610 Medizin und Gesundheit
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Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bildet eine Barriere, die das ZNS vor dem Einfluss der Substanzen aus der Peripherie schützt. Die Aufrechterhaltung dieser wichtigen Struktur ist für die Homöostase und Vermeidung von Schäden im ZNS von besonderer Bedeutung. Eine häufige Ursache für die Schädigung der BHS ist der ischämische Schlaganfall. In der Hypoxie werden zahlreiche Proteine degradiert oder von den Zellkontakten delokalisiert, die für die Integrität der Zell-Zell-Kontakte eine wichtige Rolle spielen. Als Folge resultiert eine Destabilisierung der BHS mit vermehrtem Durchstrom von ZNS-schädigenden Substanzen.
Seit der Entdeckung von miRNAs (Lee et al., 1993) konnte deren Rolle vor allem in der Entstehung von Tumoren und Entzündungen nachgewiesen werden. In der Arbeitsgruppe Förster wurde eine vermehrte Expression von miRNA-132 und miRNA-212 nach OGD festgestellt. Als Zielgene von miRNA-132/212 konnten Cldn1, Tjap1, MMP9 und Jam3 detektiert werden. Die Validierungsversuche wurden an einem etablierten In-vitro-Modell der BHS bestehend aus murinen cerebralen Hirnendothelzellen (cEND-2) durchgeführt.
Zu Beginn wurden die Bedingungen zur Kultivierung der Zellen unter Hypoxie und ohne Glucose (eng. oxygen glucose deprivation, OGD) mit und ohne Astrozyten-konditioniertem Medium etabliert. Expression von diversen Genen, die bekannt sind eine Rolle in der OGD zu spielen, wurden mittels qPCR ermittelt. Dabei kam es zu signifikanten Veränderungen der Genexpression von wichtigen Genen in der BHS, die besonders in Kombination mit Astrozyten-konditioniertem Medium noch verstärkt werden konnten. So wurde die Kultivierung der Zellen für die weiteren OGD-Versuche in Astrozyten-konditioniertem Medium gewählt.
Des Weiteren wurde die Regulation von miRNA-132/212 auf die Zielgene an der BHS untersucht. Die hemmende Wirkung der miRNAs auf die Genexpression der Zielgene konnte durch Transfektion von pre-miR-132/212 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden. In der OGD konnte durch Hemmung der vermehrt exprimierten miRNA-132/212 ein Anstieg der Zielgene beobachtet werden. Damit konnten sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebenen Cldn1, Tjap1, Jam3 und MMP9 als Zielgene bestätigt werden. Zusätzlich wurden als funktionelle Tests eine TEER-Messung für den Widerstand und eine Permeabilitätsmessung durchgeführt. Beide Tests bestätigten die Destabilisierung der BHS nach Transfektion von miRNA-132/212.
Als therapeutische Implikation könnte durch Inhibition von miRNA-132/212 bei einer Minderperfusion des Gehirns die Barriere stabilisiert werden, was eine neue Möglichkeit in der Therapie des akuten Schlaganfalls bietet.
