610 Medizin und Gesundheit
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In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden Sphäroide aus mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe oder dem Knochenmark mittels der Micromold-Methode hergestellt. Den Sphäroiden wurden entweder Calciumphosphat- oder Calcium-Magnesium-Phosphat-Partikel hinzugefügt. Zum einen sollte überprüft werden, ob die Zugabe von Partikeln die osteogene Differenzierung der Sphäroide fördert und somit zur weiteren Entwicklung von körpereigenem Knochenersatzmaterial in der regenerativen Medizin beiträgt. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine der beiden Biokeramiken hinsichtlich der osteogenen Differenzierung überlegen ist.
Heutige chirurgische Situationen können zeitweise den Einsatz eines Knochenkleber erfordern, welcher sich jedoch noch nicht in der klinischen Praxis etablieren konnte. In jüngster Vergangenheit haben mit Phosphoserin modifizierte Zemente (PMC) auf der Grundlage von Verbindungen zwischen o-Phosphoserin (OPLS) und Calciumphosphaten wie Tetracalciumphosphat (TTCP) oder α-Tricalciumphosphat (α-TCP) an Popularität gewonnen. Ebenso bekommen chelatbildende Magnesiumphosphatzemente als mineralische Knochenadhäsive mehr Zuspruch. In dieser Arbeit wurden neue mineralorganische Knochenzemente auf der Basis von Phosphoserin und Magnesiumphosphaten oder -oxiden untersucht, die hervorragende Hafteigenschaften besitzen. Diese wurden mittels Röntgenbeugung, Fourier-Infrarot-Spektroskopie und Elektronenmikroskopie analysiert und mechanischen Tests unterzogen, um die Haftfestigkeit am Knochen nach Alterung unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen. Die neuartigen biomineralischen Klebstoffe zeigen eine ausgezeichnete Haftfestigkeit an Knochen mit etwa 6,6-7,3 MPa unter Scherbelastung. Die Adhäsive sind auch aufgrund ihres kohäsiven Versagensmusters und ihres duktilen Charakters vielversprechend. In diesem Zusammenhang sind die neuen adhäsiven Zemente den derzeit vorherrschenden Knochenadhäsiven überlegen. Ergänzend wurde versucht, dieses neue System mit unterschiedlichen Additiven zu modifizieren. Dabei wurde Mannit erfolgreich als Porogen verwendet. Dreiarmiges sternförmiges NCO-sP(EO-stat-PO) sollte die adhäsiven Eigenschaften und das Leistungspotenzial unter Wasser verbessern. Zuletzt wurden mit Glycerol präfabrizierte Pasten hergestellt, welche gelagert werden können und bei Kontakt mit Wasser aushärten. Generell ist zu betonen, dass künftige Bemühungen um Knochenklebstoffe aus Phosphoserin und Mg2+ sehr lohnenswert erscheinen.
Zelluläre Resorption 3D-gedruckter Knochenimplantate auf Basis von Calciummagnesiumphosphaten
(2023)
Für die Behandlung von Knochendefekten kritischer Größe gibt es heute eine Reihe von Therapiemöglichkeiten. Neuartige Ansätze mit Magnesiumphosphat- (MPC) und Calciummagnesiumphosphatzementen (CMPC) haben sich als echte Alternativen zu den etablierten Calciumphosphaten erwiesen.
Ziel war es, die Osteoklastogenese in vitro auf 3D-pulvergedrucktem CMPC und MPC zu induzieren und die zelluläre Resorption (zR) zu analysieren. Polystyrol (PS), Glas, β-TCP und Brushit-bildender Zement dienten als Referenzen.
Als Proben wurden Zemente der allgemeinen stöchiometrischen Summenformel CaxMg(3–x)(PO4)2 (x = 0; 0,25; 0,75; 3) verwendet, die Struvit oder Newberyit enthielten. Für die Osteoklastogenese wurden monozytenangereicherte PBMCs aus Buffy-Coat mittels dreifacher Dichtegradientenzentrifugation isoliert, auf die Prüfoberflächen ausgesät und über einen Zeitraum von 22 Tagen mit Zytokinen (M-CSF und RANKL) stimuliert. Die Interaktion der Zellen mit den Zementen bzw. PS/Glas wurde mittels TRAP-Färbung und -Aktivität, DNA- und Ionenkonzentrationen (Ca2+, Mg2+, PO43–, pH-Wert), Rasterelektronen-, Durchlicht-, Auflicht- und Fluoreszenzmikroskopie analysiert.
