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Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gefäßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder Stützgewebe ersetzt, dabei übernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten.
Durch ihre erhöhte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets für die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es ermöglicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein.
Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer für die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. klären zu können.
Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die für APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer für die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erhöhte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ höher als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im ischämischen Bereich war deutlich höher als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-Färbung.
Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antikörper bestätigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus.
Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoesäuren dargestellt. Zusätzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten.
Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivität gegenüber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich für einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET.
Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte über Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden.
Trotz der relativ niedrigen Affinität für FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der ischämischen Zone wurde im Anschluss durch HE-Färbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der ischämischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein für den gewünschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt.
Durch die Verwendung radioaktiver Substanzen mit ihrer schädigenden Wirkung auf den menschlichen Körper besteht in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ein fortwährendes Interesse an der Reduktion der applizierten Dosis bei gleichbleibender Qualität der Ergebnisse. Zusätzlich ist im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Systeme eine Reduktion sowohl der Akquisitions- als auch der Rekonstruktionszeit erstrebenswert. In dieser Arbeit werden zwei Möglichkeiten vorgestellt, diese Ziele durch den Einsatz von Compressed Sensing (CS) zu erreichen.
Neben der Entwicklung neuartiger Rekonstruktionsalgorithmen können Filtertechniken eingesetzt werden, um eine qualitative Verbesserung rekonstruierter Bilder zu erzielen. Der Vorteil eines Filters besteht unter anderem darin, dass diese retrospektiv angewandt werden können. Es ist folglich möglich, die Qualität eines Bildes zu überprüfen und lediglich im Bedarfsfall einen Filter einzusetzen.
Die Technik des CS war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten im Bereich der Bildgebung, insbesondere in der Magnetresonanztomographie und der Computertomographie (CT). Mit CS könnten bildgebende Verfahren wie die CT oder die PET mit weniger Messungen durchgeführt werden, wodurch sich die Messzeit und die Strahlenexposition reduziert. In der molekularen Bildgebung mit der PET ist CS jedoch weitgehend unbekannt.
Im ersten Teil dieser Dissertation wird eine Methode vorgestellt, welche CS als Filtertechnik in der PET einsetzt. Den Ausgangspunkt stellt ein vollständiger, analytisch rekonstruierter Datensatz dar. Dieser wird mit einer Reihe unterschiedlicher Abtastmuster retrospektiv unterabgetastet und jeweils erneut, unter Verwendung von CS rekonstruiert. Im rauschfreien Fall würde CS stets das Originalbild liefern. Das überlagerte Rauschen führt jedoch zu Artefakten und einer Verschlechterung des Ergebnisses. CS kann nun einerseits das Rauschen vermindern. Andererseits ist es durch die Mittelung mehrerer unterschiedlicher Rekonstruktionen möglich, die Artefakte zu reduzieren. Auf diesem Weg kann die Bildqualität signifikant verbessert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Technik sowohl für 2D, als auch für 3D Datensätze verwendet werden kann. Die größten qualitativen Verbesserungen werden erzielt, wenn der Datensatz lediglich aus wenigen Ereignissen besteht. In diesem Fall ist die Bildqualität der analytischen Rekonstruktionen extrem schlecht, die Verbesserung durch die Filtertechnik mit CS und die damit verbundene Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses jedoch am größten. Bei diesen Datensätzen können die Ergebnisse iterativer Rekonstruktionen übertroffen werden. In der Praxis wäre damit ein Einsatz speziell bei dynamischen oder getriggerten Aufnahmen denkbar. In beiden Fällen basieren die Rekonstruktionen nicht selten auf wenigen Ereignissen. Die resultierenden Bilder sind häufig von schlechter Qualität, womit eine Verbesserung durch Filterung sinnvoll ist.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rohdaten-basierten Triggerung am Kleintier-PET sowie mit dem Einsatz von CS zur Reduktion der Rekonstruktionszeit. Frühere Veröffentlichungen zeigten bereits die Anwendbarkeit Rohdaten-basierter Triggermethoden bei humanen Datensätzen. Im Hinblick auf eine präklinische Anwendung, speziell bei Datensätzen mit dem Fokus auf Mäuseherzen, existieren jedoch nur wenige Studien. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die segmentierte Methode des Massenschwerpunkts (COMseg) eine Technik darstellt, welche die kardiale Triggerung sowohl bei Datensätzen von Ratten, als auch von Mäusen erlaubt.
