610 Medizin und Gesundheit
Refine
Has Fulltext
- yes (3) (remove)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Journal article (2)
- Doctoral Thesis (1)
Keywords
- tumor cells (3) (remove)
Background
To use combinatorial epitope mapping ("fingerprinting") of the antibody response to identify targets of the humoral immune response in patients with transitional cell carcinoma (TCC) of the bladder.
Methods
A combinatorial random peptide library was screened on the circulating pool of immunoglobulins purified from an index patient with a high risk TCC (pTa high grade plus carcinoma in situ) to identify corresponding target antigens. A patient cohort was investigated for antibody titers against ubiquitin.
Results
We selected, isolated, and validated an immunogenic peptide motif from ubiquitin as a dominant epitope of the humoral response. Patients with TCC had significantly higher antibody titers against ubiquitin than healthy donors (p<0.007), prostate cancer patients (p<0.0007), and all patients without TCC taken together (p<0.0001). Titers from superficial tumors were not significantly different from muscle invasive tumors (p = 0.0929). For antibody response against ubiquitin, sensitivity for detection of TCC was 0.44, specificity 0.96, positive predictive value 0.96 and negative predictive value 0.41. No significant titer changes were observed during the standard BCG induction immunotherapy.
Conclusions
This is the first report to demonstrate an anti-ubiquitin antibody response in patients with TCC. Although sensitivity of antibody production was low, a high specificity and positive predictive value make ubiquitin an interesting candidate for further diagnostic and possibly immune modulating studies.
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.
Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).
Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.
In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.
Krebs durch gezielte Zerstörung seiner Energien zu besiegen, ist einer von mehreren vielversprechenden neuen experimentellen Therapieansätzen, die insbesondere in den letzten Jahren in den Fokus des Interesses gerückt sind. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein Modell zu entwickeln, mit dem die Wirkung von 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP), ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung, auf den Wärmehaushalt einer Vielzahl an benignen und malignen Zelllinien mit der Methode der Mikrokalorimetrie analysiert werden kann. Nach zahlreichen Vorversuchen konnte schließlich ein adäquates Messsystem definiert werden, das den Anforderungen eines großen Stichprobenumfangs gerecht wurde: die zu untersuchenden Zellen wurden auf 200 mm2 großen Glasplättchen als Monolayer kultiviert und in sonderangefertigten Stahlampullen in einem Mediumvolumen von 3.6 ml unter Verwendung eines geschlossenen Mikrokalorimetriesystems hinsichtlich ihrer Wärmeproduktion für eine Dauer von 9 Stunden untersucht. Störfaktoren wie insbesondere Mediumveränderungen oder Substratlimitierungen konnten durch ergänzende Untersuchungen ausgeschlossen werden. Die Vorversuche und erste Datenanalysen der Versuchsreihen mit der pA1-Zelllinie identifizierten einen unerwarteten Störfaktor: die Plättchendichten variierten trotz strikter Standardisierung bei der Kultivierung der Monolayer erheblich. Um diesen Störfaktor in den Datenanalysen zu berücksichtigten, wurde daher eine verlässliche und exakte Methode zur Ermittlung der Plättchendichten gesucht. 