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Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht.
Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen.
Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen.
Diese Dissertation analysiert BMP2 und BMP2-Derivate als neue therapeutische Strategien für die Behandlung des Multiplen Myeloms (MM). Das MM ist eine maligne neoplastische Erkrankung des Knochenmarks mit Plasmazellvermehrung und erhöhten Leveln an Aktivin A im Blutserum, wobei eines der Hauptsymptome das Auftreten von schmerzvollen Osteolysen ist. In den letzten Jahren rückte Aktivin-A als interessantes Target zur Behandlung des Multiplen Myeloms in den Vordergrund. Die Reduzierung der Aktivin-A Level durch decoy-Rezeptoren führte zu einer signifikanten Verbesserung der Osteolysen und einem reduzierten Proliferationsverhalten der neoplastischen B-Zellen, sowohl im Tierexperiment als auch in Studien der klinischen Phase II. Die Aktivin-A-Antagonisierung ist somit ein neuer und vielversprechender Ansatz in der Therapie des Multiplen Myeloms.
Das Bone Morphogenetic Protein 2 ist aufgrund seiner molekularen und biologischen Eigenschaften ein interessantes Target für die Therapie des Multiplen Myeloms. Es ist auf molekularer Ebene ein Aktivin-A-Antagonist, besitzt aber auch osteoinduktives Potential und apoptotische bzw. anti-proliferative Eigenschaften auf neoplastische B-Zellen. Da die in der Literatur bereits beschriebenen, durch Mitglieder der TGF-β-Familie induzierten Apoptosemechanismen, noch nicht genauer untersucht waren, wurde in dieser Arbeit die BMP2-induzierte Apoptose in 10 unterschiedlichen humanen MM-Zellen analysiert. Erstens konnte dabei nachgewiesen werden, dass 7 von 10 Zelllinien nicht BMP2-responsiv waren. Eine genauere Untersuchung ergab, dass neben der Expression spezifischer BMP-Rezeptoren auch die Expression von inhibitorischen Smad-Proteinen über die BMP2-Responsivität entscheidet. Zweitens zeigte die genauere Analyse der Apoptosemechanismen, dass entgegen der in der Literatur publizierten Ergebnisse, BMP2 keine apoptotische Wirkung auf die von uns untersuchten Zelllinien hat. Mehrere verschieden durchgeführte Experimente, u.a. die Verwendung von spezifischen Inhibitoren des programmierten Zelltodes, unterstützen dieses Ergebnis und klassifizieren BMP2 als einen rein anti-proliferativen Faktor.
Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse von potentiellen Aktivin-A-Antagonisten in Form verschiedener BMP2- und GDF5-Derivate und inwiefern sie sich zum Einsatz in der Therapie des Multiplen Myeloms eignen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der einzelnen Mutanten wurden in verschiedenen Zellsystemen getestet. So konnte aufgezeigt werden, dass neben einer erhöhten biologischen Aktivität in Form eines gesteigerten osteoinduktiven und anti-proliferativen Potentials auf neoplastische B-Zellen (Superagonisten), sich die verschiedenen Derivate als Super-Antagonisten zu Aktivin A eignen und damit unterschiedlichen Ansprüchen der adjuvanten Therapie im Multiplen Myelom gerecht werden.
Oxylipine sind Signalmoleküle, die durch enzymatische Oxidation oder durch Autoxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren entstehen. Sie akkumulieren während einer Vielzahl von biotischen und abiotischen Stressen und spielen eine bedeutende Rolle bei der Abwehr verschiedener Stressoren. In vielen physiologischen Entwicklungsprozessen sind Oxylipine ebenfalls wichtig.
Eine bisher wenig erforschte Untergruppe dieser Oxylipine bilden reaktive elektrophile Spezies, die sog. RES-Oxylipine. Hierzu gehören unter anderem der Jasmonsäure-Vorläufer 12 Oxophytodiensäure (OPDA), aber auch (E)-2-Hexenal oder Phytoprostan A1 (PPA1). Diese Substanzen sind aufgrund einer α,β ungesättigten Carbonylgruppe elektrophil und damit chemisch reaktiv. Diese Reaktivität wird als Grund für ihre biologische Aktivität angesehen: RES-Oxylipine sind Induktoren einer Reihe von Genen. Allerdings ist bisher wenig über den Signalweg sowie die Funktionen der RES-Oxylipine in Arabidopsis thaliana bekannt.