Die Transduktionsfaktoruntereinheit HIF-1alpha ist der zentrale Sauerstoffsensor für Säugerzellen aller Art. Er ist in der Lage durch Steuerung der Transkription entsprechender Gene auf die Zellproliferation, verschiedene Transportvorgänge, die Angiogenese, die Glykolyse und andere Vorgänge Einfluß zu nehmen. Zahlreiche Studien belegen den Zusammenhang zwischen HIF-1alpha-Überexpression in soliden Tumoren und Verkürzung der Überlebens- bzw. der rezidivfreien Zeit. Schon lange ist die Assoziation von Tumorhypoxie mit der Verschlechterung der Prognose der Erkrankung bekannt. Die Trennung der hypoxischen Srahlenresistenz von der pro-proliferativen und pro-metastatischen Potenz von HIF-1alpha als Ursache der Prognoseverschlechterung von tumorkranken Patienten ist derzeit nicht möglich. Die vorliegende Arbeit zeigt anhand zweier etablierter humaner Tumorzellinien, daß Faktoren des Tumormikromilieus in der Lage sein können, die HIF-1alpha-Expression zu modulieren. Hypoxie war stets eine Grundvoraussetzung für die Messung erhöhter HIF-1alpha-Spiegel. Jedoch waren annähernd normale Glukosespiegel des Tumormikromilieus für eine nennenswerte HIF-1alpha-Überexpression erforderlich. Dies könnte erklären, warum immunhistochemische Schnitte von HIF-1alpha und von exogenen Hypoxiemarkern bezüglich der angefärbten Areale differieren. Sowohl die mangelnde Spezifität der HIF-1alpha-Expression für Hypoxie, als auch die für klinische Routinearbeiten ungünstige Kinetik des endogenen Hypoxiemarkers HIF-1alpha, lassen an seiner praktischen Einführung in der Klinik zweifeln. Da noch kein endogener Hypoxiemarker gefunden werden konnte, der spezifisch bei Hypoxie akkumulieren würde, und darüber hinaus alle bekannten endogenen Hypoxiemarker bei Sauerstoffmangel unterschiedlich reagieren, scheint es derzeit am sinnvollsten zu sein, neben der Kombination von verschiedenen Markern außerdem andere Faktoren, wie die Vaskularisierungsdichte zu bestimmen. Die Tatsache, daß nicht alle hypoxischen Zellen HIF-1alpha exprimieren, und die, daß aufgrund der nicht-hypoxischen Aktivierung von HIF-1alpha unter Umständen auch nicht hypoxische Zellen gesteigerte HIF-1alpha-Spiegel aufweisen, könnte ein therapeutisches Eingreifen auf Ebene von HIF-1alpha – als vermeintlich tumorspezifische Therapieform – in Frage stellen. Die Ergebnisse zahlreicher Studien zeigen deutlich, daß HIF-1alpha weder hypoxiespezifisch noch tumorspezifisch in der Zelle akkumuliert. Die Zukunft wird zeigen, ob es eine neue Substanzklasse der „HIF-1-Inhibitoren“ geben wird. Derzeit laufen mehrere klinische Studien zur Evaluierung denkbarer Substanzen.
Das maligne Melanom ist ein Tumor der Hautpigmentzellen mit weltweit steigender Inzidenz. Aufgrund seiner frühzeitigen lymphogenen und hämatogenen Metastasierung zählt das maligne Melanom zu den prognostisch sehr ungünstigen Tumorerkrankungen. Nach erfolgter Metastasierung werden mit den derzeitig etablierten Therapieschemata noch keine ausreichenden Prognoseverbesserungen erzielt. Einen möglichen neuen Therapieansatz stellt die Blockade der Tumorangiogenese dar. Besondere Bedeutung wird dabei der zyto- bzw. chemokinvermittelten Angiogenese zugemessen. In den letzten Jahren zeigten verschiedene diesbezügliche Studien richtungsweisende und erfolgversprechende Ergebnisse. Trotzdem besteht weiterhin hoher Bedarf an Verbesserung des Verständnisses der zugrundeliegenden Regulationsmechanismen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Sekretion acht angiogenetisch wirksamer Zyto- und Chemokine in vitro durch hoch- und niedrigmaligne Melanomzellen unter normalen Kulturbedingungen sowie unter Hypoxie, Serum- und Glukosemangel zu erfassen. Diese Stressbedingungen dienten als vereinfachtes in vitro-Modell der Mangelbedingungen, die in schnell wachsenden