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Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erhöhte Prädisposition für metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilität wird dabei durch epigenetische Veränderungen vermittelt, die sich über die Regulation der Genaktivität auch auf das Expressionsniveau und den Phänotypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede für insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. Für das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen Störfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und mütterlicher BMI berücksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich stärker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der diätisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Größe. Zusätzlich konnten für den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier geprägten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen für die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und können zukünftig nützliche Biomarker für Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS können darüber hinaus Einzelmolekül-Analysen durchgeführt werden, für die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 % abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). Für Zweitere wurde ein eigenes, unabhängiges Library-Präparations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden für die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten für das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die geprägten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers geprägte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht geprägten Allels (HNA) demnach unabhängig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. Für die sekundäre MEG3 Promotor DMR (deren Prägung von der primären MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schwächerer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, für die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt für die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, später jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht geprägten Allel äußern kann. HNA-suszeptible geprägte Gene ähneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli während der frühen embryonalen Entwicklung u.a. über HNA-Effekte geprägte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Prägungsprofile zu erhalten, wären umfangreiche DBS HNA-Längsschnittstudien aller 50-100 human geprägten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien wünschenswert.
Desert ants of the genus Cataglyphis (Formicinae) are widely distributed in arid
areas of the palearctic ecozone. Their habitats range from relatively cluttered environments in the Mediterranean area to almost landmark free deserts. Due to their
sophisticated navigational toolkit, mainly based on the sky-compass, they were
studied extensively for the last 4 decades and are an exceptional model organism
for navigation. Cataglyphis ants exhibit a temporal polyethism: interior workers
stay inside the dark nest and serve as repletes for the first ∼2 weeks of their adult
life (interior I). They then switch to nursing and nest maintenance (interior II)
until they transition to become day-active outdoor foragers after ∼4 weeks. The
latter switch in tasks involves a transition phase of ∼2-3 days during which the
ants perform learning and orientation walks. Only after this last phase do the ants
start to scavenge for food as foragers.
In this present thesis I address two main questions using Cataglyphis desert ants
as a model organism:
1. What are the underlying mechanisms of temporal polyethism?
2. What is the neuronal basis of sky-compass based navigation in Cataglyphis
ants?
Neuropeptides are important regulators of insect physiology and behavior and as
such are promising candidates regarding the regulation of temporal polyethism in
Cataglyphis ants. Neuropeptides are processed from large precursor proteins and undergo substantial post-translational modifications. Therefore, it is crucial to biochemically identify annotated peptides. As hardly any peptide data are available
for ants and no relevant genomic data has been recorded for Cataglyphis, I started
out to identify the neuropeptidome of adult Camponotus floridanus (Formicinae)
workers (manuscript 1). This resulted in the first neuropeptidome described in an
ant species – 39 neuropeptides out of 18 peptide families. Employing a targeted
approach, I identified allatostatin A (AstA), allatotropin (AT), short neuropeptide
F (sNPF) and tachykinin (TK) using mass spectrometry and immunohistology to
investigate the distribution of AstA, AT and TK in the brain (manuscript 2). All
three peptides are localized in the central complex, a brain center for sensory integration and high-order control of locomotion behavior. In addition, AstA and
TK were also found in visual and olfactory input regions and in the mushroom
bodies, the centers for learning and memory formation. Comparing the TK immunostaining in the brain of 1, 7 and 14 days old dark kept animals revealed that
the distribution in the central complex changes, most prominently in the 14 day
old group. In the Drosophila central complex TK modulates locomotor activity
levels. I therefore hypothesize that TK is involved in the internal regulation of the
interior I–interior II transition which occurs after ∼2 weeks of age.
I designed a behavioral setup to test the effect of neuropeptides on the two traits:
’locomotor activity level’ and ’phototaxis’ (manuscript 3). The test showed that
interior I ants are less active than interior II ants, which again are less active
than foragers. Furthermore, interior ants are negatively phototactic compared to
a higher frequency of positive phototaxis in foragers. Testing the influence of AstA
and AT on the ants’ behavior revealed a stage-specific effect: while interior I behavior is not obviously influenced, foragers become positively phototactic and more
active after AT injection and less active after AstA injection. I further tested the
effect of light exposure on the two behavioral traits of interior workers and show that it rises locomotor activity and results in decreased negative phototaxis in
interior ants. However, both interior stages are still more negatively phototactic
than foragers and only the activity level of interior II ants is raised to the forager
level. These results support the hypothesis that neuropeptides and light influence
behavior in a stage-specific manner.
