorylierung als translationale Strategie zur Reduktion nukleärer ERK-Effekte herausgearbeitet werden. Dies bietet die Möglichkeit ERK-vermittelte pathologische kardialer Hy-pertrophie und ERK-vermittelte Tumor-Proliferation zu behandeln, ohne kardiotoxische Nebenwir-kungen zu verursachen.