bzw. Nekrosezonen angrenzenden Tumorarealen vorherrschen. Mittels ELISA wurden die abgegeben Mengen der Zytokine VEGF, b-FGF, Angiogenin, PDGF und TGF-ß sowie der Chemokine IL-8, Gro-α und GM-CSF in den Zellüberständen bestimmt. Dabei zeigten die verschiedenen Melanomzelllinien für alle getesteten Zyto- bzw. Chemokine außer GM-CSF charakteristische Sekretionsverhalten unter bestimmten Kulturbedingungen. Insbesondere unter Hypoxie und nach Reoxigenierung ließen sich signifikante Veränderungen im Sekretionsverhalten der verschiedenen Melanomzelllinien feststellen. Eine signifikante Steigerung in der Freisetzung der Zyto- bzw. Chemokine durch Melanomzellen unter Hypoxie ließ sich nur für VEGF, b-FGF, Angiogenin und IL-8 feststellen. Zudem unterschieden sich hochmaligne Melanomzelllinien signifikant von niedrigmalignen Zelllinien in ihrer Sekretion von VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen Kulturbedingungen und unter Hypoxie (Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). In weiterführenden Experimenten wurde das Sekretionsverhalten von normalen Melanozyten, Endothelzellen und Fibroblasten untersucht. Dabei wiesen differenzierte Melanozyten im Vergleich zu den Melanomzellen signifikante Unterschiede in den abgegebenen Zyto-/ Chemokinmengen für VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen bzw. hypoxischen Kulturbedingungen auf. Differenzierte Melanozyten unterschieden sich also von Melanomzellen in ihrer Sekretion bei den selben Zyto- bzw. Chemokinen wie niedrigmaligne von hochmalignen Melanomzelllinien (VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). Im Sekretionsverhalten für VEGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α ähnelten Fibroblasten und Endothelzellen (bzgl. VEGF nur HMEC-1) den Melanomzellen. Der Einfluss dieser vier Zyto- und Chemokine und b-FGF auf das in-vitro-Wachstumsverhalten von Endothelzellen wurde mit einem BrD-U-Proliferationsassay untersucht. Sowohl mikrovaskuläre (HMEC-1) als auch makrovaskuläre (HUVEC) Endothelzellen steigerten ihre Proliferation unter dem Einfluss von VEGF, b-FGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α signifikant. HMEC-1 reagierten dabei mit einem tendenziell stärkeren Ansprechen auf die Stimulation als HUVEC. In weiteren Versuchen zeigten HUVEC eine erhöhte Sensibilität für Zytokine (insbesondere für b-FGF) unter Serummangelbedingungen, nicht jedoch für Chemokine (IL-8 und Gro-α). Am deutlichsten fiel die Proliferationssteigerung unter dem Einfluss der einzelnen Zyto- und Chemokine aus, wenn HUVEC in nonadhärentem Zustand stimuliert wurden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte erstmalig bzw. zeitgleich mit anderen Publikationen gezeigt werden, dass Melanomzellen unter Hypoxie nicht nur VEGF, sondern auch Angiogenin und IL-8 deutlich vermehrt sezernieren, dass diese Sekretionssteigerung nach Reoxigenierung weiter anhält und Melanomzellen signifikant von differenzierten Melanozyten unterscheidet. Jedes dieser Zyto- und Chemokine stimulierte die Endothelzellproliferation in vitro. Dabei erhöhten Serummangel und vor allem initial fehlende Zell-Zellkontakte die Zyto- bzw. Chemokinwirkung. Im Gegensatz zu dem bisher intensiver untersuchten VEGF sezernierten hochmaligne Melanomzellen unter Hypoxie signifikant mehr Angiogenin und IL-8 als niedrigmaligne Melanomzellen. Nur für Angiogenin zeigte sich darüber hinaus eine gegensätzliche Sekretionsregulation unter Hypoxie aller Melanomzellen im Vergleich zu normalen Melanozyten. Dies könnte für IL-8 und im Besonderen für Angiogenin auf eine mögliche Schlüsselfunktion in der Melanom-induzierten Angiogenese hindeuten. Inwieweit Rückschlüsse auf die in vivo-Verhältnisse und eine klinische Relevanz zulässig sind, werden weitere Untersuchungen und ggf. Therapiestudien zeigen müssen.