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The interaction of synaptic proteins orchestrate the function of one of the most complex organs, the brain. The multitude of molecular elements influencing neurological correlations makes imaging processes complicated since conventional fluorescence microscopy methods are unable to resolve structures beyond the diffraction-limit.
The implementation of super-resolution fluorescence microscopy into the field of neuroscience allows the visualisation of the fine details of neural connectivity. The key element of my thesis is the super-resolution technique dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) and its optimisation as a multi-colour approach. Capturing more than one target, I aim to unravel the distribution of synaptic proteins with nanometer precision and set them into a structural and quantitative context with one another. Therefore dSTORM specific protocols are optimized to serve the peculiarities of particular neural samples.
In one project the brain derived neurotrophic factor (BDNF) is investigated in primary, hippocampal neurons. With a precision beyond 15 nm, preand post-synaptic sites can be identified by staining the active zone proteins bassoon and homer. As a result, hallmarks of mature synapses can be exhibited. The single molecule sensitivity of dSTORM enables the measurement of endogenous BDNF and locates BDNF granules aligned with glutamatergic pre-synapses. This data proofs that hippocampal neurons are capable of enriching BDNF within the mature glutamatergic pre-synapse, possibly influencing synaptic plasticity.
The distribution of the metabotropic glutamate receptor mGlu4 is investigated in physiological brain slices enabling the analysis of the receptor in its natural environment. With dual-colour dSTORM, the spatial arrangement of the mGlu4 receptor in the pre-synaptic sites of parallel fibres in the molecular layer of the mouse cerebellum is visualized, as well as a four to six-fold increase in the density of the receptor in the active zone compared to the nearby environment. Prior functional measurements show that metabotropic glutamate receptors influence voltage-gated calcium channels and proteins that are involved in synaptic vesicle priming. Corresponding dSTORM data indeed suggests that a subset of the mGlu4 receptor is correlated with the voltage-gated calcium channel Cav2.1 on distances around 60 nm.
These results are based on the improvement of the direct analysis of localisation data. Tools like coordinated based correlation analysis and nearest neighbour analysis of clusters centroids are used complementary to map protein connections of the synapse. Limits and possible improvements of these tools are discussed to foster the quantitative analysis of single molecule localisation microscopy data.
Performing super-resolution microscopy on complex samples like brain slices benefits from a maximised field of view in combination with the visualisation of more than two targets to set the protein of interest in a cellular context. This challenge served as a motivation to establish a workflow for correlated structured illumination microscopy (SIM) and dSTORM. The development of the visualisation software coSIdSTORM promotes the combination of these powerful super-resolution techniques even on separated setups. As an example, synapses in the cerebellum that are affiliated to the parallel fibres and the dendrites of the Purkinje cells are identified by SIM and the protein bassoon of those pre-synapses is visualised threedimensionally with nanoscopic precision by dSTORM.
In this work I placed emphasis on the improvement of multi-colour super-resolution imaging and its analysing tools to enable the investigation of synaptic proteins. The unravelling of the structural arrangement of investigated proteins supports the building of a synapse model and therefore helps to understand the relation between structure and function in neural transmission processes.
Synaptische Plastizität wird als Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorgänge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven geprüft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verstärker zu koppeln. Durch die vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten des Modellorganismus war es möglich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorgängen selektiv zu betrachten.
Bruchpilot wird für den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila benötigt und ist wichtig für die Akkumulation von Calcium-Kanälen in der Nähe von AZ. Durch gentechnische Veränderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeinträchtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdomänen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizität. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Domäne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) führt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem veränderten Phänotyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das für eine funktionsfähige Architektur von AZ und damit u.a. für den reibungslosen Vesikelverkehr zuständig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizität und Lernvorgänge beeinflusst.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenhänge der synaptischen Plastizität und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu können. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen veränderten Phänotyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschränkten Phänotyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man früher schon signifikante strukturelle Veränderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskulären Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren.