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Die Entwicklung des Schädeldachs beginnt beim Menschen bereits in der frühen Embryogenese und ist erst im Erwachsenenalter abgeschlossen. Das Wachstum der Schädelknochen muss sich während der Entwicklung fortwährend dem Gehirnwachstum anpassen. An den Stellen, wo zwei Schädelknochen aufeinandertreffen, formen sich Schädelnähte, die aus mesenchymalem Bindegewebe bestehen und als Wachstumsfugen des Schädels dienen. Tritt eine frühzeitige Verknöcherung innerhalb einer oder mehrerer Schädelnähte auf, spricht man von einer Kraniosynostose. Als Konsequenz wird ein weiteres Knochenwachstum verhindert, sodass sich das Neurokranium in dieser Region nicht dem expansiven Wachstum des Gehirns anpassen kann. Dies geht in der Regel mit einem kompensatorischen Wachstum des Schädels und infolgedessen mit kraniofazialen Dysmorphien und einem erhöhten intrakraniellen Druck einher. Klinische Studien und Forschungen an Modellorganismen konnten bereits eine Vielzahl an Genen mit der Entstehung von Kraniosynostosen assoziieren, darunter die Transkriptionsfaktoren TCF12 und TWIST1. Beim Menschen sind heterozygote Mutationen in TCF12 und TWIST1 mit Kraniosynostosen der Koronarnaht assoziiert. Bei Mäusen hingegen führt eine heterozygote Tcf12 Mutation nur in Kombination mit einer heterozygoten Twist1 Mutation zu Fusionen der Koronarnaht.
Der Zebrabärbling (Danio rerio, überwiegend auch Zebrafisch genannt) weist eine bemerkenswerte Ähnlichkeit bezüglich der Anatomie und Morphologie des Schädeldachs zum Menschen auf. Um die genaue Funktion von TCF12 bei der Ausbildung der Schädelnähte zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Zebrafisch als in vivo Modell für die Entstehung tcf12-induzierter Kraniosynostosen etabliert. Zu Beginn der Arbeit wurde das Expressionsmuster von tcf12 über die Entwicklung hinweg analysiert. Ein besonderer Fokus lag dabei auf einem Expressionsnachweis während der Entwicklung der Schädelplatten und der Schädelnähte. Ein erster Expressionsnachweis von tcf12 mittels PCR-Analysen und Whole-mount RNA in-situ Hybridisierungen zeigte eine breite Expression von tcf12 ab dem 1-3 Somiten Stadium an. Für tiefergehende in vivo Analysen wurden im Zuge dieser Arbeit tcf12:EGFP Reportergenlinien generiert. Mit diesen gelang ein Nachweis der tcf12 Expression entlang der Wachstumsfronten der Schädelplatten, innerhalb der Schädelnähte sowie im Periost und der Dura mater.
Mit den tcf12:EGFP Fischen als Referenz wurde in weiterführenden Experimenten die Aktivität drei hochkonservierter CNEs (engl. conserved non-coding elements) in vivo im Zebrafisch untersucht. Zwei der CNEs konnten als tcf12 Enhancer verifiziert werden, die eine Genexpression während der Neurogenese des zentralen Nervensystems (ZNS) steuern. Die beiden Enhancer-Elemente zeichnen sich durch eine hohe Konservierung vom Menschen bis hin zum Zebrafisch aus.
Aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität gegenüber einem Funktionsverlust von TCF12 und TWIST1 in Mensch und Maus sollte die Auswirkung eines Knockouts der orthologen Gene auf die Entwicklung der Schädelnähte des Zebrafisches untersucht werden. Mittels CRISPR/Cas9 wurden verschiedene Knockout-Linien für die Gene tcf12, twist1a und twist1b generiert. Analysen der Knockoutmutanten zeigten, dass ein heterozygoter Verlust von tcf12 und twist1b in seltenen Fällen zu partiellen Fusionen der Koronarnähte im Zebrafisch führt. Des Weiteren konnte bei tcf12 und twist1b Einzel- und Doppelmutanten ein abnormes Wachstum der Schädelplatten im Bereich der Suturen beobachtet werden. Die Expressionsstudien und die Analysen der Knockoutmutanten deuten auf eine Regulation von TCF12 bei der Differenzierung der Stammzellen sowie der Proliferation der Osteoblasten innerhalb der Schädelnähte hin.
