Graduate School of Life Sciences
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Pneumolysin, a protein toxin, represents one of the major virulence factors of Streptococcus pneumoniae. This pathogen causes bacterial meningitis with especially high disease rates in young children, elderly people and immunosuppressed patients. The protein toxin belongs to the family of cholesterol-dependent cytolysins, which require membrane cholesterol in order to bind and to be activated. Upon activation, monomers assemble in a circle and undergo conformational change. This conformational change leads to the formation of a pore, which eventually leads to cell lysis. This knowledge was obtained by studies that used a higher concentration compared to the concentration of pneumolysin found in the cerebrospinal fluid of meningitis patients. Thus, a much lower concentration of pneumolysin was used in this work in order to investigate effects of this toxin on primary mouse astrocytes. Previously, a small GTPase activation, possibly leading to cytoskeletal changes, was found in a human neuroblastoma cell line. This led to the hypothesis that pneumolysin can lead to similar cytoskeletal changes in primary cells. The aim of this work was to investigate and characterise the effects of pneumolysin on primary mouse astrocytes in terms of a possible pore formation, cellular trafficking and immunological responses. Firstly, the importance of pore-formation on cytoskeletal changes was to be investigated. In order to tackle this question, wild-type pneumolysin and two mutant variants were used. One variant was generated by exchanging one amino acid in the cholesterol recognising region, the second variant was generated by deleting two amino acids in a protein domain that is essential for oligomerisation. These variants should be incapable of forming a pore and were compared to the wild-type in terms of lytic capacities, membrane binding, membrane depolarisation, pore-formation in artificial membranes (planar lipid bilayer) and effects on the cytoskeleton. These investigations resulted in the finding that the pore-formation is required for inducing cell lysis, membrane depolarisation and cytoskeletal changes in astrocytes. The variants were not able to form a pore in planar lipid bilayer and did not cause cell lysis and membrane depolarisation. However, they bound to the cell membrane to the same extent as the wild-type toxin. Thus, the pore-formation, but not the membrane binding was the cause for these changes. Secondly, the effect of pneumolysin on cellular trafficking was investigated. Here, the variants showed no effect, but the wild-type led to an increase in overall endocytotic events and was itself internalised into the cell. In order to characterise a possible mechanism for internalisation, a GFP-tagged version of pneumolysin was used. Several fluorescence-labelled markers for different endocytotic pathways were used in a co-staining approach with pneumolysin. Furthermore, inhibitors for two key-players in classical endocytotic pathways, dynamin and myosin II, were used in order to investigate classical endocytotic pathways and their possible involvement in toxin internalisation. The second finding of this work is that pneumolysin is taken up into the cell via dynamin- and caveolin-independent pinocytosis, which could transfer the toxin to caveosomes. From there, the fate of the toxin remains unknown. Additionally, pneumolysin leads to an overall increase in endocytotic events. This observation led to the third aim of this work. If the toxin increases the overall rate of endocytosis, the question arises whether toxin internalisation favours bacterial tissue penetration of the host or whether it serves as a defence mechanism of the cell in order to degrade the protein. Thus, several proinflammatory cytokines were investigated, as previous studies describe an effect of pneumolysin on cytokine production. Surprisingly, only interleukin 6-production was increased after toxin-treatment and no effect of endocytotic inhibitors on the interleukin 6-production was observed. The conclusion from this finding is that pneumolysin leads to an increase of interleukin 6, which would not depend on the endocytotic uptake of pneumolysin. The production of interleukin 6 would enhance the production of acute phase proteins, T-cell activation, growth and differentiation. On the one hand, this activation could serve pathogen clearance from infected tissue. On the other hand, the production of interleukin 6 could promote a further penetration of pathogen into host tissue. This question should be further investigated.
Streptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damage (e. g. apoptosis, brain edema, and ischemia). Pneumolysin belongs to the family of pore forming, cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), bacterial protein toxins, which basically use membrane-cholesterol as receptor and oligomerize to big aggregates, which induce cell lysis and cell death by disturbance of membrane integrity. Multiple recent studies, including this work, have revealed a new picture of pneumolysin, whose cell-related properties go far beyond membrane binding, pore formation and the induction of cell death and inflammatory responses. For a long time, it has been known that bacteria harm the tissues of their hosts in order to promote their own survival and proliferation. Many bacterial toxins aim to rather hijack cells than to kill them, by interacting with cellular components, such as the cytoskeleton or other endogenous proteins. This study was able to uncover a novel capacity of pneumolysin to interact with components of the actin machinery and to promote rapid, actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. The toxin was applied in disease-relevant concentrations, which were verified to be sub-lytic. These amounts of toxin induced a rapid actin cortex collapse in horizontal direction towards the cell core, whereat membrane integrity was preserved, indicating an actin severing function of pneumolysin, and being consistent with cell shrinkage, displacement, and blebbing observed in live cell imaging experiments. In contrast to neuroblastoma cells, in which pneumolysin led to cytoskeleton remodeling and simultaneously to activation of Rac1 and RhoA, in primary astrocytes the cell shape changes were seen to be primarily independent of small GTPases. The level of activated Rac1 and RhoA did not increase at the early time points after toxin application, when the initial shape changes have been observed, but at later time points when the actin-dependent displacement of cells was slower and less severe, probably presenting the cell’s attempt to re-establish proper cytoskeleton function. A GUV (giant unilamellar vesicle) approach provided insight into the effects of pneumolysin in a biomimetic system, an environment, which is strictly biochemical, but still comprises cellular components, limited to the factors of interest (actin, Arp2/3, ATP, and Mg2+ on one side, and PLY on the other side). This approach was able to show that the wildtype-toxin, but not the Δ6 mutant (mutated in the unfolding domain, and thus non-porous), had the capacity to exhibit its functions through a membrane bilayer, meaning it was able to aggregate actin, which was located on the other side of the membrane, either via direct interaction with actin or in an Arp2/3 activating manner. Taking a closer look at these two factors with the help of several different imaging and biochemical approaches, this work unveiled the capacity of pneumolysin to bind and interact both with actin and Arp2 of the Arp2/3 complex. Pneumolysin was capable to slightly stabilize actin in an actin-pyrene polymerization assay. The same experimental setup was applied to show that the toxin had the capacity to lead to actin polymerization through activation of the Arp2/3 complex. This effect was additionally confirmed with the help of fluorescent microscopy of rhodamine (TRITC)-tagged actin. Strongest Arp2/3 activation, and actin nucleation/polymerization is achieved by the VCA domain of the WASP family proteins. However, addition of PLY to the Arp2/3–VCA system led to an enhanced actin nucleation, suggesting a synergistic activation function of pneumolysin. Hence, two different effects of pneumolysin on the actin cytoskeleton were observed. On the one hand an actin severing property, and on the other hand an actin stabilization property, both of which do not necessarily exclude each other. Actin remodeling is a common feature of bacterial virulence strategies. This is the first time, however, that these properties were assigned to a toxin of the CDC family. Cytoskeletal dysfunction in astrocytes leads to dysfunction and unregulated movement of these cells, which, in context of bacterial meningitis, can favor bacterial penetration and spreading in the brain tissue, and thus comprises an additional role of pneumolysin as a virulence factor of Streptococcus pneumonia in the context of brain infection.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgeführt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und für eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angefärbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erhöhung der Mikrokernfrequenz in Abhängigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die Höhe des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei höheren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erhöhung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie hauptsächlich für spektroskopische Untersuchungen und zur Qualitätskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzkörperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinführung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Datenübertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollständigen Literaturübersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt. Ziel war es, alle bisher durchgeführten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein Rückwärtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator geführt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgeführt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen primär die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden primäre Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden für unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen für den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode für den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgeführt. Es konnte keine Erhöhung der Anzahl der DNA-Strangbrüche bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen Störungen der Mitose, nicht aber Erhöhungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosestörungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen für 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden Störungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der Störungen in der Pro- und Metaphase unverändert blieb. Die Störungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gewählten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosestörungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosestörungen und DNA-Schäden, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.
Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis.
Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden.
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes.
Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.