Fast die Hälfte (40 %) aller durch OPDA-induzierten Gene in A. thaliana sind abhängig von TGA-Transkriptionsfaktoren, jedoch werden OPDA-responsive Hitzeschockgene (z.B. Hitzeschockproteine) unabhängig von TGA-Transkriptionsfaktoren induziert. Außerdem gibt es Hinweise auf eine Akkumulation des RES-Oxylipins OPDA, aber auch des non-RES-Oxylipins Jasmonsäure (JA) durch eine Behandlung mit 38° C in A. thaliana. Eine exogene Applikation von JA bewirkt jedoch, im Gegensatz zu OPDA, keine Genexpression von Hitzeschockgenen in Arabidopsis.
Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der RES-Oxylipine OPDA und Prostaglandin A1 (PGA1, ein Analogon zu PPA1) während der Hitzeschockantwort in Arabidopsis thaliana, sowie die TGA-unabhängige Signaltransduktion der Hitzeschockgene, aufzuklären.
Durch einen Vergleich zweier bereits veröffentlichter Transkriptomdaten in silico konnte die Überschneidung des Hitze-induzierten- (1 h, 37 °C) und des OPDA-induzierten-Transkriptoms (4 h, 75 µM) genau analysiert werden. Es werden 30 Gene sowohl von OPDA als auch durch 37 °C mehr als dreifach hochreguliert. Dieses Ergebnis konnte durch realtime qPCR vier repräsentativer Gene (HSP101, HSP26.5, DREB2A, HSFA2) bestätigt werden. Allerdings zeigten sich deutliche Unterschiede in der Stärke und Kinetik der Induktion: Hitze (37 °C) hat einen sehr viel stärkeren Einfluss auf die Hochregulation der Genexpression als die getesteten RES-Oxylipine OPDA und PGA1 (unter 10 % der Induktion durch 37 °C, Ausnahme DREB2A). Zudem resultiert eine Hitzebehandlung in einer schnellen und transienten Genexpression, das Maximum ist nach 1 bis 2 h erreicht während die Addition von RES-Oxylipinen eine langsamere Induktion der Genexpression bewirkt (Maximum nach 4 bis 6 h).
Eine Genexpressionsanalyse mit verschiedenen Signaltransduktionsmutanten half bei der Aufklärung möglicher Signaltransduktionskomponenten der RES-Oxylipine. So konnte gezeigt werden, dass der putative OPDA-Rezeptor Cyclophilin 20-3 sowie sein Interaktionspartner, das Protein Serin-Acetyltransferase 1, keine Bedeutung in der Regulation von Hitzeschockgenen durch RES-Oxylipine haben. Die Hitze-Masterregulatoren HSFA1 a,b,d (und e) jedoch sind für die Induktion der Hitzeschockgene HSP101, HSP26.5 und HSFA2 durch RES-Oxylipine essentiell und für DREB2A zumindest teilweise notwendig. Dennoch spielt der durch Hitze induzierbare Transkriptionsfaktor HSFA2 in der Signaltransduktion von RES-Oxylipinen (bezüglich der Hitzeschockgeninduktion) keine Rolle.
Durch ein Screening strukturell verschiedener RES hinsichtlich ihrer Induktion von HSP101 konnte geklärt werden, dass nicht die Anwesenheit einer α,β ungesättigten Carbonylgruppe, sondern vielmehr die Eigenschaft der Elektrophilie für die Induktion des HSP101 verantwortlich ist. Auch das RES Sulforaphan vermittelt, wie die RES-Oxylipine OPDA und PGA1, die Induktion der Hitzeschockgene über die HSFA1-Transkritionsfaktoren.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Quantifizierung der endogenen Oxylipine in zehn Tage alten Arabidopsis-Keimligen nach einer Hitzebehandlung unter Kurztag-Lichtbedingungen. Weder während eines kurzzeitigen Hitzestresses (bis zu 8 h) noch während einer längerfristigen Hitzebehandlung (bis zu 7 Tage) steigt der Gehalt des RES Oxylipins OPDA signifikant an. Das non-RES-Oxylipin Jasmonsäure hingegen akkumuliert transient (Maximum 2 h nach Beginn eines Hitzestresses) und signifikant, allerdings ist dieser Anstieg in seiner Stärke (13fach) nicht vergleichbar mit einer Akkumulation beispielsweise nach Verwundung (hier ist ein 1000facher Anstieg möglich).
