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Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation.
Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden.
Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert.
Die Prävalenz von Infektionen mit Neisseria gonorrhoeae (NG) bei HIV-positiven Patientinnen und Patienten einer auf HIV-Infektionen spezialisierten Klinik in Mwanza im Nordwesten Tansani- as erwies sich mit 0,4% bei Männern und 3,9% bei Frauen als relativ niedrig. In dieser aktuellen Studie gab es unter Verwendung molekularer Antibiotikaresistenz(AMR)-Tests keine Hinweise auf eine Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation. Weitere Kontrollen und Entwicklungen von NG- und AMR-Tests müssen implementiert werden. Molekulare Diagnoseverfahren auf der Basis von Urinproben als diagnostisches Material zum Nachweis von NG weisen wesentliche Vorteile für das Screening auf. Die Durchführung eines Urinstreifentests hatte keinen positiven Vorhersagewert bezüglich einer Infektion mit NG oder einer AMR. Künftige Untersuchungen sind anzuregen, um einerseits eine exaktere Angabe der Prävalenzraten und Risikofaktoren von Infektionen mit NG sowie deren Resistenzlage zu ermöglichen und andererseits eine effizientere Versorgung bzw. Behandlung der Gonorrhoe gewährleisten zu können.
The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system.
Die Inzidenz invasiver H. influenzae-Infektionen in Deutschland steigt seit Jahren an. Die akkurate Identifizierung und Resistenztestung dieses Erregers sind von großer klinischer und epidemiologischer Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit umfangreiche Untersuchungen zur Diagnostik und zur Epidemiologie von Antibiotikaresistenzen bei H. influenzae durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass die in der Routinediagnostik mittlerweile weit verbreitete MALDI-TOF-MS-Diagnostik durch das VITEK MS IVD nur eingeschränkt zur sicheren Unterscheidung von H. influenzae und H. haemolyticus einsetzbar ist. H. influenzae-Isolate erkannte das System mit einer Genauigkeit von 100 %. Bei H. haemolyticus-Isolaten wurden dagegen 42 % der untersuchten Stämme fälschlicherweise als H. influenzae erkannt. Dieser Fragestellung wurde mit der bisher umfangreichsten molekularbiologisch charakterisierten Studienpopulation beider Bakterienspezies nachgegangen.
Die kalkulierte antibiotische Therapie einer Sepsis oder Meningitis erfolgt häufig mit Carbapenemen, die leitliniengerechte Therapie invasiver H. influenzae-Infektionen mit Drittgenerations-Cephalosporinen. Imipenem und Cefotaxim gehören zu den Hauptvertretern dieser Gruppen. Bezüglich der Antibiotikaresistenztestung wurde erstmalig für H. influenzae herausgefunden, dass die routinemäßig verwendete Gradientenagardiffusion (GAD) bei der Testung von Cefotaxim im Vergleich zum Goldstandard Bouillon-Mikrodilution gleichwertig und bei Imipenem sogar sensitiver in der Detektion von Heteroresistenzen ist.
Die Epidemiologie dieser Resistenzen wurde in dieser Arbeit erstmalig für Deutschland systematisch erfasst, indem alle verfügbaren invasiven Isolate gemeldeter H. influenzae-Infektionen der Jahre 2016 (Imipenem) beziehungsweise 2016-2019 (Cefotaxim) untersucht wurden. Es wurde eine hohe Prävalenz einer Imipenem-Resistenz von 13,5 % festgestellt. Die Prävalenz einer Cefotaxim-Resistenz lag bei 0,9 %.
Zur molekularen Typisierung wurde bei den Imipenem-resistenten Isolaten eine Multilocus-Sequenztypisierung, bei den Cefotaxim-resistenten Stämmen eine Sequenzierung des vollständigen Genoms durchgeführt. Hierbei wurde eine hohe genetische Diversität der Stämme festgestellt, was die Schlussfolgerung zulässt, dass resistente Mutanten sporadisch entstehen. Die Untersuchung möglicher spatio-temporaler Cluster führte zum Nachweis einer sehr selten vorkommenden Übertragung eines Imipenem-resistenten Stamms. Durch die Sequenzierung von Resistenzgenen wurde die Epidemiologie und Relevanz bekannter Aminosäuresubstitutionen beleuchtet. Unter anderem wurde für die PBP3-Substitutionen L389F und Y557H eine hochsignifikante Korrelation mit dem Auftreten von Cefotaxim-Resistenzen nachgewiesen. Die gewonnenen Genomdaten bieten die Grundlage für die Forschung an weiteren Antibiotikaresistenzdeterminanten von H. influenzae.
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin.