Auf den Struvit- und Newberyit-bildenden Zementen konnten keine für Osteoklasten typischen Riesenzellen nachgewiesen werden. Auf den Struvit-bildenden Zementen wurde deutlich mehr mononukleäre Zellen nachgewiesen wurden als auf den Newberyit-bildenden Zementen. Während die Freisetzung von Mg2+ und PO43– ausschließlich durch die chemische Degradation erfolgte, wurde Ca2+ zunächst adsorbiert und anschließend durch zR freigesetzt. Die erhöhte Ca2+-Adsorption im Vergleich zur Ca2+-Resorption führte insgesamt zu einer Calcium-Präzipitation.
Da lediglich auf β-TCP Resorptionslakunen beobachtet wurden, wird angenommen, dass auf den CMPC, MPC und Brushite-bildenden Zementen die zellvermittelte Ca2+-Freisetzung von den Präzipitaten ausging, die von Makrophagen auf den Zementen und/oder Riesenzellen auf den Wellplatten resorbiert wurden.
Der steigende Bedarf an Knochenersatzmaterialien (KEM) in Medizin und Zahnmedizin verdeutlicht die Notwendigkeit der Etablierung weiterer alloplastischer, also synthetisch hergestellter, KEMs. Additive Fertigung ermöglicht die Herstellung patientenspezifischer Implantate. Hierfür wird auf Basis von 3D Bildgebung eines Knochendefekts, ein Implantat mittels CAD geplant und anschließend mittels additiver Fertigung, zum Beispiel durch 3D Pulverdruck hergestellt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des osteogenen Potentials in vitro von Calciummagnesiumphosphatkeramiken mit der allgemeinen Strukturformel CaxMg(3-x)(PO4)2 mit x = 0; 0,25; 0,75; 1,5; 3 aus additiver Fertigung. Hierfür wurden Prüfkörper mittels 3D Pulverdruck gedruckt, anschließend durch Hochtemperatursinterung verfestigt und durch Behandlung mit reaktiven Lösungen nachgehärtet. Abhängig von der reaktiven Lösung wandelte sich die Keramik teilweise in Struvit, Bruschit und Newberyit um. Die biologische Testung in vitro erfolgte mit hFOB 1.19 Zellen und ergab eine gute Biokompatibilität sowie die Ausdifferenzierung osteogener Progenitorzellen für fast alle Keramikphasen, wobei die newberyithaltigen Keramiken tendenziell bessere Ergebnisse erzielten.
Synthetische anorganische Knochenersatzmaterialien auf Calcium-Phosphat- und Magnesium-Phosphat-Basis wurden in der hier vorliegenden Dissertation mit verschiedenen handelsüblichen Antibiotika versetzt und deren Freisetzungsverhalten charakterisiert. Zudem wurde der Einfluss des Antibiotikazusatzes auf bestimmte materialcharakteristische Eigenschaften untersucht, hierbei fanden die Quecksilberporosimetrie, die Röntgendiffraktometrie und die Rasterelektronenmikroskopie ihre Anwendung. Insbesondere für die Knochenersatzmaterialien auf Calcium-Phosphat-Basis sollte eine klinisch praktikable und demnach möglichst einfache Methode etabliert werden, um die Kombination mit einem Antibiotikum durchzuführen. Die Detektion der Antibiotika erfolgte mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrophotometers. Zudem wurde für einige ausgewählte Kombinationen aus Antibiotikum und Knochenersatzmaterial durch einen Agardiffusionstest die antibakterielle Wirkung nach der Freisetzung aus dem jeweiligen Trägermaterial bestätigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche zementbasierte Knochenersatzmaterialien hinsichtlich ihres Potentials zur Behandlung knöcherner Defekte in vivo untersucht. Zwei verschiedene Calcium-dotierten Magnesiumphosphat Zementformulierungen (CMPC) wurden mit einem Referenzmaterial aus Calciumphosphat Zement (CPC) verglichen. Dazu wurden auf Basis von CMPC präfabrizierte, injizierbare Pasten bzw. sphärische Granulate hergestellt und anhand von orthotopen, potenziell kraftbelasteten Defekten in Kaninchenfemora getestet. Zentrales Ziel hierbei war es, herauszufinden, wie sich die Materialien in Defektsituationen mit Hartgewebekontakt biologisch verhalten und degradieren bzw. in Knochen umbauen. Nach einer Liegedauer von 6 bzw. 12 Wochen wurden die Knochenneubildung und die Degradation der Materialien mittels Histomorphometrie analysiert.
