610 Medizin und Gesundheit
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Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die häufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht für die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich häufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs führt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch’scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein möglicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen.
Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert.
Zunächst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrität des adhärenten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter führte zur Überexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden.
Der Zellzahlerhöhung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilität reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilität des Epithels erhöht. Diese Einschränkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite könnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression.
Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch Überexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionstüchtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren könnte mittels E2F2, übertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation möglich sein. Entscheidend ist der möglichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in frühen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verzögern oder zu verhindern.
Im Zuge der Bemühungen um neue, tumorspezifische Therapieansätze für die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein höchst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenität, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Veränderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivität der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht.
Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und primären MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert.
In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilität der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabhängig herausstellte. Die Ergebnisse bestätigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsansätze gerechtfertigt, die die Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorgänge im lebenden Organismus überprüfen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikamentösen MM-Therapie kombiniert.
Background
Angiogenesis represents a highly multi-factorial and multi-cellular complex (patho-) physiologic event involving endothelial cells, tumor cells in malignant conditions, as well as bone marrow derived cells and stromal cells. One main driver is vascular endothelial growth factor (VEGFA), which is known to interact with endothelial cells as a survival and mitogenic signal. The role of VEGFA on tumor cells and /or tumor stromal cell interaction is less clear. Condition specific (e.g. hypoxia) or tumor specific expression of VEGFA, VEGF receptors and co-receptors on tumor cells has been reported, in addition to the expression on the endothelium. This suggests a potential paracrine/autocrine loop that could affect changes specific to tumor cells.
Methods
We used the monoclonal antibody against VEGFA, bevacizumab, in various in vitro experiments using cell lines derived from different tumor entities (non small cell lung cancer (NSCLC), colorectal cancer (CRC), breast cancer (BC) and renal cell carcinoma (RCC)) in order to determine if potential VEGFA signaling could be blocked in tumor cells. The experiments were done under hypoxia, a major inducer of VEGFA and angiogenesis, in an attempt to mimic the physiological tumor condition. Known VEGFA induced endothelial biological responses such as proliferation, migration, survival and gene expression changes were evaluated.
Results
Our study was able to demonstrate expression of VEGF receptors on tumor cells as well as hypoxia regulated angiogenic gene expression. In addition, there was a cell line specific effect in tumor cells by VEGFA blockade with bevacizumab in terms of proliferation; however overall, there was a limited measurable consequence of bevacizumab therapy detected by migration and survival.
Conclusion
The present study showed in a variety of in vitro experiments with several tumor cell lines from different tumor origins, that by blocking VEGFA with bevacizumab, there was a limited autocrine or cell-autonomous function of VEGFA signaling in tumor cells, when evaluating VEGFA induced downstream outputs known in endothelial cells.
Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden.
In Deutschland und weltweit, werden mehr und mehr, neben einem makellosen Körper und Gesicht, auch makellose Zähne als Schönheits- und Statussymbol betont. Sogar können die kleinste Verfärbungen oder Füllungen Grund zur Besorgnis für Erwachsene, Kinder und Eltern sein. Als Therapie in der Zahnheilkunde ist verbreitet, diese Verfärbungen bzw. Flecken mit Kompositfüllungen, Veneers, Kronen oder mit abrasiven Schleifkörpern invasiv beseitigen zu können. Weniger angewendet, doch erste Wahl der Therapie sollte die minimal invasive Mikroabrasionsbehandlung sein. Dabei werden mit abrasiven und säurehaltigen Pasten die innerhalb der Oberfläche liegenden Verfärbungen beseitigt. Über die Größe des Schmelzabtrages in der zahnärztlichen Literatur findet man nur geringe metrische Angaben. Deshalb ist Ziel dieser vorliegenden Studie die Untersuchung des Schmelzsubstanzabtrages durch Mikroabrasion mit der Mikroabrasionspaste Opalustre® in den Bearbeitungszeiten von 5, 50 und 100 Sekunden, mit gleich bleibendem Anpressdruck und Umdrehungszahl und so herauszufinden, ob bei konstantem Druck und Umdrehungszahl die Größe des Abriebs mit der Behandlungszeit korreliert. Humane extrahierte Zähne dienten dabei als In-vitro-Testsystem. Die Analyse des Schmelzabtrages erfolgte an Dünnschnitten der behandelten humanen Zähne unter einem Lichtmikroskop bei 50 facher Vergrößerung. Auf die Labialflächen von 21 extrahierten und in 0,1 %-iger Thymollösung gelegten Zähnen wurde eine eingefärbte Bondingschicht mittig als Referenzfläche aufgetragen. Die in drei Versuchsgruppen aufgeteilten Zähne wurden dann mit der Mikroabrasionspaste Opalustre® für 5, 50 und 100 Sekunden bei einem Druck von etwa 200 g, bei etwa 135 U/min (Kavo-Reduzierwinkelstück, Doppelring grün 7,4:1 bei 1000 U/min) mit der Paste und dem dazugehörigen Polierkelch (Opal Cups-Bristle™) mikroabradiert. Nach Einbetten der Zahnkronen in Kunststoffblöcke wurden sie in ca. 0,7 mm (± 0,1mm) dicke Scheiben (Proben) geschnitten und unter dem Lichtmikroskop quantitativ nach dem Schmelzabtrag untersucht. Der Mittelwert des Substanzabtrages bei 5 Sekunden Bearbeitungszeit lag bei 14,80 µm, bei 50 Sekunden bei 20,86 µm und bei 100 Sekunden bei 23,74 µm. Die Ergebnisse sind signifikant. Damit wurde gezeigt, daß eine Anwendungszeit von 50 oder 100 Sekunden nicht effektiver ist als 5 Sekunden. Ein häufiger 5 Sekunden Wechsel mit wiederholt neuem Auftragen frischer Mikroabrasionspaste, entgegen der Herstellerangaben, zeigt einen effizienteren Abtrag als eine Zeitverlängerung. Für Fluorose bedingte Verfärbungen 2. Grades könnte somit in ca. 30 Sekunden mit Opalustre® (bei einer Umdrehungszahl von 135 rpm und einem Druck von 200 g) ein genügend tiefer Abtrag des betroffenen Schmelzareals (ca. 100 µm) mit dem gelieferten Kelch (OpalCups-Bristle™) stattfinden, wenn alle 5 Sekunden die Paste neu aufgetragen wird.