3 verschiedenen Methoden wurden hierfür auf ihre Eignung überprüft, bis schließlich der LDH-Test als adäquates Verfahren zur Bestimmung der Plättchendichten ausgewählt wurde. Anschließend erfolgte ein Testdurchlauf mit 4 Zelllinien und 4 unterschiedlichen Dosisstufen 2,4-DNP (zuzüglich der Nulldosis). Nach Durchführung der ersten Versuchsreihen mit der pA1 Zelllinie konnte ein weiterer Störfaktor identifiziert werden: der ‚crowding-Effekt’. Dieser beschreibt das Phänomen, dass mit zunehmender Zellzahl in einer Kultur die Stoffwechselrate und somit auch die Wärmeproduktion einer Zelle abnimmt. Der crowding-Effekt wurde im Rahmen mikrokalorimetrischer Arbeiten unter Verwendung offener Systeme und somit Zellsuspensionen mehrfach beschrieben und diskutiert. Die vorliegende Arbeit konnte einen crowding-Effekt nun auch für Monolayer nachweisen. Für die vorliegenden Daten konnte der Zusammenhang zwischen Wärmeproduktion und Zellzahl mittels Regressionsanalyse mit der mathematischen Funktion lgY=-0.83lgX+6.31 bei einer Verlässlichkeit der Schätzung von R2=0.9003 beschrieben werden. Als spezifische Ursachen für einen crowding-Effekt bei Monolayern wurden angenommen: - Diffusionsprobleme bedingt durch ungerührtes Medium um die Plättchen herum, - wider Erwarten dreidimensionales Wachstum auf den Plättchen, oder, - Wachstumsinhibition durch Kontakthemmung der Zellen auf den Plättchen. Der Störfaktor crowding-Effekt ist auf Grund seines dynamischen Charakters schwierig zu eliminieren. Dennoch konnten Möglichkeiten aufgezeigt werden, das Ausmaß des crowding-Effekts deutlich zu reduzieren, so dass das Modell optimiert werden konnte. Der multivariate Charakter sowie der große Umfang der Daten stellte hohe Anforderungen an eine geeignete Methodik für eine Auswertung der Daten. Auf Erfahrungen anderer Arbeiten konnte nicht zurückgegriffen werden, da bis dato keine Arbeiten von solch großem Stichprobenumfang durchgeführt wurden. Einfache statistische Analysen stellten sich als nicht geeignet heraus. Mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Kennwert und dem Verfahren nach Wei und Lachin konnten jedoch schließlich zwei Instrumente für eine adäquate Datenanalytik bestimmt werden, die eine Datenanalyse im Sinne der Fragestellung des Projektes umfassend erlauben. Eine erste Auswertung der Daten des Testdurchlaufs zeigte, dass vor allem niedrigere Dosisstufen im Konzentrationsbereich bis 50 µM 2,4-DNP interessant sind. Ergänzende Datenanalysen wiesen darauf hin, dass 2,4-DNP offenbar die Stoffwechselaktivität von Zellen unmittelbar nach Zugabe um einen bestimmten Betrag erhöht und diese dann auf diesem Niveau kontinuierlich für eine bestimmte Zeit anhält, bis schließlich ein Wirkmaximum erreicht wird, das von der Höhe der Dosis abhängt. Als Ursachen für die je nach Dosisstufe unterschiedlich lange Wirkung von 2,4-DNP wurden verschiedene Ursachen diskutiert, die es weiter abzuklären gilt. Wahrscheinlich scheint jedoch eine Zytotoxizität höherer Dosierungen. Durch die ergänzende Analytik bestimmter Stoffwechselparameter gelang es, den crowding-Effekt auch für den spezifischen Glucose-Verbrauch nachzuweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass 2,4-DNP nicht nur durch Kurzschluss des Protonengradienten die Wärmeproduktion erhöht, sondern auch den Substratverbrauch der Zelle steigert: bei einer Konzentration von 100 µM 2,4-DNP erhöhte sich der spezifische Glucoseverbrauch um etwa 50%. Untersuchungen der Laktatproduktion ließen außerdem vermuten, dass die Stoffwechselsteigerung von 2,4-DNP eher oxidativ bedingt ist. Durch die vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein geeignetes Messsystems für die mikrokalorimetrische Analyse einer Vielzahl an Zellen etabliert werden. Durch einen anschließenden Testdurchlauf mit 4 unterschiedlichen Zelllinien konnte zudem das System optimiert und eine adäquate Methodik für eine aussagekräftige Datenanalyse bestimmt werden. Es steht somit ein Modell zur Verfügung, mit dem die Wärmeproduktion einer Vielzahl an Zelllinien auf die Wirkung von 2,4-DNP, aber auch von anderen Substanzen, untersucht werden kann, was schließlich die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen ermöglicht.