The second objective of this thesis was to investigate the neuronal basis of skycompass navigation in Cataglyphis (manuscript 4). Anatomical localization of the
sky-compass pathway revealed that its general organization is highly similar to
other insect species. I further focused on giant synapses in the lateral complex,
the last relay station before sky-compass information enters the central complex.
A comparison of their numbers between newly eclosed ants and foragers discloses
a rise in synapse numbers from indoor worker to forager, suggesting task-related
synaptic plasticity in the sky-compass pathway. Subsequently I compared synapse
numbers in light preexposed ants and in dark-kept, aged ants. This experiment
showed that light as opposed to age is necessary and sufficient to trigger this rise
in synapse number. The number of newly formed synapses further depends on the
spectral properties of the light to which the ants were exposed to.
Taken together, I described neuropeptides in C. floridanus and C. fortis, and provided first evidence that they influence temporal polyethism in Cataglyphis ants.
I further showed that the extent to which neuropeptides and light can influence
behavior depends on the animals’ state, suggesting that the system is only responsive under certain circumstances. These results provided first insight into the
neuronal regulation of temporal polyethism in Cataglyphis. Furthermore, I characterized the neuronal substrate for sky-compass navigation for the first time in
Cataglyphis. The high level of structural synaptic plasticity in this pathway linked
to the interior–forager transition might be particularly relevant for the initial calibration of the ants’ compass system.
The genetic information encoded with in the genes are transcribed and translated to give rise to
the functional proteins, which are building block of a cell. At first, it was thought that the
regulation of gene expression particularly occurs at the level of transcription by various
transcription factors. Recent discoveries have shown the vital role of gene regulation at the level
of RNA also known as post-transcriptional gene regulation (PTGR). Apart from non-coding RNAs
e.g. micro RNAs, various RNA binding proteins (RBPs) play essential role in PTGR. RBPs have
been implicated in different stages of mRNA life cycle ranging from splicing, processing,
transport, localization and decay. In last 20 years studies have shown the presence of hundreds
of RBPs across eukaryotic systems many of which are widely conserved. Given the rising number
of RBPs and their link to human diseases it is quite evident that RBPs have major role in cellular
processes and their regulation. The current study is aimed to describe the so far unknown
molecular mechanism of CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP/ZNF9)
function in vivo.
CNBP is ubiquitously expressed across various human tissues and is a highly conserved RBP in
eukaryotes. It is required for embryonic development in mammals and has been implicated in
transcriptional as well as post-transcriptional gene regulation; however, its molecular function
and direct target genes remain elusive. Here, we use multiple systems-wide approaches to
identify CNBP targets and document the consequences of CNBP binding. We established CNBP as
a cytoplasmic RNA-binding-protein and used Photoactivatable Ribonucleoside Enhanced
Crosslinking and Immunoprecipitation (PAR-CLIP) to identify direct interactions of CNBP with
4178 mRNAs. CNBP preferentially bound a G-rich motif in the target mRNA coding sequences.
Functional analyses, including ribosome profiling, RNA sequencing, and luciferase assays
revealed the CNBP mode of action on target transcripts. CNBP binding was found to increase the
translational efficiency of its target genes. We hypothesize that this is consistent with an RNA
chaperone function of CNBP helping to resolve secondary structures, thus promoting
translation. Altogether this study provides a novel mechanism of CNBP function in vivo and acts
as a step-stone to study the individual CNBP targets that will bring us closer to understand the
disease onset.
Recent advances in the field of cancer immunotherapy have enabled this therapeutic approach to enter the mainstream of modern cancer treatment. In particular, adoptive T cell therapy (ACT) is a potentially powerful immunotherapy approach that relies on the administration of tumor-specific T cells into the patient. There are several strategies to obtain tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which have already been shown to induce remarkable responses in the clinical setting. However, there are concerns and limitations regarding the conventional approaches to obtain tumor-reactive T cells, such as accuracy of the procedure and reproducibility. Therefore, we aimed to develop two approaches to improve the precision and efficacy of tumor-reactive T cells therapy. These two techniques could constitute effective, safe and broadly applicable alternatives to the conventional methods for obtaining tumor-specific CTLs.
