Yaser Bitar

• Die Reinheit ist ein wichtigstes Kriterium für die Qualitätssicherung von Arzneistoffen und Arzneistoffzubereitungen. Es war Gegenstand dieser Arbeit, anhand konkreter Problemstellungen die Entwicklung und Validierung chromatographischer und elektrophoretischer Methoden zur Reinheitsprüfung von Arzneistoffen und Arzneimitteln darzustellen. Die Arbeit gliedert sich in zwei große Teilgebiete. Im ersten Abschnitt wurden validierte HPLC- und CE-Methoden zur Prüfung auf verwandte Substanzen von Atropinsulfat beschrieben. Der zweite Teil der ArbeitDie Reinheit ist ein wichtigstes Kriterium für die Qualitätssicherung von Arzneistoffen und Arzneistoffzubereitungen. Es war Gegenstand dieser Arbeit, anhand konkreter Problemstellungen die Entwicklung und Validierung chromatographischer und elektrophoretischer Methoden zur Reinheitsprüfung von Arzneistoffen und Arzneimitteln darzustellen. Die Arbeit gliedert sich in zwei große Teilgebiete. Im ersten Abschnitt wurden validierte HPLC- und CE-Methoden zur Prüfung auf verwandte Substanzen von Atropinsulfat beschrieben. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der chiralen Trennung sowie der Bestimmung der Enantiomerenreinheit von Arzneistoffen mittels cyclodextrin-modifizierter Kapillarelektrophorese. Im Rahmen der Aktualisierung der im Europäischen Arzneibuch PhEur 6.0 bestehenden ionenpaarchromatographischen HPLC-Methode zur Prüfung auf verwandte Substanzen von Atropinsulfat wurde alternativ sowohl eine HPLC-Methode ohne Einsatz eines Ionenpaarreagenzes als auch eine CE-Methode entwickelt und validiert. Da die Verunreinigungen von Atropinsulfat Gemische aus sauren und basischen Komponenten sind, wird im Arzneibuch die Ionenpaarchromatographie zur Reinheitsbestimmung von Atropinsulfat verwendet. Dieses Verfahren bringt allerdings lange Äquilibrierungszeiten und schlechte Reproduzierbarkeiten der Analysenergebnisse mit sich. Als stationäre Phase wurde hier ein RP-18-Material mit polarem Endcapping verwendet, um die Zersetzungsprodukte und verwandte Alkaloide in einem kurzen Zeitraum von dem Arzneistoff Atropinsulfat zutrennen. Als mobile Phase wurde eine Mischung aus Acetonitril und Phosphatpuffer pH 2,5 eingesetzt. Die Nutzung eines Gradienten war trotz des polaren Endcappings nötig, um sowohl hinreichende Retentionen der protonierten basischen Komponenten zu erhalten als auch vollständige Basislinientrennung aller Verunreinigungen zu erzielen. Die HPLC-Methode wurde im Hinblick auf die Reinheitsbestimmung von Atropinsulfat validiert. Die robuste Methode vermag eine präzise und richtige quantitative Bestimmung aller Verunreinigungen des Atropinsulfates mit Hilfe eines externen Standards von Tropasäure zu liefern. Diese HPLC-Methode wurde gemäß Richtlinie Q1A(R2) der Internationalen Konferenz der Harmonisierung (ICH), zu den Stabilitätsuntersuchungen am Fertigarzneimittel Atropinsulfat-Augentropfen 0,5 und 2,0 % eingesetzt. Diese Untersuchungen dienten der Aufklärung des durch den Wirkstoffabbau verursachten Defizits in der Massebilanz der Arzneiform zwischen dem Wirkstoff Atropinsulfat und seinen Neben- und Abbauprodukten im Verlauf der Stabilitätstests. In Langzeitstabilitätsuntersuchungen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen hat sich gezeigt, dass die Stabilität des Wirkstoffes Atropinsulfat in der Arzneiform Augentropfen nicht von der Dosierung des Atropinsulfates sondern von