Kronenfrakturen, insbesondere im Rahmen von Frontzahntraumata, nehmen einen immer größeren Stellenwert bei der Behandlung von Kindern und Jugendlichen ein. Da auch in Zukunft mit einem weiteren Anstieg derartiger Verletzungen zu rechnen ist, muss an minimal-invasiven, ästhetischen und ökonomischen Therapiemöglichkeiten geforscht werden. Die Fragmentbefestigung mit Hilfe von Dentinadhäsiven mit oder ohne zusätzliche Verwendung von fließfähigem Komposit stellt derzeit die Methode der Wahl dar. Da es in den letzten Jahren zu einer Umstellung von Mehrflaschen-Adhäsiven auf Einflaschen-Adhäsive gekommen ist, sollten in der vorliegenden Arbeit Dentinadhäsivsysteme verschiedenen Generationen bezüglich ihres Bruchverhaltens nach Versagen der adhäsiven Befestigung getestet werden. Zudem sollte herausgefunden werden, ob unterschiedliche Frakturverläufe im Schmelz- und Dentinbereich zu beobachten sind. Humane extrahierte Zähne aus einer vorangegangenen Studie zur Bruchfestigkeit von Dentinadhäsiven dienten als In-vitro-Testsystem. Die Dentinadhäsive OptiBond FL®, Syntac®, AdheSE®, Adper® Prompt® L-Pop® sowie die kombinierte Anwendung von OptiBond FL® mit dem fließfähigen Komposit Tetric® Flow wurden anhand von lichtmikroskopischen Bruchflächenanalysen auf ihr Frakturverhalten nach Versagen der Fragmentbefestigung untersucht. Die Adhäsivsysteme untereinander unterschieden sich dabei bezüglich der Frakturverläufe kaum. Abweichungen gab es allerdings zwischen Schmelz- und Dentinbereich. Während es im Schmelzbereich zu einem ausgeglichenen Verhältnis von Kohäsiv- und Adhäsivfrakturen kam, dominierte im Dentinbereich der Anteil an Kohäsivfrakturen innerhalb des Restaurationsmaterials. Lediglich das Adhäsivsystem Syntac® fiel durch einen erhöhten Anteil an Adhäsivfrakturen im Dentinbereich und Adper® Prompt® L-Pop® durch einen hohen Prozentsatz an Adhäsivfrakturen im Schmelzbereich auf. In der Literatur werden Kohäsivfrakturen häufig mit hohen Haftwerten und Adhäsivfrakturen mit niedrigen Verbundfestigkeiten zwischen Zahn und Adhäsiv in Verbindung gebracht. Bei Adper® Prompt® L-Pop® konnte im Rahmen der vorangegangenen Studie eine verminderte Bruchfestigkeit gegenüber den anderen Adhäsivsystemen bestätigt werden. Zur Wiederbefestigung von Kronenfragmenten sind somit die modernen „Einflaschen-Adhäsivsysteme“ derzeit noch nicht zu empfehlen. Gefüllte Dentinadhäsive, wie OptiBond FL®, scheinen hingegen aufgrund ihrer höheren Bruchfestigkeit und ihrer langen klinischen Erfahrung für die Fragmentbefestigung geeignet zu sein.
In einer vorangegangenen In-vitro-Untersuchung wurden die pallatinalen Wurzeln menschlicher Molaren im Scherversuch (10mm/Min) gebrochen. Zahnfragmente wurden mit Hilfe verschiedener Dentinhaftvermittler (OptiBond FL, Syntac, Adhese, Prompt L-Pop und OptiBond FL in Kombination mit Tetrac Flow) adhäsiv wiederbefestigt. Die so rekonstruierte Zahneinheit wurde erneut an der ursprünglichen Bruchfläche gebrochen und die Bruchfestigkeit ermittelt. In der vorliegenden In-vitro-Untersuchung wurden die Bruchflächen der erneut gebrochenen Zähne digital abfotografiert und lichtmikroskopisch untersucht, um den Frakturmodus zu ermitteln. Die Frakturmodi (Adhäsivfraktur, Kohäsivfraktur im Dentin oder Befestigungsmaterial) wurden absolut und in Relation zur gesamten Bruchfläche ermittelt. Hierzu wurde ein spezielles CAD-Programm verwendet. Mittels statistischer Tests wurden die Adhäsivsysteme auf signifikante Unterschiede hinsichtlich der aufgetretenen Frakturmodi untersucht. Ergebnisse: Keine signifikanten Unterschiede. Kohäsivfrakturen im Befestigungsmaterial traten unabhängig vom Dentinhaftvermittler am häufigsten auf. Vor allem konnte dieser Bruchmodus bei Verwendung von OptiBond FL beobachtet werden. Adhäsivfrakturen traten am zahlreichsten bei Gebrauch von Prompt L-Pop und Kohäsivfrakturen im Dentin bei Verwendung von Syntac auf.