Alle Materialien waren biokompatibel und führten zur Bildung von neuem Knochen. Der CMPC-Zement zeigte im Vergleich zu CPC einen beschleunigten Abbau, während sich am Referenzmaterial mehr mineralisierter Knochen bildete. Die untersuchten Calcium-dotierten Struvit-bildenden Magnesiumphosphatzemente erwiesen sich als biokompatibel, gut resorbierbar und stellen mit ihrer Fähigkeit zur Knochenbildung ein vielversprechendes Knochenersatzmaterial dar.
Knochenklebstoffe, welche eine unkonventionelle Möglichkeit im Bereich der chirurgischen Frakturversorgung darstellen, müssen bereits in vitro eine Reihe an klinischen Anforderungen erfüllen. Hinsichtlich entsprechender Prüfverfahren wurde noch keine Normierungsarbeit geleistet, weswegen Ergebnisse verschiedener Arbeiten schwierig vergleichbar sind.
Ziel der Arbeit war es daher Prüfverfahren vorzustellen, welche die Besonderheiten des „Werkstoffes Knochen“ berücksichtigen. In diesem Rahmen werden zwei neuartigen Klebstoffsysteme, ein in situ härtender Knochenzement aus Trimagnesiumphosphat, Magnesiumoxid und organischer Phytinsäure und ein lichthärtender Knochenklebstoff aus Polyethylenglycoldimethacrylat, NCO-sP(EO-stat-PO), Campherchinon und anorganischen Newberyit-Füllern, vorgestellt. Neben diesen sind drei kommerziell erhältliche Klebstoffe Gegenstand der Untersuchung. Dies sind zum einen Histoacryl® und TruGlue® Gewebekleber, zwei Klebstoffe auf Cyanoacrylat-Basis mit unterschiedlich langer Alkyl-Seitenkette, zum anderen Bioglue®, ein Gewebekleber aus Albumin und Glutaraldehyd.
Bei den Klebstoffen wurde die Zug- und Scherfestigkeit unter Einfluss der physiologischen Klebstoffalterung, der Variation der Klebefugenbreite, der Variation von komplementären Fügeteilen, sowie Fügeteiloberflächen inspiziert. Makro- und mikroskopische, sowie elektronenmikroskopischen Untersuchung der Bruchflächen auf mikrostrukturelle Besonderheiten und Versagemechanismus wurden angestellt.
Die neuartigen Klebstoffsysteme unterliegen zwar den konventionellen Cyanoacrylaten hinsichtlich mechanischer Parameter, weisen aber dennoch adäquate Klebefestigkeiten auf bei zugleich zahlreichen Vorteilen gegenüber konventionellen Systemen im Umgang mit Knochen.
Gerade der Magnesiumphosphatzement scheint auf Grund mechanischer Parameter und Vorzügen wie der guten Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit, Osteoinduktivität, Osteokonduktivität, der einfachen Applizierbarkeit, einem hohen Kosten-Nutzen-Faktor oder dem günstigen Verhalten in wässrigen Milieu vielversprechend.
