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In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden Sphäroide aus mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe oder dem Knochenmark mittels der Micromold-Methode hergestellt. Den Sphäroiden wurden entweder Calciumphosphat- oder Calcium-Magnesium-Phosphat-Partikel hinzugefügt. Zum einen sollte überprüft werden, ob die Zugabe von Partikeln die osteogene Differenzierung der Sphäroide fördert und somit zur weiteren Entwicklung von körpereigenem Knochenersatzmaterial in der regenerativen Medizin beiträgt. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine der beiden Biokeramiken hinsichtlich der osteogenen Differenzierung überlegen ist.
Für die Verwendung von zellbasierten Therapeutika ist vor allem die korrekt Identifikation
sowohl vom Ausgangsmaterial wie auch dem produziertem Material von
zentraler Wichtigkeit. In dieser Arbeit wurde eine Methodik entwickelt, welche eine
nicht-invasive Klassifizierung von Zellen und zellulärer Entwicklung aufgrund ihrer
zweidimensionalen Magnetresonanz-Korrelationsspektren ermöglichte.
Hierzu wurde ein mobiler MR-Scanner mit einer Feldstärke von 0.5T und einem Isozentrum
von 1 cm3 verwendet. Aufgrund der kompakten und leichten Bauweise war
es möglich, das System in normalen Zellkulturlaboren zu verwenden. Von den Proben
wurde ein zweidimensionales T1/T2 -Korrelationsspektrum aufgenommen, anhand
dessen die Zellen klassifiziert werden sollten. Mithilfe von Agarose-Dotagraf® -Zell-
Phantomen konnte die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Messsystems und der
verwendeten Sequenz validiert werden.
Aufgrund der unter Umständen recht langen Messzeiten der MR-Technologie war
auch die Handhabung und Kultur der Zellproben während des Messprozesses von
großer Bedeutung. Um hierfür den Durchsatz an Proben zu erhöhen, wurde eine kostengünstige
und ebenfalls mobile Robotikanlage entwickelt. Diese basierte auf dem
kommerziell erhältlichen Roboterarm Braccio, welcher durch einen Arduino Mega
Mikrocontroller gesteuert wurde. Mit bis zu 24 Proben pro Tag konnte durch die
Automatisierung der Durchsatz an Proben um den Faktor 3 – 4 gesteigert werden.
Durch den entwickelten Prozess war es möglich, eine umfangreiche Datenbank –
bestehend aus 362 unabhängigen Messungen (biologische Replikate) – aufzubauen.
Die Datenbank enthielt Messungen von zehn unterschiedlichen Zelllinien. Zusätzlich
wurden T1/T2 -Korrelationsspektren von mesenchymalen Stromazellen (MSCs)
vor und nach deren Differenzierung zu Adipocyten aufgenommen, um ihre zelluläre
Entwicklung nicht-invasiv charakterisieren zu können.
Die aufgenommenen Daten wurden mithilfe einer geeigneten Support Vector Machine
wie auch angepassten künstlichen neuronalen Netzwerken klassifiziert. Mithilfe
dieser Methoden konnten die Zelllinien und MSCs anhand ihrer aufgenommenen
Korrelationsspektren mit einer Genauigkeit von bis zu 98% klassifiziert werden.
Diese hohe Treffsicherheit legte den Schluss nahe, dass die Kombination aus nichtinvasiver,
zweidimensionaler T1/T2 -MR-Relaxometrie und der Verwendung von geeigneten
Methoden des machine learning und der künstlichen Intelligenz eine effiziente
Methodik für die nicht-invasive Klassifizierung von Zellen sowie zellulärer
Entwicklung darstellt.
