Yin Xiao

• SUMOylation, as a post-translational modification, plays a crucial role in several biological processes. Small ubiquitin-like modifier (SUMO) proteins can be reversibly linked to the lysine residues located within specific motifs on numerous target proteins, leading to the change of stability, localization, activity of target proteins, mostly by promoting or interfering with the interaction with other molecules. Consequently, it can regulate gene transcription, migration, cell cycle progression, cellular responses to stress, and tumorigenesis.SUMOylation, as a post-translational modification, plays a crucial role in several biological processes. Small ubiquitin-like modifier (SUMO) proteins can be reversibly linked to the lysine residues located within specific motifs on numerous target proteins, leading to the change of stability, localization, activity of target proteins, mostly by promoting or interfering with the interaction with other molecules. Consequently, it can regulate gene transcription, migration, cell cycle progression, cellular responses to stress, and tumorigenesis. NFATc1 belongs to the Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT) transcription factor family, which is dephosphorylated and translocates to the nucleus upon cell stimulation, which provokes Ca2+ signalling. NFAT plays a crucial role in the development and function of the immune system. NFATc1 has three SUMOylation sites at the position of aa 349, 702, and 914. In our previous study, we demonstrated that point mutations performed on the SUMOylation sites on all three or only at the lysine residues K702 and K914 lead to enhanced expression of IL-2 in vitro. To evaluate the function of SUMOylation of NFATc1 on T cell-mediated immunity in vivo, we not only generated a transgenic mouse strain (NFATc1/ΔS+ mouse) by point mutations from Lysine to Arginine on the two SUMOylation sites within exon 10 of Nfatc1 to prevent their SUMOylation, but in combination created another mouse strain (NFATc1/ΔBC+ mouse) that is completely Nfatc1 exon 10-ablated by using the LoxP/Cre system. In NFATc1/ΔS+ T cells, we observed enhanced IL-2 production and less IL-17A and IFN-γ expression. In line with exon 10 bearing the relevant SUMO sites, NFATc1/ΔBC+ CD4+ T cells behaved similarly as NFATc1/ΔS+ ones. The mechanism is that elevated IL-2 secretion can counteract the expression of IL-17A and IFN-γ via STAT5 and Blimp-1 induction. Afterwards, Blimp-1 suppressed IL-2 itself as well as Bcl2A1. Next, we performed two disease models with our NFATc1/ΔS+ mice. In a major mismatch model for acute graft-versus-host disease, we found that the mice transplanted with NFATc1/ΔS+ CD3+ T cells developed less severe disease, and T cells proliferated less due to increased Tregs. Moreover, when transferring 2D2.NFATc1/ΔS+ Th1 plus Th17 cells to Rag1-/- mice to induce experimental autoimmune encephalitis, we also observed ameliorated disease compared to animals with transferred WT T cells as well as increased Tregs. Taking all data together, the deficiency in SUMOylation of NFATc1 leads to an elevated IL-2 secretion in T cells and subsequent activation of STAT5, which competes with STAT3 to inhibit IL-17A production and promotes Treg expansion, as well as to an enforcement of Blimp-1 expression, which suppresses IFN-γ and IL-2 expression. Consequently and despite a short phase of enhanced IL-2 secretion, the deficiency of SUMOylation on NFATc1 can protect from autoreactive and alloreactive diseases. Moreover, to further understand the function of SUMOylation of NFATc1 in humans, we started by establishing an in vitro 3D culture system for tonsil organoids, which was successful in the presence of feeder cells, along with IL-4 and IL-7 cytokines. To confirm that our 3D tonsil organoids can respond to real antigens, we used CMV peptides and peptides of spike proteins from Covid-19 as real antigens, and co-cultured with tonsil organoids, which indeed can generate memory cells and plasmablasts. In the end, we also compared 3D to 2D cultures. Although the total numbers of all B cell subsets were much less in 3D culture than that in 2D culture, still, it indicates that this in-vitro culture system has its limitation, while being usable to produce the similar results as 2D did. Therefore, this 3D culture system can be used as a platform to investigate NFATc1/ΔS+ or NFATc1/ΔBC+ TFH and TFR cells in the dynamic of human GC responses.…