Untersuchungen zum Abbindeverhalten und der Injizierbarkeit von Magnesiumphosphat-Knochenzementen
(2018)
Ziel dieser Arbeit war die experimentelle Untersuchung von selbsthärtenden Magnesiumphosphat Zementen als Knochenersatzmaterial bezüglich der Verarbeitungsqualität, der Temperaturentwicklung beim Abbinden, der Injizierbarkeit und der mechanischen Eigenschaften. Der Schwerpunkt wurde dabei auf die Anpassung der rheologischen Eigenschaften der Zementpaste für eine minimal–invasive Applikation gelegt. Durch eine elektrische Aufladung der Partikeloberfläche von Farringtonit nach Adsorption von Citrat–Ionen und Zusatz der biokompatiblen Füllstoffe Struvit oder TiO2 für die Einstellung einer bimodalen Partikelgrößenverteilung, war es möglich, die Viskosität der Pasten zu erniedrigen und den filter–pressing−Effekt während der Injektion zu unterdrücken. Die Modifikation des Mg3(PO4)2 Pulvers und der flüssigen Phase erlaubte bei einer Verarbeitungszeit von ca. 10 min die nahezu quantitative Injektion des Zements durch eine 40 mm lange Kanüle mit einem inneren Durchmesser von ca. 800 μm. Zemente mit dem P/L–Verhältnis von 2,0 g/ml erreichten so eine Festigkeit von über 50 MPa nach 24 h Aushärtung. Obwohl die exotherme Abbindereaktion der Zemente teilweise zu einer Erwärmung auf bis zu 67 °C führte, geben literaturbekannte in vivo Studien keinen Hinweis auf Nebenwirkungen innerhalb des umliegenden Hart- bzw. Weichgewebes, was den Verdacht einer möglichen thermischen Nekrose aufgrund der exothermen Abbindereaktion ausschließt. Dies liegt eventuell auch darin begründet, dass die Temperaturmessungen in dieser Arbeit mit einer verhältnismäßig großen Menge an Zementpaste (∼15 g) durchgeführt wurden, während in vivo doch eher geringere Mengen (< 5 g) appliziert werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Modifizierung von porösem, calciumdefizitärem, nanokristallinem Hydroxylapatit mit verschiedenen Metallionen zu testen. Es wurden α‑TCP‑basierende Zementproben hergestellt, die durch zwei verschiedene Dotierungsmethoden mit bestimmten Metallionen (Cu2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, V3+, Zn2+) modifiziert wurden. Die eine Methode bestand in der Zusinterung der entsprechenden Metallionen zum α‑TCP‑Pulver. Bei der anderen Methode waren die Ionen in unterschiedlicher Konzentration (1 mmolar, 100 μmolar, 10 μmolar) in der Binderlösung enthalten. Die hergestellten Zementproben wurden hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie der initialen Abbindezeit und Druckfestigkeit untersucht und zusätzlich rasterelektronenmikroskopischen, röntgen-diffraktometrischen und massenspektrometrischen Analysen unterzogen. Als Referenz diente ein bereits am Menschen erfolgreich als Knochenersatzmaterial eingesetzter nanokristalliner, calciumarmer Hydroxylapatit-Zement. Da Hydroxylapatit nahezu nur durch Osteoklasten mittels einer lokalen pH‑Wert-Absenkung resorbiert werden kann, wurden in‑vitro‑Versuche mit einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie durchgeführt. Über einen 15‑tägigen Versuchszeitraum wurde die Zytokompatibilität mittels bestimmter Zellproliferations- und Zellaktivitätsmessungen überprüft. Zusätzlich wurden die mit Zellen besiedelten Proben unter dem Rasterelektronenmikroskop betrachtet und eine TRAP‑Färbung durchgeführt, um die Differenzierung zu osteoklastenähnlichen Zellen beurteilen zu können.
Bei der Auswertung der Versuche wurde deutlich, dass nicht das Metall alleine maßgeblich für Veränderungen der physikalischen Eigenschaften im Vergleich zum metallfreien Referenzzement war. Auch die Art der Metallionendotierung, ob durch Zugabe mit der Binderlösung oder durch Zusinterung, hatte bei den Metallen unterschiedliche Auswirkungen auf die Zementeigenschaften. Während der Versuche wurden Abbindezeiten von 18 Minuten bis über 60 Minuten gemessen und Druckfestigkeiten zwischen 9,3 MPa und 30,5 MPa festgestellt. Bei der Auswertung der Zellversuchsreihe wurde festgestellt, dass die Zellen auf den mit Metallionen modifizierten Zementplättchen tendenziell eine niedrigere Aktivität bei gleich bleibender Proliferation aufwiesen als auf den metallfreien Referenzproben. Dieses Ergebnis konnte mikroskopisch bestätigt werden.