Ein nicht zu unterschätzender Nachteil der COMseg besteht darin, dass vor deren Anwendung die List-Mode Datei in kleine Zeitframes unterteilt und in Sinogramme sortiert werden muss. Auf jedes Sinogramm wird im Anschluss ein Rebinning Algorithmus angewandt. Dies stellt einen enormen Zeitaufwand dar, wodurch sich eine Anwendung bei größeren Studien in der Praxis als schwierig erweist. Ziel der Triggermethoden ist die Gewinnung eines Triggersignals, durch welches beispielsweise der Herzschlag in mehrere Phasen aufgeteilt werden kann. Das Triggersignal hat für gewöhnlich eine dünnbesetzte Repräsentation im Frequenzraum. Dieses Vorwissen ermöglicht den Einsatz von CS. Anstelle des vollständigen Datensatzes wurde lediglich ein Teil der Daten in kleine Zeitframes sortiert und mit der COMseg ausgewertet. Aus diesem unterabgetasteten Datensatz wird mit Hilfe von CS das vollständige Triggersignal rekonstruiert. Die Stärke der Unterabtastung entspricht in etwa dem Faktor der Reduktion der Rekonstruktionszeit. Auf diesem Weg ist es möglich, eine signifikante Beschleunigung zu erzielen. Die Anwendung dieser Technik ist jedoch nicht auf die COMseg beschränkt. Prinzipiell kann das Verfahren bei allen Methoden der Rohdaten-basierten Triggerung angewandt werden, welche es erlauben, die Abtastpunkte des Signals separat zu berechnen. Damit werden Algorithmen interessant, deren Einsatz aufgrund aufwändiger Berechnungen bislang in der Praxis nicht sinnvoll war.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten nahe, dass CS ein neuartiges Werkzeug in der PET darstellen könnte, mit welchem eine Filterung von Bildern sowie eine Reduktion der Rekonstruktionszeit möglich ist.
FAPα ist ein Membranglykoprotein mit Dipeptidyl-Peptidase- und Typ I Kollagenase-Aktivität, das eine wichtige Rolle im Rahmen des Gewebeumbaus und der Angiogenese spielt. Die Expression von FAPα wurde für eine Reihe von Geweben gezeigt. So konnte bereits gezeigt werden, dass FAPα nach Myokardinfarkt auf humanen kardialen Fibroblasten (HCF) verstärkt exprimiert wird. Ausgehend von der Erkenntnis, dass eine im Blut zirkulierende Form von FAPα, APCE, gefunden wurde, sollte in der vorliegenden Arbeit eine mögliche Assoziation des in HCF exprimierten FAPα mit dem zirkulierenden APCE untersucht werden. Hierfür wurden ebenfalls die Signalwege, die zur Induktion von FAPα führen, näher untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das von humanen kardialen Fibroblasten exprimierte FAPα ebenfalls im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden kann. Wie bereits beschrieben, führte eine Stimulation mit TGFβ1 zur Expression von FAPα. Diese ist abhängig von Smad-3 und konnte durch Zugabe des Inhibitors SB431542 blockiert werden. Auch Smad-2 scheint die FAPα-Expression zu beeinflussen. Ein Effekt von EGR-1, CTGF und TNFα auf die FAPα-Expression konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein ELISA zur Messung von humanem FAPα im Plasma erstmalig etabliert. In der Evaluation des ELISA wurden die Grenzwerte für die Detektion und Quantifizierung bestimmt, die Intra- und Intervariabilität des ELISAs berechnet und die Linearität der Wiederfindung von humanem rekombinantem FAPα bewertet, sowie die Stabilität von FAPα nach mehrfachen Einfrier-Auftau-Zyklen und nach der Lagerung bei verschiedenen Temperaturen evaluiert. Da hier nur kommerziell erwerbliche Materialien verwendet wurden, ist eine Anwendung durch Dritte leicht durchführbar. Es wurde weiterhin eine klinische Studie zur Messung der FAPα-Plasmaspiegel in 101 gesunden Blutspendern und 407 Patienten mit akutem Koronarsyndrom (ACS) sowie von 25 Patienten mit stabiler koronarer Herzerkrankung (KHK) durchgeführt. Hierbei konnten erstmals Referenzwerte für zirkulierendes FAPα im Plasma beschrieben werden. Die FAPα-Plasmaspiegel der gesunden Kontrollgruppe unterschieden sich nicht von denen der Patienten mit stabiler KHK. Bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom war die FAPα-Konzentration im Vergleich mit den FAPα-Plasmaspiegeln der Kontrollgruppe hingegen signifikant erniedrigt. Auch zeigte sich bei den Patienten mit FAPα-Spiegeln im kleinsten Quartil eine erhöhte Mortalität. Die biologische Funktion von FAPα bzw. dessen mögliche Pathophysiologie im Rahmen eines ACS sowie die mit niedrigen FAPα-Spiegeln assoziierte Mortalität sind noch unklar und bleiben Gegenstand der weiteren Forschung.