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Nach der Präparation von gewaschenen Thrombozyten, einem wichtigen Ausgangsmaterial für die experimentelle Forschung oder für die Transfusionsmedizin, tritt bekannterweise ein zunehmender Verlust der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit ein. Die verminderte Funktionsfähigkeit von Thromboyzten nach dem Waschvorgang kann somit auch experimentelle Ergebnisse beeinflussten. Allerdings sind die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen bisher nicht aufgeklärt, sodass in dieser Dissertationsarbeit molekulare sowie auch funktionelle Vorgänge untersucht wurden, die zum bekannten Phänomen des raschen Verlustes der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit gewaschener Thrombozyten führen. Die Wirkung von ADP wird über die drei purinergen Rezeptoren P2Y1, P2X1 und P2Y12 vermittelt wird. Daher wurde zunächst die ADP-induzierte Aggregationsfähigkeit alleine bzw. unter Kostimulation mit Epinephrin oder Serotonin - zwei Induktoren, deren Rezeptoren mit analogen Signalwegen wie die ADP-Rezeptoren P2Y1 bzw. P2Y12 gekoppelt sind - bestimmt. Um Hinweise zu erhalten, wie die Abnahme der ADP-vermittelten Reaktivität von gewaschenen Thrombozyten mit der purinergen Rezeptorexpression und -distribution sowie mit der nachgeschalteten Signalweiterleitung im Zusammenhang steht, wurde zudem die Expression purinerger Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche bzw. die Konzentration von purinergen Rezeptoren im Zytosol gewaschener Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie bzw. ELISA gemessen. Es zeigte sich, dass die Funktion der den purinergen Rezeptoren nachgeschalteten Signalwege während der Lagerungszeit zunehmend beeinträchtigt wird, aber zumindest teilweise erhalten bleibt, wie anhand von Effekten durch Kostimulation mit den Induktoren Epinephrin und Serotonin gezeigt werden konnte. Die Distribution der Rezeptoren zwischen der Thrombozytenoberfläche und den intrazellulären Kompartimenten unterliegt komplexen Prozessen, die induktorabhängig reguliert sind. Eine initiale Zunahme der Expression von ADP-Rezeptoren während der Lagerung von gewaschenen Thrombozyten geht dabei nicht einher mit der Aufrechterhaltung der ADP-induzierten Aggregation. In der Schlussfolgerung ist die fortschreitende Degeneration der ADP-vermittelten Aggregation - neben einem Rückgang der Rezeptorexpression nach mehr als einer Stunde Lagerungszeit - vor allem auf einen funktionellen Verlust der purinergen Rezeptoren zurückzuführen.

Im Rahmen der Präparation und Lagerung von TKs entstehen bei Thrombozyten morphologische, funktionelle und hämostatische Defizite, die unter dem Begriff storage lesion zusammengefasst werden. In dieser Dissertation wurde untersucht, ob durch Zugabe des kurzzeitig und reversibel wirksamen NO-Donors DEA/NO zu Apherese-TKs Zeichen der storage lesion über eine 5-tägige Lagerung vermindert werden können. Dafür wurde den Apherese-TKs direkt nach der Herstellung 5 nM DEA/NO zugesetzt. An den Tagen 0 (nach Abklingen der NO-Donor-Wirkung), 2 und 5 wurden verschiedene funktionelle Systeme der Thrombozyten analysiert. Verglichen mit früheren Untersuchungen von unbehandelten TKs ergab sich unter Einsatz von DEA/NO eine abgeschwächte Aktivierung der inhibitorischen Signalwege mit geringerem Anstieg der VASP-Phosphorylierung und des cGMP-Spiegels sowie mit stabilem PDE5A-Gehalt. Gemessen anhand der P-Selektin-Expression und der Fibrinogenbindung zeigte sich ein unverändert niedriger Präaktivierungsgrad der Thrombozyten bei erhaltener Stimulierbarkeit. Bei der Oberflächenexpression von purinergen Rezeptoren war der Rückgang der stimulierten Mobilisation während der 5-tägigen Lagerung im Vergleich zu unbehandelten TKs vermindert. Damit war unter dem Einfluss von DEA/NO eine Abschwächung von Phänomenen der storage lesion zu beobachten. Für eine mögliche klinische Anwendung des NO-Donors DEA/NO bei der TK-Herstellung sind allerdings weitere Studien bezüglich Wirksamkeit und möglicher unerwünschter Wirkungen in vivo notwendig. Darüber hinaus muss eine technische Lösung für die sterile Zugabe von DEA/NO gefunden werden.