• SUMOylierung als posttranslationale Modifikation spielt bei mehreren biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) Proteine können reversibel mit den Lysinresten innerhalb spezifischer Motive auf zahlreichen Zielproteinen verknüpft werden, was zu einer Veränderung der Stabilität, Lokalisation und Aktivität von Zielproteinen führt, insbesondere durch Interaktionsveränderungen mit anderen Molekülen. Folglich kann es die Gentranskription, Migration, das Fortschreiten des Zellzyklus, zelluläre Reaktionen aufSUMOylierung als posttranslationale Modifikation spielt bei mehreren biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) Proteine können reversibel mit den Lysinresten innerhalb spezifischer Motive auf zahlreichen Zielproteinen verknüpft werden, was zu einer Veränderung der Stabilität, Lokalisation und Aktivität von Zielproteinen führt, insbesondere durch Interaktionsveränderungen mit anderen Molekülen. Folglich kann es die Gentranskription, Migration, das Fortschreiten des Zellzyklus, zelluläre Reaktionen auf Stress sowie die Tumorentstehung regulieren. NFATc1 ist ein Mitglied der Transkriptionsfaktorfamilie Nuclear Factor of Activated T-Cells (NFAT), welches in Folge von Zellstimulation und einer intrazellulären Konzentrationserhöhung von Ca2+ dephosphoryliert wird, was wiederum die Translokation in den Zellkern ermöglicht. Grundsätzlich spielt NFAT eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Funktion des Immunsystems. NFATc1 hat drei SUMOylierungsstellen an den Positionen aa 349, 702 und 914. In unserer vorherigen Studie hatten wir gezeigt, dass Punktmutationen innerhalb aller SUMOylierungsstellen, aber auch nur an den Lysinresten K702 und K914 in vitro zu einer verstärkten Expression von IL-2 führten. Um die Funktion der SUMOylierung von NFATc1 auf die T-zellvermittelte Immunität in vivo zu untersuchen, haben wir nicht nur einen transgenen Mausstamm (NFATc1/ΔS-Maus) durch (Lysin zu Arginin) Punktmutationen an den zwei SUMOylierungsstellen auf dem Exon 10 von NFATc1 erzeugt, sondern auch einen zweiten Mausstamm (NFATc1/ΔBC-Maus), bei welchem das Exon 10 unter Verwendung des LoxP/Cre-Systems vollständig ausschaltet wurde. In den NFATc1/ΔS+ T-Zellen beobachteten wir eine erhöhte IL-2-Produktion und eine geringere IL-17A- und IFN-γ-Expression. NFATc1/ΔBC-Mäuse verhielten sich ähnlich zu NFATc1/ΔS-Mäusen. In den CD4+ T-Zellen mit diesen Genotypen wirkte die erhöhte IL-2 Sekretion der Expression von IL-17A und IFN-γ über Stat5- bzw. Blimp-1-Induktion entgegen. Desweiteren unterdrückte Blimp-1 auch IL-2 und reprimierte die Expression von Bcl2A1. Als nächstes evaluierten wir die NFATc1/ΔS Mäuse in zwei verschiedenen Krankheitsmodellen, der akuten Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion (graft-versus-host disease; GvHD) und der Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE). Wir stellten fest, dass bei der Induktion einer aGvHD durch Transplantation von Knochenmarkzellen zusammen mit NFATc1/ΔS+ CD3+ T-Zellen die Empfängertiere geschützter waren als in Anwesenheit von WT T-Zellen. Auch aufgrund einer erhöhten Anzahl von NFATc1/ΔS+ Tregs proliferierten die NFATc1/ΔS+ T Zellen weniger. Desgleichen war unter Verwendung von 2D2.NFATc1/ΔS+ T-Helfer 1 und 17 war eine Transfer-EAE in Rag Mäusen wesentlich schwächer induziert als bei der Verwendung von WT T-Zellen. Auch in diesem Modell konnten wie einen schützenden Effekt u.a. in Folge einer erhöhten Anzahl an Tregs feststellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Vermeidung einer NFATc1-SUMOylierung zu einer erhöhten IL-2 Sekretion in T-Zellen führt und somit STAT5 aktiviert. STAT5 kompetiert mit STAT3 und hemmt so die IL-17A Produktion. STAT5 beeinflusste auch die Höhe der Blimp-1-Expression, wodurch IFN-γ sowie auf Dauer IL-2 supprimiert wurde. Darüber hinaus fördert IL-2 die Differenzierung und Expansion von Tregs. So kann trotz einer nur kurzen Phase an erhöhter IL-2-Sekretion eine fehlende NFATc1-SUMOylierung vor autoreaktiven und alloreaktiven Krankheiten schützen. Um die Funktion der SUMOylierung von NFATc1 beim Menschen zu verstehen, haben wir zunächst ein In vitro-3D-Kultursystem entwickelt. Unter der Verwendung von Organoiden aus Tonsillen, in Gegenwart von Feeder-Zellen, IL-4 und IL-7. Um zu bestätigen, dass 3D-Tonsillen-Organoide auf echte Antigene reagieren, wurden CMV-Peptide und Peptide von Covid-19 Spike-Proteinen verwendet. Wir konnten zeigen, dass wir durch die Co-Kultivierung der Peptide mit den Organoiden tatsächlich in der Lage sind, Gedächtniszellen und Plasmablasten zu generieren. Schließlich wurden die 3D und 2D Kulturen miteinander verglichen. Trotz der limitierten Gesamtzahl an B-Zellen in der 3D-Kultur, verglichen zur 2D-Kultur, konnten wir äquivalente Tendenzen der Erzeugung von Plasmablasten und Gedächtniszellen feststellen. Dies deutet darauf hin, dass die Verwendung dieses 3D-Kultursystems ein geeignetes in vitro-model darstellt, um NFATc1/ΔS+ oder NFATc1/ΔBC+ TFH- und TFR-Zellen in der Dynamik menschlicher GC-Antworten zu untersuchen.…