The first approach of this study is the so called “Doublet Technology”. Here, we demonstrate that peptide-human leukocyte antigen-T cell receptor (pHLA-TCR) interactions that involve immune reactive peptides are stable and strong. Therefore, the CTLs that are bound by their TCR to tumor cells can be selected and isolated through FACS-based cell sorting taking advantage of this stable interaction between the CTLs and the target cells. The CTLs from acute myeloid leukemia (AML) patients obtained with this technique show cytolytic activity against blast cells suggesting a potential clinical use of these CTLs. “Doublet Technology” offers a personalized therapy in which there is no need for a priori knowledge of the exact tumor antigen.
The second approach of this study is the Chimeric Antigen Receptor (CAR) Technology. We design several CARs targeting the B-Cell Maturation Antigen (BCMA). BCMA CAR T cells show antigen-specific cytolytic activity, production of cytokines including IFN-γ and IL-2, as well as productive proliferation. Although we confirm the presence of soluble BCMA in serum of multiple myeloma (MM) patients, we demonstrate that the presence of soluble protein does not abrogate the efficacy of BCMA CAR T cells suggesting that BCMA CAR T cells can be used in the clinical setting to treat MM patients. The high antigen specificity of CAR T cells allows efficient tumor cell eradication and makes CAR Technology attractive for broadly applicable therapies.
Biological systems such as cells or whole organisms are governed by complex regulatory networks of transcription factors, hormones and other regulators which determine the behavior of the system depending on internal and external stimuli. In mathematical models of these networks, genes are represented by interacting “nodes” whose “value” represents the activity of the gene.
Control processes in these regulatory networks are challenging to elucidate and quantify. Previous control centrality metrics, which aim to mathematically capture the ability of individual nodes to control biological systems, have been found to suffer from problems regarding biological plausibility.
This thesis presents a new approach to control centrality in biological networks. Three types of network control are distinguished: Total control centrality quantifies the impact of gene mutations and identifies potential pharmacological targets such as genes involved in oncogenesis (e.g. zinc finger protein GLI2 or bone morphogenetic proteins in chondrocytes). Dynamic control centrality describes relaying functions as observed in signaling cascades (e.g control in mouse colon stem cells). Value control centrality measures the direct influence of the value of the node on the network (e.g. Indian hedgehog as an essential regulator of proliferation in chondrocytes). Well-defined network manipulations define all three centralities not only for nodes, but also for the interactions between them, enabling detailed insights into network pathways.
The calculation of the new metrics is made possible by substantial computational improvements in the simulation algorithms for several widely used mathematical modeling paradigms for genetic regulatory networks, which are implemented in the regulatory network simulation framework Jimena created for this thesis.
Applying the new metrics to biological networks and artificial random networks shows how these mathematical concepts correspond to experimentally verified gene functions and signaling pathways in immunity and cell differentiation. In contrast to controversial previous results even from the Barabási group, all results indicate that the ability to control biological networks resides in only few driver nodes characterized by a high number of connections to the rest of the network. Autoregulatory loops strongly increase the controllability of the network, i.e. its ability to control itself, and biological networks are characterized by high controllability in conjunction with high robustness against mutations, a combination that can be achieved best in sparsely connected networks with densities (i.e. connections to nodes ratios) around 2.0 - 3.0.
The new concepts are thus considerably narrowing the gap between network science and biology and can be used in various areas such as system modeling, plausibility trials and system analyses.
Medical applications discussed in this thesis include the search for oncogenes and pharmacological targets, as well their functional characterization.
Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert.
Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A.
Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Dopamin, Serotonin und GABA auf das Schlafverhalten von Drosophila melanogaster genauer untersucht. Mit Hilfe von Mutanten in Wiederaufnahmetransportern für Dopamin und Serotonin konnte gezeigt werden, dass Dopamin und Serotonin entgegengesetzte Wirkungen auf die Schlafmenge der Fliegen haben. Dopamin hat eine schlafhemmende, Serotonin eine schlaffördernde Wirkung. Die Nutzung eines neuronal dopamindefizienten Fliegenstammes erweitert diese Erkenntnisse. Die Nutzung von RNAi zur Hinunterregulierung der Rezeptoren für Dopamin brachte keine weiteren Erkenntnisse, da sie zu keinem messbaren Effekt führen. Jedoch ergab eine parallel dazu durchgeführte Hinunterregulierung des GABABR2 Rezeptors, dass dieser maßgeblich für die Aufrechterhaltung des Schlafes in der zweiten Hälfte der Nacht verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, dass für diese Aufgabe vor allem ihre Expression in den l-LNv Neuronen relevant ist. Dabei ist für die GABABR2 Rezeptoren kein Effekt, für Dopamin und Serotonin nur in geringen Ausmaß ein Effekt auf die Innere Uhr in Form von gering veränderter Periode zu beobachten.
Durch eine Kombination der Transportermutanten für Dopamin und Serotonin mit dem intakten, als auch mutierten WHITE Transporter zeigte sich eine interessante Interaktion dieser drei Transporter bei der Regulation der Gesamtschlafmenge, wobei die white Mutation zu einer Reduzierung der Gesamtschlafmenge führt. UPLC Messungen der Stämme ergaben, dass der Effekt von white vermutlich auf dessen Einfluss auf den beta-Alanyldopamingehalt der Fliegen basiert. beta-Alanyldopamin wird bei dem Transport von Dopamin über die Gliazellen durch das Enzym EBONY gebildet, dessen Mutation in der Kombination mit intaktem WHITE und mutiertem Dopamintransporter zu einer drastischen Reduktion des Schlafes während der Nacht führt. Im Rahmen der Untersuchung konnte zudem gezeigt werden, dass entgegen des bisherigen Wissens aus Zellkulturstudien in Drosophila melanogaster kein beta-Alanylserotonin gebildet wird. Möglicherweise wird nur Dopamin, nicht jedoch Serotonin über die Gliazellen recycelt. Dies ist ein interessanter Unterschied, der sowohl eine zeitliche, als auch lokale Feinregulation der Gegenspieler Dopamin und Serotonin ermöglicht.
Die Untersuchung der Dimerpartner BROWN und SCARLET zeigte, dass lediglich BROWN zu einer Reduktion des Schlafes führt. Ein Effekt, der auch in einer Fliegenlinie mit spontaner white Mutation beobachtet werden konnte. Die genaue Funktion dieses Heterodimertransporters und seine neuronale Lokalisation wurden im Rahmen dieser Arbeit noch nicht geklärt. Dennoch liegt eine Funktion als Dopamin- oder beta-Alanyldopamintransporter in Gliazellen auf Grund der ermittelten Ergebnisse nahe.
Zusätzlich konnte zum ersten Mal in Drosophila melanogaster eine Funktion der Amintransporter bei der Anpassung der Inneren Uhr an extreme kurze bzw. lange Photoperioden gezeigt werden.
Eine anatomische Lokalisierung des WHITE Transporters im Gehirn von Drosophila melanogaster, die weitere Charakterisierung der Rolle des WHITE/BROWN Dimers und die Zuordnung bestimmter dopaminerger und serotonerger Neurone bei der Modulation der Aktivitätsmaxima stellen spannende Fragen für zukünftige Arbeiten dar.