Trotz der rasanten Entwicklung molekulargenetischer Analysemethoden sind die Auslöser vieler Erbrankheiten bislang ungeklärt. Eine Identifikation der genetischen Ursache einer Erkrankung ist jedoch essenziell, um zusätzliche invasive Tests vermeiden, adäquate Therapiemaßnahmen in die Wege leiten, akkurate Prognosen stellen und eine entsprechende genetische Beratung anbieten zu können. Next Generation Sequencing (NGS)-basierte Techniken wie die Whole Exome Sequenzierung (WES) haben die humangenetische Forschung und Diagnostik in den letzten Jahren revolutioniert. Die WES ermöglicht die Sequenzierung der Exons aller proteincodierenden Gene von mehreren Individuen gleichzeitig und stellt ein hilfreiches Werkzeug bei der Suche nach neuen kranheitsrelevanten Genen im Menschen dar.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung genetischer Ursachen verschiedenster Erkrankungen in konsanguinen Familien aus dem nahen und mittleren Osten mittels WES. Insgesamt wurden 43 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern untersucht, darunter viele mit Skelettdysplasien oder Neuropathien. In 22 Fällen (51%) konnte die entsprechende krankheitsverursachende Mutation ausfindig gemacht werden. In 21% der aufgeklärten Fälle wurden Sequenzvarianten detektiert, die in der Literatur bereits als pathogen beschrieben wurden, während 63% bisher noch unbekannte Mutationen in bereits als krankheitsrelevant beschriebenen Genen darstellten. Zudem konnten im Rahmen dieser Arbeit drei neue, für den Menschen krankheitsrelevante Gene identifiziert werden, solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) und MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 codiert für einen Transporter aus der Familie der solute carrier, der in der Plasmamembran verankert ist. In dieser Arbeit geleistete Analyseergebnisse konnten zu der Erstbeschreibung von homozygoten pathogenen SLC10A7-Mutationen als Ursache für eine Skelettdysplasie mit Amelogenesis imperfecta beitragen. Bei TBX4 handelt es sich um einen hochkonservierten Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung an der Ausbildung der unteren Extremitäten beteiligt ist. Homozygote pathogene TBX4-Mutationen wurden im Kontext dieser Arbeit erstmalig mit einer posterioren Amelie mit Becken- und Lungenhypoplasie in Verbindung gebracht. MIA3 ist ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das eine essenzielle Rolle bei der Proteinsekretion spielt. Die hier vorgestellten Patienten mit homozygoten pathogenen MIA3-Mutationen zeigen eine komplexe syndromale Erkrankung, die sich hauptsächlich in einer Kollagenopathie, Diabetes mellitus und milder mentaler Retardierung manifestiert und ein neues Krankheitsbild darstellt.
Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erweitern somit zum einen das Mutationsspektrum verschiedener bekannter Krankheitsbilder und offenbaren zum anderen neue krankheitsrelevante Gene im Menschen.
The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo.
Die Analatresie ist ein Krankheitsbild, das durch einen blind endenden Enddarm ohne Ausbildung eines Anus gekennzeichnet ist.
Die Diagnostik erfolgt zunächst durch Blickdiagnose und im Weiteren durch bild¬gebende Verfahren, wie zum Beispiel Sonographie und Röntgen.
Die Prognose ist je nach Schwere der Fehlbildung unterschiedlich, jedoch ist eine chirurgische Intervention alternativlos und immer zwingend erforderlich.
In den vorliegenden Fällen wurde die operative Behandlung der Analatresie aus¬schließlich mit der Durchzugsoperation nach Pena durchgeführt, die bei der über¬wiegenden Zahl der Fälle keine Folgeoperation notwendig machte.
Postoperativ kann es trotz regelrecht verlaufener Operation zu Obstipationen und Stuhlinkontinenz kommen. Diese Unfähigkeit einer geregelten Stuhlaus-schei¬dung verringert die Lebensqualität, da die Kinder mit Analatresien häufig Ein¬schränkungen in ihrem Alltag haben.
Mit dem, im Rahmen dieser Arbeit entwickelten, Fragebogen sollte er¬mittelt werden, wie sich die Lebensqualität der Patienten nach der Operation der Analatresie darstellt.
Dazu wurde der Fragebogen auf Basis verschiedener Scores zur Be¬stimmung des Verstopfungsgrades (CCCS), der Stuhlinkontinenz (CCCS) und der Lebensqualität (EQ-5D, EQ-VAS) um individuelle Fragestellungen erweitert.
Aus dem 55 Patienten umfassenden Patientenpool antworteten 31 mit einem vollständig ausgefüllten Fragebogen.
Im Unterschied zu den Leitlinien der Gesellschaft für Kinderchirurgie, die eine Häufung der Analatresie bei männlichen Patienten beschreibt, wurde in der vor¬liegenden Studie eine Häufung bei weiblichen Betroffenen festgestellt.
Insgesamt ergab die Auswertung des Fragebogens, dass die Behand¬lung in den meisten Fällen eine hohe Lebensqualität, begleitet von einem ge¬ring-gradigen Fortbestehen von Verstopfung und Stuhlinkontinenz, zur Folge hat.
Leider nutzen nur wenige Patienten die ärztliche Nachsorge sowie das Training des Beckenbodens zur Verbesserung der Stuhlkontinenz.
Die Inanspruchnahme einer gezielten Physiotherapie zur Kräftigung des Becken¬bodens ist erfahrungsgemäß nicht nur wegen der Stuhlkontinenz, sondern auch wegen der erzielbaren Stuhlkontrolle, unverzichtbar.
Die Ergebnisse des Fragebogens sind unter Berücksichtigung der Sub-jektivität der Angaben der Betroffenen zu werten. Insofern sollte in Folge-studien darauf geachtet werden, dass die Befragung auch unter Verwendung weiterer Scores und gegebenenfalls nicht im häuslichen Bereich, sondern unter geschul¬ter Moderation im Rahmen von Nachsorgeterminen, erfolgt.
Als wesentliches Ergebnis der Arbeit ist festzuhalten, dass nach der Operation der Analatresie eine Begleitung der betroffenen Kinder bis zum Erwachsenenal¬ter aufgelegt werden sollte, um nicht nur das Darm-Management zu verbessern, sondern vor allem auch die psychologische Betreuung der Patienten und deren Familien zu gewährleisten.
Zur Verifizierung der Daten sollte der Fragebogen auch in anderen Kli¬niken zur Anwendung kommen, um eine größere Kohorte und damit eine hö¬here statistische Sicherheit zu erreichen.