In weiteren Experimenten wurde eine mögliche Korrelation der endogenen Oxylipin-Akkumulation (verursacht durch Verwundung oder osmotischen Stress) mit der Genexpression von Hitzeschockgenen untersucht. …
Ein Schlüsselereignis, welches dem prognosebestimmenden Organversagen bei systemi-schen Entzündungsprozessen und Sepsis vorangeht, ist die Entwicklung einer mikrovas-kulären endothelialen Schrankenstörung. Das vaskuläre endotheliale (VE-) Cadherin als mechanischer Stabilisator der Endothelbarriere spielt dabei eine wichtige Rolle. In der Inflammation werden Spaltprodukte von VE-Cadherin (sVE-Cadherin) gebildet. Ge-genstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Hypothese ob diese Spalt-produkte selbst an der Störung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt sind.
Es wurde hierfür humanes sVE-Cadherin bestehend aus den extrazellulären Domänen EC1-5 (sVE-CadherinEC1-5) generiert. In Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstands (TER), mit Immunfluoreszenzfärbungen und Western Blot Analysen wird gezeigt, dass sVE-Cadherin dosisabhängig die Barriere Integrität in primären humanen dermalen Endothelzellen stört. Dies führt zu einer Reduktion von VE-Cadherin und den assoziierten Proteinen α-, γ- und δ-Catenin und ZO-1, die nach der Applikation von sVE-Cadherin an den Zellgrenzen reduziert sind. Die Interaktion zwischen VE-PTP und VE-Cadherin wird durch sVE-CadherinEC1-5 reduziert. Durch pharmakologische Hem-mung der Phosphataseaktivität von VE-PTP mittels AKB9778 wird der durch sVE-CadherinEC1-5-induzierte Verlust der Endothelbarriere aufgehoben. Dagegen zeigt die direkte Aktivierung von Tie-2 mittels Angiopoetin-1 keinen protektiven Effekt auf die durch sVE-CadherinEC1-5 gestörte Endothelbarriere. Weitere Analysen zeigen eine erhöh-te Expression von GEF-H1 durch sVE-CadherinEC1-5. Diese ist ebenfalls durch AKB9778 hemmbar.
Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wurden die Konstrukte EC1-4 und EC3-5 in ver-schiedene Vektoren kloniert, um zu bestimmen, ob die extrazelluläre Domäne 5 von VE-Cadherin die dominante Rolle bei den sVE-Cadherin-vermittelten Effekten spielt.
Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen zum ersten Mal, dass sVE-CadherinEC1-5 unabhängig von proinflammatorischen Auslösern über die Aktivierung des VE-PTP/RhoA-Signalweges den Zusammenbruch der Endothelbarriere mitversursacht. Dies stellt einen neuen pathophysiologischer Mechanismus dar, der zum Gesamtverständnis der entzündungsinduzierten Barriereveränderungen des Endothels beiträgt.
Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert.
In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist.
Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente.
Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern.
The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood.
The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far.
Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation.
A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function.
Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation
(2021)
The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases.
For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R.
This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist.
For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability.
The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab.
Antikörper, die Oberflächenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antikörper in diesen Bereichen eingesetzt werden können, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antikörpers oder auch eines Antikörperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierfür werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verfügbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zelluläre Einflüsse, die die Bindungseigenschaften der Antikörper beeinflussen, nicht berücksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren für zelluläre Bindungsstudien können problematisch sein, da sie meist auf Antikörpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führen kann. Außerdem zeigen solche Antikörper häufig keine einheitliche Stöchiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten Fällen nicht gewährleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig.
Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antikörpers 18D1 Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antikörpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivität der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abhängig ist von der Oligomerisierung über Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antikörper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A übertragen. GpL-Fusionsproteine der Antikörper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Veränderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was für eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antikörper-Fusionsproteinen spricht.
Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antikörperkette eine sehr gute Möglichkeit darstellt, Antigen-Antikörper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antikörpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivität. Außerdem könnte dieses Antikörper-Fusionsproteinformat zukünftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivität benötigt werden würde.
In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht.
In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte.
Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie.
Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen.