Der adenovirale SOX9-Gentransfer induziert nach 3-wöchiger in vitro Pelletkultur die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Pelletkultur wirksamer als der TGFB1 Gentransfer mit geringerer Chondrozytenhypertrophie. Eine solche Technologie könnte zukünftig in vivo die Bildung von stabilerem hyalinem Knorpelregeneratgewebe ermöglichen.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Die Vordere Kreuzband (VKB)-Ruptur ist eine häufige Verletzung, welche eine hohe individuelle und sozioökonomische Belastung verursacht. Eine etablierte Therapie ist die VKB-Plastik, problematisch sind jedoch die hohen Rerupturraten nach operativer Versorgung. In der Annahme, dass Mesenchymale Stammzellen (MSC) eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen Zahl und Qualität der aus dem VKB isolierten MSC sowie der Latenz zwischen Ruptur und Rekonstruktion besteht und so ein optimaler Therapiezeitraum eingegrenzt werden kann.
Zunächst erfolgte die Zellisolierung aus intraoperativ gewonnenen VKB-Biopsien. Je nach Latenz zwischen Ruptur und Operation wurden drei Gruppen (akute ≙ ≤ 30 d, subakute ≙ 31-90 d, verzögerte Rekonstruktion ≙ > 90 d) gebildet. Zum Nachweis von MSC wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Plastikadhärenz, eines multipotenten Differenzierungspotentials sowie eines spezifischen Oberflächenantigenmusters (CD73+, CD90+, CD105+, CD34-) untersucht. Zudem wurde ihr Einflusses auf die biomechanischen und histologischen Eigenschaften eines analysiert.
Der Nachweis von MSC war in allen Gruppen möglich. Das Proliferationspotential war in Gruppe II am größten, ebenso der Anteil der MSC an allen Zellen. Er war 5,4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe I und 18,9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe III. In den mit Zellen kultivierten Bandkonstrukten konnte im Gegensatz zu zellfreien Konstrukten humanes Kollagen I nachgewiesen werden. Die Stabilität nahm bei Kultivierung mit Zellen ab.
Die Ergebnisse legen nahe, dass das Regenerationspotential bei subakuter VKB-Rekonstruktion (31-90 d) am höchsten ist. Potenziell ursächlich sind die Regeneration hemmende Entzündungsprozesse zu Beginn sowie degenerative Prozesse im längerfristigen Verlauf. Zudem konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen die Eigenschaften eines Bandkonstruktes durch Bildung von Kollagen I und Reduktion der Stabilität im kurzfristigen Verlauf verändern und dementsprechend den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zur Verifizierung der Ergebnisse bedarf es weiterer Untersuchungen.
Neuropsychiatric disorders, such as attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), represent a burden which deeply impair the patient’s life. Neurobiological research has therefore increasingly focused on the examination of brain neurotransmitter systems, such as the serotonin (5-HT) system, since a dysfunction has been repeatedly implicated in the pathology of these diseases. However, investigation of functional human neurons in vitro has been restricted by technical limitations for a long time until the discovery of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) revolutionized the field of experimental disease models. Since the pathogenesis of neuropsychiatric disorders involves a complex genetic component, genome-wide association studies (GWAS) revealed numerous risk genes that are associated with an increased risk for ADHD. For instance, the novel ADHD candidate gene SLC2A3 which encodes the glucose transporter-3 (GLUT3), facilitates the transport of glucose across plasma membranes and is essential for the high energy demand of several cell types, such as stem cells and neurons. Specifically, copy number variants (CNVs) of SLC2A3 might therefore impact cerebral glucose metabolism as well as the assembly of synaptic proteins in human neurons which might contribute to the pathogenesis of ADHD.
We hypothesized that an altered SLC2A3 gene dosage in human neurons can exert diverse protective or detrimental effects on neurodevelopmental processes as well as the coping of glucometabolic stress events, such as hypo- and hyperglycaemic conditions. The generation of specific iPSC lines from ADHD patients and healthy probands served as basis to efficiently differentiate stem cells into 5-HT specific neurons. Using this neuronal culture, we were able to examine effects of SLC2A3 CNVs on the basal expression of SCL2A3 and GLUT3 in human neurons. Furthermore, the focus was on potentially altered coping of the cells with glucose deprivation and the treatment with specific high- and low glycaemic media.