Background: Platelets are important for effective hemostasis and considered to be involved in pathophysiological processes, e.g. in cardiovascular diseases. Platelets provided for research or for therapeutic use are frequently separated from citrated whole blood (WB) stored for different periods of time. Although functionally intact platelets are required, the stability of platelet integrity, e.g. adenosine diphosphate (ADP) mediated responsiveness, has never been thoroughly investigated in citrated WB under ex vivo conditions. Objectives: Platelet integrity was evaluated at different time points in citrated WB units, collected from healthy donors and stored for 5 days at ambient temperature. The analysis included the measurement of activation markers, of induced light transmission aggregometry and of purinergic receptor expression or function. Inhibitory pathways were explored by determination of basal vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)-phosphorylation, intracellular cyclic nucleotide levels and the content of phosphodiesterase 5A. Fresh peripheral blood (PB) samples served as controls. Results: On day 5 of storage, thrombin receptor activating peptide-6 (TRAP-6) stimulated CD62P expression and fibrinogen binding were comparable to PB samples. ADP induced aggregation continuously decreased during storage. Purinergic receptor expression remained unchanged, whereas the P2Y1 activity progressively declined in contrast to preserved P2Y12 and P2X1 function. Inhibitory pathways were unaffected except for a slight elevation of VASP phosphorylation at Ser\(^{239}\) on day 5. Conclusion: After 5 days of storage in citrated WB, platelet responsiveness to TRAP-6 is sufficiently maintained. However, ADP-mediated platelet integrity is more sensitive to deterioration, especially after storage for more than 2 days. Decreasing ADP-induced aggregation is particularly caused by the impairment of the purinergic receptor P2Y1 activity. These characteristics should be considered in the use of platelets from stored citrated WB for experimental or therapeutic issues.

Background Therapeutic vaccination directed to induce an anti-tumoral T-cell response is a field of extensive investigation in the treatment of melanoma. However, many vaccination trials in melanoma failed to demonstrate a correlation between the vaccine-specific immune response and therapy outcome. This has been mainly attributed to immune escape by antigen loss, rendering us in the need of new vaccination targets. Patients and methods This phase-II trial investigated a peptide vaccination against survivin, an oncogenic inhibitor-of-apoptosis protein crucial for the survival of tumor cells, in HLA-A1/-A2/-B35-positive patients with treatment-refractory stage-IV metastatic melanoma. The study endpoints were survivin-specific T-cell reactivity (SSTR), safety, response, and survival (OS). Results Sixty-one patients (ITT) received vaccination therapy using three different regimens. 55 patients (PP) were evaluable for response and survival, and 41/55 for SSTR. Patients achieving progression arrest (CR + PR + SD) more often showed SSTRs than patients with disease progression (p = 0.0008). Patients presenting SSTRs revealed a prolonged OS (median 19.6 vs. 8.6 months; p = 0.0077); multivariate analysis demonstrated SSTR as an independent predictor of survival (p = 0.013). The induction of SSTRs was associated with gender (female vs. male; p = 0.014) and disease stage (M1a/b vs. M1c; p = 0.010), but not with patient age, HLA type, performance status, or vaccination regimen. Conclusion Survivin-specific T-cell reactivities strongly correlate with tumor response and patient survival, indicating that vaccination with survivin-derived peptides is a promising treatment strategy in melanoma.