Die Entwicklung des Schädeldachs beginnt beim Menschen bereits in der frühen Embryogenese und ist erst im Erwachsenenalter abgeschlossen. Das Wachstum der Schädelknochen muss sich während der Entwicklung fortwährend dem Gehirnwachstum anpassen. An den Stellen, wo zwei Schädelknochen aufeinandertreffen, formen sich Schädelnähte, die aus mesenchymalem Bindegewebe bestehen und als Wachstumsfugen des Schädels dienen. Tritt eine frühzeitige Verknöcherung innerhalb einer oder mehrerer Schädelnähte auf, spricht man von einer Kraniosynostose. Als Konsequenz wird ein weiteres Knochenwachstum verhindert, sodass sich das Neurokranium in dieser Region nicht dem expansiven Wachstum des Gehirns anpassen kann. Dies geht in der Regel mit einem kompensatorischen Wachstum des Schädels und infolgedessen mit kraniofazialen Dysmorphien und einem erhöhten intrakraniellen Druck einher. Klinische Studien und Forschungen an Modellorganismen konnten bereits eine Vielzahl an Genen mit der Entstehung von Kraniosynostosen assoziieren, darunter die Transkriptionsfaktoren TCF12 und TWIST1. Beim Menschen sind heterozygote Mutationen in TCF12 und TWIST1 mit Kraniosynostosen der Koronarnaht assoziiert. Bei Mäusen hingegen führt eine heterozygote Tcf12 Mutation nur in Kombination mit einer heterozygoten Twist1 Mutation zu Fusionen der Koronarnaht.
Der Zebrabärbling (Danio rerio, überwiegend auch Zebrafisch genannt) weist eine bemerkenswerte Ähnlichkeit bezüglich der Anatomie und Morphologie des Schädeldachs zum Menschen auf. Um die genaue Funktion von TCF12 bei der Ausbildung der Schädelnähte zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Zebrafisch als in vivo Modell für die Entstehung tcf12-induzierter Kraniosynostosen etabliert. Zu Beginn der Arbeit wurde das Expressionsmuster von tcf12 über die Entwicklung hinweg analysiert. Ein besonderer Fokus lag dabei auf einem Expressionsnachweis während der Entwicklung der Schädelplatten und der Schädelnähte. Ein erster Expressionsnachweis von tcf12 mittels PCR-Analysen und Whole-mount RNA in-situ Hybridisierungen zeigte eine breite Expression von tcf12 ab dem 1-3 Somiten Stadium an. Für tiefergehende in vivo Analysen wurden im Zuge dieser Arbeit tcf12:EGFP Reportergenlinien generiert. Mit diesen gelang ein Nachweis der tcf12 Expression entlang der Wachstumsfronten der Schädelplatten, innerhalb der Schädelnähte sowie im Periost und der Dura mater.
Mit den tcf12:EGFP Fischen als Referenz wurde in weiterführenden Experimenten die Aktivität drei hochkonservierter CNEs (engl. conserved non-coding elements) in vivo im Zebrafisch untersucht. Zwei der CNEs konnten als tcf12 Enhancer verifiziert werden, die eine Genexpression während der Neurogenese des zentralen Nervensystems (ZNS) steuern. Die beiden Enhancer-Elemente zeichnen sich durch eine hohe Konservierung vom Menschen bis hin zum Zebrafisch aus.
Aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität gegenüber einem Funktionsverlust von TCF12 und TWIST1 in Mensch und Maus sollte die Auswirkung eines Knockouts der orthologen Gene auf die Entwicklung der Schädelnähte des Zebrafisches untersucht werden. Mittels CRISPR/Cas9 wurden verschiedene Knockout-Linien für die Gene tcf12, twist1a und twist1b generiert. Analysen der Knockoutmutanten zeigten, dass ein heterozygoter Verlust von tcf12 und twist1b in seltenen Fällen zu partiellen Fusionen der Koronarnähte im Zebrafisch führt. Des Weiteren konnte bei tcf12 und twist1b Einzel- und Doppelmutanten ein abnormes Wachstum der Schädelplatten im Bereich der Suturen beobachtet werden. Die Expressionsstudien und die Analysen der Knockoutmutanten deuten auf eine Regulation von TCF12 bei der Differenzierung der Stammzellen sowie der Proliferation der Osteoblasten innerhalb der Schädelnähte hin.
Um die Auswirkung von TCF12 Mutationen auf funktioneller Ebene zu untersuchen wurden im Verlauf dieser Arbeit Luciferase-Reporter Assays durchgeführt. Anhand dieser konnte nachgewiesen werden, dass Mutationen, die die basic helix-loop-helix (bHLH)-Domäne beeinträchtigen, die Transaktivierungsfähigkeit von TCF12 aufheben. Co-Transfektions-Experimente mit TWIST1 offenbarten eine Regulation der Transaktivierung von TCF12 durch TWIST1, sowohl im Menschen, als auch im Zebrafisch. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die genauen Expressionsorte von TCF12 während der Morphogenese des Schädeldachs nachgwiesen und die Funktion von TCF12 und seinem Interaktionspartner TWIST1 bei der Entstehung von Kraniosynostosen weiter aufgeklärt werden.