High-resolution fluorescence imaging in combination with electrophysiological and molecular biological techniques showed that:
1) The generated human iPSCs are fully reprogrammed human stem cells showing typical characteristics of embryonic stem cell-like morphology, growth behaviour, the ability to differentiate into different cell types of the human body and the expression of pluripotency-specific markers.
2) The neuronal subtype derived from our stem cells display typical characteristics of 5-HT specific median and dorsal neurons and forms synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins.
3) Even if SLC2A3 CNVs influence SLC2A3 and GLUT3 basal expression, no significant alterations in gene and protein expression caused by hyper- and hypoglycaemic conditions, nor in the assembly of proteins associated with synapse formation could be observed in human iPSC-derived neurons.
Alveolar echinococcosis, which is caused by the metacestode stage of the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a severe zoonotic disease with limited treatment options. For a better understanding of cestode biology the genome of E. multilocularis, together with other cestode genomes, was sequenced previously. While a few studies were undertaken to explore the E. multilocularis transcriptome, a comprehensive exploration of global transcription profiles throughout life cycle stages is lacking. This work represents the so far most comprehensive analysis of the E. multilocularis transcriptome. Using RNA-Seq information from different life cycle stages and experimental conditions in three biological replicates, transcriptional differences were qualitatively and quantitatively explored. The analyzed datasets are based on samples of metacestodes cultivated under aerobic and anaerobic conditions as well as metacestodes obtained directly from infected jirds. Other samples are stem cell cultures at three different time points of development as well as non-activated and activated protoscoleces, the larval stage that can develop into adult worms. In addition, two datasets of metacestodes under experimental conditions suitable for the detection of genes that are expressed in stem cells, the so-called germinative cells, and one dataset from a siRNA experiment were analyzed. Analysis of these datasets led to expression profiles for all annotated genes, including genes that are expressed in the tegument of metacestodes and play a role in host-parasite interactions and modulation of the host's immune response. Gene expression profiles provide also further information about genes that might be responsible for the infiltrative growth of the parasite in the liver.
Furthermore, germinative cell-specific genes were identified. Germinative cells are the only proliferating cells in E. multilocularis and therefore of utmost importance for the development and growth of the parasite. Using a combination of germinative cell depletion and enrichment methods, genes with specific expression in germinative cells were identified. As expected, many of these genes are involved in translation, cell cycle regulation or DNA replication and repair. Also identified were transcription factors, many of which are involved in cell fate commitment. As an example, the gene encoding the telomerase reverse transcriptase (TERT) was studied further. Expression of E. multilocularis tert in germinative cells was confirmed experimentally. Cell culture experiments indicate that TERT is required for proliferation and development of the parasite, which makes TERT a potentially interesting drug target for chemotherapy of alveolar echinococcosis.
Germinative cell specific genes in E. multilocularis also include genes of densoviral origin. More than 20 individual densovirus loci with information for non-structural and structural densovirus proteins were identified in the E. multilocularis genome. Densoviral elements were also detected in many other cestode genomes. Genomic integration of these elements suggests that densovirus-based vectors might be suitable tools for genetic manipulation of tapeworms. Interestingly, only three of more than 20 densovirus loci in the E. multilocularis genome are expressed. Since the canonical piRNA pathway is lacking in cestodes, this raises the question about potential silencing mechanisms. Exploration of RNA-Seq information indicated natural antisense transcripts as a potential gene regulation mechanism in E. multilocularis. Preliminary experiments further suggest DNA-methylation, which was previously shown to occur in platyhelminthes, as an interesting avenue to explore in future.
The transcriptome datasets also contain information about genes that are expressed in differentiated cells, for example the serotonin transporter gene that is expressed in nerve cells. Cell culture experiments indicate that serotonin and serotonin transport play an important role in E. multilocularis proliferation, development and survival.
Overall, this work provides a comprehensive transcription data atlas throughout the E. multilocularis life cycle. Identification of germinative cell-specific genes and genes important for host-parasite interactions will greatly facilitate future research. A global overview of gene expression profiles will also aide in the detection of suitable drug targets and the development of new chemotherapeutics against alveolar echinococcosis.
Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert.
Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet.
In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind.
Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model.