610 Medizin und Gesundheit
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Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host.
Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt.
Butyrat ist die wichtigste kurzkettige Fettsäure im Kolon und dient der normalen Schleimhaut als trophischer Faktor. Butyrat hat paradoxe Effekte auf Epithelzellen des Kolons: Hauptenergieträger und Wachstumsstimulator normaler Mukosa einerseits, Proliferationshemmer und Apoptoseinduktor kolorektaler Karzinomzellen in vitro andererseits. Butyrat kann zudem die Immunfunktionen der Schleimhaut modulieren. Die einzellige Schicht des Dickdarmepithels ist eine aktive Barriere gegen die intestinalen Bakterien im Kolonlumen. Zusätzlich zur Bildung einer physischen Barriere ist das Epithel mit verschiedenen Effektormolekülen ausgestattet, zu welchen auch antimikrobielle Peptide zählen. Antimikrobielle Peptide spielen eine wichtige Rolle als endogene Antibiotika in der angeborenen Immunabwehr. Es sind kleine kationische Peptide von weniger als 100 Aminosäuren Länge. Sie kommen konserviert bei Insekten, Tieren, Pflanzen und dem Menschen vor. Diese Peptide werden in Zellen des Immunsystems, aber auch in Epithelzellen exprimiert und sezerniert. Sie wirken gegen gram-positive und –negative Bakterien, Viren und Pilze. Zusätzlich zu Ihrem antimikrobiellen Effekt üben diese Peptide einen chemotaktischen Reiz auf unterschiedlichste Immunzellen aus, darunter neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen und T-Zellen, stimulieren die Chemokinfreisetzung durch Monozyten, induzieren die Mastzelldegranulation und können das Komplementsystem aktivieren. Beim Menschen sind bisher zehn Defensine und das humane Cathelicidinpeptid LL-37 beschrieben worden. Letzteres war auch Gegenstand unserer Forschungen. LL-37 wird in den Granula von neutrophilen Granulozyten gespeichert und in Knochenmark und Hoden, sowie in Hautkeratinozyten, Lungenepithel, und Plattenepithel der Zunge, des Ösophagus, der Zervix und Vagina exprimiert. In dieser Arbeit wurde die Expression und Modulation des einzigen humanen antimikrobiellen Cathelicidins LL-37 durch Entzündungsmediatoren oder Ernährungsfaktoren untersucht. Die untersuchten Zytokine, darunter TNFa und verschiedene proinflammatorische Interleukine zeigen keinen Einfluss auf die LL-37 Expression in Kolonepithelzellen. Die Expression des antimikrobiellen Peptids scheint dagegen stark mit Zelldifferenzierung verbunden zu sein. Nur differenzierte Epithelzellen im menschlichen Kolon und Ileum exprimieren LL-37 in vivo. Faktoren im Kolonlumen können dagegen einen Einfluss auf die Expression von LL-37 Expression in Kolonepithelzellen ausüben. Insbesondere kurzkettige Fettsäuren, die bei der bakteriellen Fermentation unverdauter Kohlenhydrate im Kolonlumen entstehen und die eine Zelldifferenzierung herbeiführen, induzieren in vitro die Expression des antimikrobiellen LL-37 in verschiedenen Kolonepithelzellen. Gleichzeitig steigert Butyrat die Differenzierung in den untersuchten Zellen. In Primärkulturen kolorektaler Karzinome und normaler Kolonschleimhautepithelzellen induzierte Butyrat die LL-37 Expression nur in undifferenzierten Tumorzellen. Als nächstes wurden Signalwege gesucht, die an der Regulation von LL-37 und der Differenzierung eine Rolle spielen. In Kolonepithelzellen verhindert eine MEK-ERK Blockade eine LL-37 Induktion – ohne die Differenzierung zu beeinträchtigen. Bei einer Blockade des p38/MAP-Kinase Weges stellte es sich genau andersherum dar: Die Differenzierung wurde gehemmt, aber die LL-37 Expression wurde nicht beeinflusst. Somit wird die LL-37 mRNA Transkription in Kolonepithelzellen über den MEK/ERK Signalweg und die Differenzierung in denselben Zellen über den p38/MAP-Kinase Signalweg reguliert. In undifferenzierten Monozyten kann wie schon in Kolonepithelzellen eine Induktion der LL-37 Expression nach Inkubation mit SCFAs beobachtet werden. Bei reifen PBMC jedoch inhibiert Butyrat eine LL-37 Transkription. In nicht differenzierten Monozyten blockt ein MEK/ERK-Hemmer die LL-37 Expression wie in Kolonepithelzellen, dagegen hat diese Blockade in reifen PBMC keine Auswirkung auf die LL-37 Konzentration. Deshalb können noch weitere unbekannte Mechanismen an der LL-37 Regulation in Darmepithelzellen und den LL-37 exprimierenden Immunzellen beteiligt sein. Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die Regulation des antimikrobiellen Cathelicidins LL-37 in der menschlichen Darmschleimhaut und kann vielleicht die Basis für eine therapeutische Manipulation der LL-37 Expression liefern. Es muss jedoch noch geklärt werden, ob Butyrat oder andere Ernährungsfaktoren die Schleimhautbarriere dadurch stärken können, indem das Peptid LL-37 und oder andere Effektormoleküle der angeborenen Immunabwehr in vivo hochreguliert werden.
The transcriptional repressor-Blimp-1 terminates differentiation of B lymphocytes as well as myeloid cells. Our data show that Blimp-1 is highly expressed in freshly isolated murine primary T lymphocytes, particularly its minor splice variant. Ectopic expression of Blimp-1 by retroviral transduction neither dramatically altered secretion of IFN-ã or IL-4 nor did it induce the ability to suppress as regulatory T cells. However, induction of Blimp-1 resulted in not only a significant reduction in the production of IL-2 but also an inability to proliferate as well as in the reduced viability. These results demonstrate that Blimp-1 might mark end stages of lineage differentiation in T cells.