Durch Methoden des Tissue Engineerings hergestellte dreidimensionale Hautäquivalente bilden die native humane Haut hinsichtlich ihrer histologischen Architektur, zellulären Zusammensetzung und metabolischen Aktivität ab. Diese Gewebe eignen sich daher als zellbasierte Wundauflagen für großflächige Hautdefekte oder als In-vitro-Testsysteme für den Ersatz von Tierversuchen. Bei bisherigen Hautäquivalenten fehlt jedoch ein funktionelles Blutgefäßsystem. Wird solch ein Gewebe als Implantat eingesetzt, führt das Fehlen von Blutgefäßen zu einer unzureichenden Versorgung mit Nährstoffen und zur Nekrose. Neben dieser klinischen Limitation ist auch das Anwendungsspektrum als In-vitro-Testsystem begrenzt. Bei nicht vaskularisierten Hautmodellen kann eine transdermale Penetration von Substanzen nicht akkurat abgeschätzt werden, da die zusätzliche Barriere, welche die gefäßauskleidenden Endothelzellen bilden, nicht enthalten ist. In Studien zur Integration eines Gefäßsystems in Hautäquivalente konnte bislang lediglich gezeigt werden, dass sich Endothelzellen zu gefäßartigen Strukturen zusammenlagern. Die Bildung von funktionellen perfundierbaren Gefäßen in einem in vitro generierten Hautäquivalent ist bisher jedoch noch nicht belegt. Entsprechend ist eine direkte Anastomose mit dem Blutkreislauf eines Patienten bei einem klinischen Einsatz als Hautimplantat nicht möglich. Bei einer Anwendung in In-vitro-Studien ist zudem das Gefäßsystem experimentell nicht zugänglich.
In der vorliegenden Arbeit kann durch die Kombination einer biologischen, vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc) mit einem neu entwickelten Bioreaktorsystems, ein Hautäquivalent mit einem perfundierbaren Gefäßsystem hergestellt werden. Die Generierung dieser sogenannten SkinVaSc erfolgt über die Besiedlung der BioVaSc mit humanen Keratinozyten (hEK) und Fibroblasten. Parallel dazu werden die eingebetteten Gefäßstrukturen der BioVaSc mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hDMEC) rebesiedelt. Durch eine Anastomose zwischen den Gefäßen der BioVaSc und dem Bioreaktorsystem ist eine Perfusion mit physiologisch, gepulsten Drücken zwischen 80 und 120 mmHG möglich. Optimale Kulturbedingungen für die Haut- zellen können ferner durch zwei Kulturmodi generiert werden. Zur optimalen Versorgung der hEK innerhalb einer Proliferationsphase, die sich an die Zellaussaat anschließt, erfolgt eine kontinuierliche Versorgung der Oberfläche der SkinVaSc mit Medium. Der zweite Modus stimuliert die Differenzierung der hEK durch eine Kultivierung des Modells an der Grenzfläche zwischen Luft und Medium.
Nach einer vierzehntägigen Kultivierung der SkinVaSc an der Luft Medium Grenzfläche lässt sich die Bildung einer hautspezifischen histologischen Architektur durch Hämalaun/Eosin und immunhistologische Färbungen belegen. Eine natürlich differenzierte Epidermis wird durch eine Basalmembran, die Kollagen Typ IV und Laminin 5 enthält von einen dermalen Teil getrennt. Die Dermale-Epidermale-Verbindung erscheint durch die Mikrostrukturierung der BioVaSc wellenförmig. Damit bildet die SkinVaSc die papillare Struktur der nativen humanen Haut ab. Innerhalb des dermalen Anteils können zudem Gefäßstrukturen ausgemacht werden. Die Innenseite der Gefäße sind durch eine Schicht aus hDMEC ausgekleidet, die endothelzellspe-
zifische Oberflächenmarker wie "platelet endothelial cell adhesion molecule 1“ und "von Willebrand Faktor“ aufweisen.
Eine zerstörungsfreie Überwachung der SkinVaSc hinsichtlich der epidermalen Differenzierung ist durch eine integrierte Sensortechnologie auf Basis der Impedanz-spektroskopie möglich. Dabei erlaubt ein entwickeltes mathematisches Modell die Extraktion von biologisch relevanten Informationen aus Impedanzspektren in einem Frequenzbereich zwischen 1 Hz und 100 kHz. Innerhalb dieser Studien ließ sich zeigen, dass die epidermale Differenzierung zu einer signifikanten Steigerung des ohmschen Widerstandes von 245,3 Ohm*cm2 zu 1108,1 Ohm*cm2 führt. Gleichzeitig sinkt die zelluläre Kapazität von 131,5µF/cm2 auf 5,4µF/cm2 ab. Durch diese Parameter
ist es möglich die epidermale Barriere zerstörungsfrei über die Kultivierungszeit zu überwachen.
Das Gefäßsystem der SkinVaSc ermöglicht es mehr dermatologische Fragestellungen in vitro zu untersuchen und damit Tierversuche zu ersetzen. Zudem kann auf Basis der SkinVaSc ein vaskularisiertes Hautimplantat entwickelt werden, das es ermöglicht tiefe Hautverletzungen zu behandeln.
