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In der vorliegenden Arbeit wurden extraflorale Nektarien (EFN) von Populus trichocarpa (Ptr) und Populus tremula x Populus tremuloides (Ptt) hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften bei der indirekten Herbivoren-Abwehr untersucht. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Nektarien-Funktion und -Regulation:
Beide untersuchten EFN-Arten sind in der Lage, die jeweilige Pappel indirekt vor Schädigung durch Herbivoren zu schützen. Dies zeigte nicht zuletzt der jeweils beobachtete kontinuierliche Besuch verschiedenster Insektenarten. Vor allem Ameisen aber auch Bienen zählten zu Besuchern sowohl von Ptr als auch Ptt. Die Effektivität so angelockter Besucher konnte durch Interaktionsversuche mit Bienen bestätigt werden und belegte, dass allein die Anwesenheit von Bienen zu einer eindeutigen Reduktion des herbivoren Blattschadens führt (Ptr und Ptt).
Obwohl beide Pflanzen derselben Gattung (Populus) angehören, konnte bestätigt werden, dass Ptr und Ptt unterschiedliche Herbivoren-Abwehrstrategien entwickelt haben. Während es sich bei Ptt-EFN um konstitutiv vorhandene Organe handelt, zeigten Ptr-Pflanzen eine gezielte Bildung von Nektarien/Nektar erst nach Herbivorenbefall. Dabei scheinen spezifische, durch Herbivoren erzeugte Signale für die Induktion verantwortlich zu sein. Die Freisetzung der nach Herbivorenbefall typischen, flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) in Ptr konnte zwar als Jasmonsäure-abhängig identifiziert, der Jasmonsäure-Signalweg, der schon als Auslöser für extraflorale Nektar-Produktion bei z.B. Limabohne gezeigt worden war, als alleiniges Steuerelement aber ausgeschlossen werden. Ein Zusammenspiel mehrerer Hormone bei der Regulation der indirekten Herbivoren-Abwehr in Ptr durch Nektarien/Nektar-Induktion ist deshalb sehr wahrscheinlich.
Dies bekräftigten auch die Transkriptomanalysen von Ptt-Nektarien. Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl Jasmonsäure als auch Auxin und Salicylsäure eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus lieferten verschiedene differentiell regulierte Gencluster, die in Zusammenhang mit Nektarien-Funktion, -Entwicklung und biotischem Stress stehen, deutliche Hinweise auf die entscheidende Rolle extrafloraler Nektarien bei der Herbivoren-Abwehr.
Nektar-Produktion:
Die Analyse extrafloraler Nektar-Proteine und zugehöriger Transkripte zeigte nicht nur, dass beide Pappelarten über eine ähnliche, von antimikrobiellen Proteinen dominierte Nektar-Proteinzusammensetzung verfügen, sondern auch, dass bei beiden die Produktion dieser Proteine hauptsächlich direkt in den Drüsenorganen stattfindet.
Es deutete außerdem alles darauf hin, dass der Zucker des Ptt-Nektars direkt im Nektarienparenchym produziert wird, und dass dafür ein apoplastischer Schritt notwendig ist, der gleichzeitig über das „Source und Sink“ Verhältnis den Nachschub von Saccharose ins Nektarienparenchym reguliert.
Nektar-Sekretion:
Die unterschiedlichen Hauptsekretionsarten der beiden Pappeln konnten ebenfalls gezeigt werden. Während Ptt-Nektar eindeutig granulokrin sekretiert wird, konnte dieser Weg für Ptr ausgeschlossen werden. Deshalb scheint Ptr holokrine Sekretion zu bevorzugen.
In Ptt fanden sich außerdem Belege für eine parallel ablaufende ekkrine Sekretion. Hierfür wird die initiale Abgabe osmotisch wirksamer Substanzen und nachfolgend Wasser vorausgesetzt. Der Anionenkanal PttSLAH3 zeigte sich, ausgehend von der Anionenzusammensetzung des Nektars und der Lokalisation des Proteins in den epidermalen Drüsenzellen als optimales Transportprotein für diesen Schritt. Die typischen Eigenschaften eines S-Typ-Anionenkanals vom Typ des Arabidopsis-SLAH3, wie Nitratabhängigkeit und spezifische Anionenpermeabilität wiesen darauf hin, dass PttSLAH3 für die finale „nasse“ Sekretion verantwortlich sein kann.
Im Unterschied zu AtSLAH3 scheint die Aktivierung von PttSLAH3 allerdings auf andere Weise zu erfolgen. Denn im Gegensatz zum Arabidopsis-Ortholog, zeigte PttSLAH3 in Xenopus-Oozyten bereits ohne koexprimierte Kinase Aktivität. Grundsätzlich konnte eine Aktivierung durch Phosphorylierung aber nicht ausgeschlossen werden. Es deutete vielmehr alles darauf hin, dass bereits Oozyten-endogene Kinasen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von PttSLAH3 spielen. Eine entsprechende Phosphorylierungsstelle konnte jedoch nicht ausgemacht werden. Allerdings deuteten die Ergebnisse im Weiteren darauf hin, dass die unterschiedliche Struktur der AtSLAH3- und PttSLAH3-Termini, im Besonderen die des N-Terminus, für die konstitutive Aktivität des Pappel-Kanals verantwortlich ist. Damit kommt PttSLAH3 eine Sonderstellung innerhalb der SLAC/SLAH-Familie zu, die weiterer Untersuchungen bedarf.
Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010).
Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen.
Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen.
Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen.
Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein.