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In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert.
Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt.
Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\
Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\
Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\
The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\
During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\
In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\
This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\
The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\
In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\
Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\
Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\
With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\
Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\
Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research.
Wilms tumor (WT) is the most common kidney cancer in childhood. It is a genetically heterogeneous tumor and several genetic alterations have been identified in WT patients. Recurrent mutations were found in the homeo-domain of SIX1 and SIX2 in high proliferative tumors (18.1% of the blastemal-type tumors) as well as in the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 (18.2% of the blastemal-type tumors), indicating a critical role of the SIX-SALL pathway and aberrant miRNA processing in WT formation. Underlined by the fact that a significant overlap between mutations in DROSHA and SIX1 was found, indicating a synergistic effect.
To characterize the in vivo role of DROSHA and SIX mutations during kidney development and their oncogenic potential, I analyzed mouse lines with either a targeted deletion of Drosha or an inducible expression of human DROSHA or SIX1 carrying a tumor-specific E1147K or Q177R mutation, respectively.
The DROSHA mutation E1147K was predicted to act in a dominant negative manner. Six2-cre mediated deletion of Drosha in nephron progenitors led to a lethal phenotype with apoptotic loss of progenitor cells and early termination of nephrogenesis. Mosaic deletions via Wt1-creERT2 resulted in a milder phenotype with viable offspring that developed proteinuria after 2-4 weeks, but no evidence of tumor formation. Activation of the DROSHA-E1147K transgene via Six2-cre, on the other hand, induced a more severe phenotype with apoptosis of progenitor cells, proteinuria and glomerular sclerosis. The severely growth-retarded mice died within the first two months. This strong phenotype was consistent with the predicted dominant-negative effect of DROSHA-E1147K.
Analysis of the SIX1-Q177R mutation suggested that the mutation leads to a shift in DNA binding specificity instead of a complete loss of DNA binding. This may end up in subtle changes of the gene regulatory capacity of SIX1. Six2-cre mediated activation of SIX1-Q177R lead to a viable phenotype with no alterations or shortened life span. Yet a global activation of SIX1-Q177R mediated by Zp3-cre resulted in bilateral hydronephrosis and juvenile death of the mice.
To mimic the synergistic effect of DROSHA and SIX1 mutations, I generated compound mutants in two combinations: A homozygous deletion of Drosha combined with an activation of SIX1-Q177R and a compound mutant with activation of DROSHA-E1147K and SIX1-Q177R. Each mouse model variant displayed new phenotypical alterations. Mice with Six2-cre mediated homozygous deletion of Drosha and activation of SIX1-Q177R were not viable, yet heterozygous deletion of Drosha and activation of SIX1-Q177R led to hydronephrosis, proteinuria and an early death around stage P28. Combined activation of DROSHA-E1147K and SIX1-Q177R under Six2-cre resulted in proteinuria, glomerulosclerosis and lesions inside the kidney. These mice also suffered from juvenile death. Both mouse models could confirm the predicted synergistic effect.
While these results underscore the importance of a viable self-renewing progenitor pool for kidney development, there was no evidence of tumor formation. This suggests that either additional alterations in mitogenic or antiapoptotic pathways are needed for malignant transformation, or premature loss of a susceptible target cell population and early lethality prevent WT formation.
Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Lungenfibrose in der Maus
(2019)
Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Fragestellungen vermitteln neue Kenntnisse über die Pathogenese der Lungenfibrose auf zellulärer Ebene. Bei der Lungenfibrose handelt es sich um eine chronische Erkrankung, die durch eine initiale Inflammation und das Auftreten von Myofibroblasten gekennzeichnet ist. Die Myofibroblasten führen zu einer vermehrten Produktion von EZM, was in einer Zerstörung der Lungenarchitektur, Narbenbildung und folglich einem verminderten Gasaustausch resultiert. Eine modulatorische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) bei der Entwicklung der Lungenfibrose wird vermutet, dennoch sind die Effektorzellen in der Lunge noch nicht bekannt.
Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Lokalisation des NO-Rezeptors, der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), in der Lunge untersucht. Dazu wurden Knockout-Mäuse generiert, bei denen die NO-GC global (GCKO) oder Perizyten-spezifisch (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO) deletiert ist. Zudem wurden tdTomato-Reportermäuse verwendet, die das Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines spezifischen Reporters exprimieren (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). In der Lunge sind Perizyten der NO-GC-exprimierende Zelltyp. Durch Immunhistochemie konnten zudem zwei verschiedene Subpopulationen von NO-GC-exprimierenden Perizyten identifiziert werden: Eine große Population an SMMHC/PDGFRβ-positiven Perizyten und eine kleine Population an NG2/PDGFRβ-positiven Perizyten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der NO-GC während der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Bleomycin führt zu einer fibrotischen Antwort in allen Genotypen, was durch ein erhöhtes Lungengewicht und einen erhöhten Kollagengehalt deutlich wird. Der Schweregrad der Lungenverletzung ist in NO-GC-defizienten Mäusen größer als in Anwesenheit der NO-GC. Dies deutet auf eine Rolle der NO-GC bei der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin.
Während der Entstehung der Lungenfibrose kommt es zur Bildung von Myofibroblasten, die als die Schlüsselzellen der Wundheilung und fibrotischer Prozesse bezeichnet werden. Diese Zellen kommen unter physiologischen Bedingungen kaum vor und ihre Herkunft ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Da Perizyten als mögliche Vorläuferzellen betrachtet werden, wurde Lineage Tracing von Perizyten durchgeführt. Erstmals wurden zwei verschiedene Myofibroblasten-Subtypen durch die Expression von NO-GC unterschieden: (1) NO-GC-positive Myofibroblasten, die in der Alveolarwand lokalisiert sind und von Perizyten abstammen und (2) NO-GC-negative Myofibroblasten, die sich innerhalb der Alveolen befinden, deren Ursprung jedoch nicht Perizyten sind. Diese Myofibroblasten zeigen jedoch eine de novo-Synthese von PDGFRβ. Durch Lineage Tracing-Versuche sowie immunhistochemische Analysen können Perizyten, Endothelzellen und Fibrozyten als Vorläuferzellen ausgeschlossen werden. Die Ursprungszelle der intra-alveolären Myofibroblasten ist somit bislang nicht identifiziert.
Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle der an der Lungenfibrose beteiligten Zelltypen näher untersucht. Dazu wurde die Auflösung der reversiblen Bleomycin-induzierten Lungenschäden betrachtet. Der Verlust der beiden Myofibroblasten-Subtypen weist darauf hin, dass sie zwar die Effektorzellen der Wundheilungsreaktion, jedoch nicht an der Entstehung der chronisch manifesten Fibrose beteiligt sind. Perizyten proliferieren in Folge der Gabe von Bleomycin und sind vermehrt im Lungenparenchym auch nach Auflösung der Bleomycin-induzierten Lungenverletzung vorzufinden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass es sich hierbei um die Effektorzellen der chronisch manifesten Lungenfibrose handelt, die durch eine Verdickung der Alveolarwand gekennzeichnet ist. Um die zellulären Mechanismen der Lungenfibrose umfassend aufzuklären, müssen weitere Untersuchungen an irreversiblen Fibrosemodellen folgen, die auch die chronischen Charakteristiken der Erkrankung berücksichtigen.