Der Wnt Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Embryogenese durch Steuerung der Proliferation, Apoptose, Differenzierung und der Festlegung der Körperachsen im frühen Embryo. Eine Fehlregulation des Signalwegs durch Mutationen in einem der Proteine und Gene dieser hochkomplexen Signalkaskade kann fatale Folgen haben, und ist ein erster Schritt auf dem Weg der Krebsentstehung. Dabei spielt das Protein β-Catenin eine Schlüsselrolle im kanonischen Zweig des Wnt Signalwegs. Durch Steuerung seiner Konzentration im Zytoplasma wird die Expression seiner direkten Zielgene reguliert, da β-Catenin im aktiven Signalweg als Co-Transkriptionsfaktor agiert. Durch Sichtbarmachung dieses Proteins durch fluoreszierende Reportergenkonstrukte kann der Aktivitätsstatus des Wnt Signalwegs in der Zelle beobachtet werden. Das ermöglicht zum einen genaue Analysen des Signalwegs, wie zum Beispiel das Studium des Zusammenspiels mit anderen Signalwegen. Vor allem aber erlaubt es die gezielte Suche nach Wnt-Signalwegs-modulierenden Substanzen als potentielle Wirkstoffe in der Krebsmedikamentenentwicklung. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Reportergenkonstrukte für die stabile Transfektion von Zelllinien entwickelt und hinsichtlich eines möglichen Einsatzes sowohl in der Forschung, als auch in Wirkstoffscreenings validiert. Dies umfasst sowohl mehrere Reporter mit β-Catenin als Fusionsprotein, als auch Wnt-Promoter-regulierte eGFP-Reporter, die den Akitvitätsstatus des Wnt-Signalwegs anzeigen. Mit Hilfe dieser Reporter konnten Untersuchungen zur Wirkung des Wnt-Signalwegs auf die Morphologie von transfizierten und nicht-transfizierten MDCK-Zellen durchgeführt werden. Überdies wurde ein promotorregulierter eGFP-Reporter konstruiert, mit welchem transfizierte Zellen mit aktiviertem Wnt-Signalweg aus einem Zellpool gefischt werden können. Diese Methode ist sowohl für den Einsatz in kultivierten Zelllinien, als auch in der Diagnostik nach der Transfektion primärer Zellen geeignet. Auf Grundlage der neuen Zelllinien wurde weiterhin ein neuer Screeningansatz für potentielle Wnt-Signalwegsinhibitoren entwickelt, der auf dem Ausbleichen der Fluoreszenz in einem Well einer Multiwell-Kulturplatte beruht.
Bei Melanomen handelt es sich um die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate. Deshalb sind Untersuchungen dieser Hautkrebsart von immenser Bedeutung. Es ist bekannt, dass der AP-1-Transkriptionsfaktorkomplex eine große Rolle für Melanomentstehung und -progression spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der AP-1 Komponente FOSL1 in Melanomen untersucht.
Hierbei konnte zunächst ermittelt werden, dass die FOSL1 Expression im humanen Melanom durch den MAPK-Signalweg vermittelt wird und von den Onkogenen BRAF und NRAS abhängig ist. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass die Stabilität von FOSL1 durch MAPK reguliert wird.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass FOSL1 in vielen Melanomzellen die Proliferation verstärkt und auch an Migration beteiligt ist. Da diese Prozesse zur Krebsprogression beitragen, deutet dies darauf hin, dass FOSL1 bei der Melanomentwicklung eine wichtige Funktion besitzt. Weiterhin konnten SLUG, SNAI3, IL6 und MMP14 als FOSL1-Zielgene identifiziert werden, deren Regulierbarkeit durch FOSL1, jedoch abhängig von der jeweiligen Zelllinie war. Somit konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass FOSL1 nicht nur, wie zuvor für Brustkrebszellen beschrieben, an Migration beteiligt ist, sondern auch zur Proliferation humaner Melanome beiträgt. Zukünftige Arbeiten werden zeigen, ob die identifizierten Gene für die FOSL1-vermittelte Migration und Proliferation verantwortlich sind.