Um die Auswirkung von TCF12 Mutationen auf funktioneller Ebene zu untersuchen wurden im Verlauf dieser Arbeit Luciferase-Reporter Assays durchgeführt. Anhand dieser konnte nachgewiesen werden, dass Mutationen, die die basic helix-loop-helix (bHLH)-Domäne beeinträchtigen, die Transaktivierungsfähigkeit von TCF12 aufheben. Co-Transfektions-Experimente mit TWIST1 offenbarten eine Regulation der Transaktivierung von TCF12 durch TWIST1, sowohl im Menschen, als auch im Zebrafisch. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die genauen Expressionsorte von TCF12 während der Morphogenese des Schädeldachs nachgwiesen und die Funktion von TCF12 und seinem Interaktionspartner TWIST1 bei der Entstehung von Kraniosynostosen weiter aufgeklärt werden.
Regulatory T cells (Tregs) are the masters of immune regulation controlling inflammation and tolerance, tissue repair and homeostasis. Multiple immunological diseases result from altered Treg frequencies and Treg dysfunction. We hypothesized that augmenting Treg function and numbers would prevent inflammatory disease whereas inhibiting or depleting Tregs would improve cancer immunotherapy.
In the first part of this thesis, we explored whether in vivo activation and expansion of Tregs would impair acute graft-versus-host disease (aGvHD). In this inflammatory disease, Tregs are highly pathophysiological relevant and their adoptive transfer proved beneficial on disease outcome in preclinical models and clinical studies. IL-2 has been recognized as a key cytokine for Treg function. Yet, attempts in translating Treg expansion via IL-2 have remained challenging, due to IL-2s extremely broad action on other cell types including effector T cells, NK cells, eosinophils and vascular leakage syndrome, and importantly, due to poor pharmacokinetics in vivo. We addressed the latter issue using an IL-2-IgG-fusion protein (irrIgG-IL-2) with improved serum retention and demonstrated profound Treg expansion in vivo in FoxP3-luciferase reporter mice. Further, we augmented Treg numbers and function via the selective-TNF based agonists of TNFR2 (STAR2). Subsequently, we tested a next-generation TNFR2 agonist, termed NewSTAR, which proved even more effective. TNFR2 stimulation augmented Treg numbers and function and was as good as or even superior to the IL-2 strategy. Finally, in a mouse model of aGvHD we proved the clinical relevance of Treg expansion and activation with irrIgG-IL-2, STAR2 and NewSTAR. Notably, the TNFR2 stimulating constructs were outstanding as we observed not the IL-2 prototypic effects on other cell populations and no severe side effects.
In the second part of this thesis, we explored Tregs in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and developed targeting strategies. Among several tumor entities in which Tregs impact survival, preclinical and clinical data demonstrated their negative role on PDAC. In our studies we employed the orthotopic syngeneic Panc02 model in immunocompetent mice. Based on flow cytometric analysis of the tumor microenvironment we propose TIGIT and TNFRSF members as novel therapeutic targets. Surprisingly, we found that blocking TNFR2 did not interfere with intratumoral Treg accumulation. However, we decreased the highly abundant intratumoral Tregs when we disrupted the tumor extracellular matrix. In PDAC, Treg manipulation alone did not lead to tumor regression and we propose that an additional immune boost may be necessary for efficient tumor immune surveillance and cancer clearance. This contrasts with aGvHD, in which Treg manipulation alone was sufficient to improve disease outcome.
Conclusively, we demonstrated the enormous medical benefit of Treg manipulation. Our promising data obtained with our newly developed powerful tools highlight the potential to translate our findings into clinical practice to therapeutically target human Tregs in patients. With novel TNFR2 agonists (STAR2, NewSTAR) we augmented Treg numbers and function as (or even more) effectively than with IL-2, without causing adverse side effects. Importantly, exogenous in vivo Treg expansion protected mice from aGvHD. For the therapy of PDAC, we identified novel targets on Tregs, notably TIGIT and members of the TNFRSF. We demonstrated that altering the extracellular tumor matrix can efficiently disrupt the Treg abundance in tumors. These novel targeting strategies appear as attractive new treatment options and they may benefit patients suffering from inflammatory disease and cancer in the future.