Lagerbedingungen abhängig ist. Der Wirkstoffverlust der Atropinsulfat-Augentropfen beträgt 0,7 % pro Jahr unter den Bedingungen der Klimazone 1 und 1,05 % pro Jahr unter der Klimazone 2. Die Summe der Verunreinigungen in beiden Lagerbedingungen liegen unter dem Grenzwert der Summe aller Verunreinigungen nach PhEur 6.0. Diese Erkenntnis aus den Stabilitätsuntersuchungen zur Klimazonen 1 und 2 wird durch die Untersuchungsergebnisse der Arzneiform unter Klimazone 3 bestätigt. Die Studie zeigt, dass es für die Fertigarzneimittel “Atropinsulfat-Augentropfen 0,5 und 2,0 %“ Lagerhinweise auf der Verpackung geben muss. Im letzten Abschnitt des ersten Teils wurde zusätzlich eine CE-Methode zur Reinheitsprüfung von Atropinsulfat entwickelt und validiert. Die elektrokinetische Chromatographie mit Mikroemulsionen (MEEKC) ist als CE-Trenntechnik in der Lage, nahezu alle Verunreinigungen von der Hauptkomponente Atropinsulfat zu trennen. Die Trennung erfolgt in einer unbeschichteten Quarzglaskapillare. Als Öl-in-Wasser Mikroemulsionshintergrundelektrolyt werden 0,8 % Octan als Ölphase, 6,6 % Butanol als Co-Tensid, 2,0 % Isopropanol als organischer Modifier, 4,45 % Natriumlaurylsulfat (SDS) als Tensid und 86,15 % Boratpuffer (10 mM, pH 9,0) als wässrige Phase verwendet. Die Proben werden hydrodynamisch injiziert. Um die Analysenzeit zu verkürzen, wird ein Spannungsgradient verwendet. Unter diesen optimierten elektrophoretischen Bedingungen sind die Verunreinigungen und Atropinsulfat basisliniengetrennt. Quantifiziert wird mittels des externen Standards Tropasäure. Die MEEKC-Methode wurde im Hinblick auf quantitative Reinheitsbestimmung von Atropinsulfat validiert. Im Vergleich zur HPLC-Methode ergab die MEEKC-Methode deutlich bessere Peakformen und höhere Auflösungsfaktoren für die Peaks E, D und F, während sich bei der HPLC-Methode präzisere Reinheitsergebnisse bezogen auf ihre relativen Standardabweichungen ergab. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden analytische CE-Methoden zur Enantiomerentrennung von einigen chiralen Arzneistoffen und Substanzen unter Zusatz von Cyclodextrinen (CDs) und ihren Derivaten als chirale Selektoren untersucht. CD-modifizierte elektrokinetische Chromatographie mit Mikroemulsionen (CD-MEEKC) wurde zur Trennung der vier chiralen Tropa-Alkaloide Atropin, Scopolamin, Ipratropium und Homatropin verwendet. Der O/W-Mikroemulsion-HGE besteht aus 0,8 % Octan, 6,6 % Butanol, 2,0 % SDS und 90,6 % Boratpuffer (10 mM, pH 9,0). Enantiomerentrennung aller Tropan-Alkaloiden mit höherer Auflösung und kürzeren Migrationszeiten erfolgt durch Zugabe von Heptakis(2,6-di-O-methyl-6-sulfato)-ß-CD oder sulfatiertem ß-CD in einer Konzentration von 5 mM. Vorteil dieser CD-MEEKC-Methode im Vergleich zur CD-modifizierten CE-Methode war, dass die Scopolamin-Enantiomere aufgrund des verwendeten SDS-Mikroemulsion-HGEs getrennt werden konnte. Aziridine (1-5) gehören zu einer pharmakologischen Gruppe irreversibler Protease-Inhibitoren. Die biologische Testung von potenziellen Protease-Inhibitoren wird nur für die diastereromerenreinen Derivate durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden CD-modifizierte CE-Methoden zur Enantiomeren- bzw. Diastereomerentrennung von Aziridin-Derivaten entwickelt. Robuste Basislinientrennungen werden unter Zusatz von Sulf-ß-CD im wässrigen Phosphatpuffer oder HDAS-ß-CD im wasserfreien sauren methanolischen HGE erzielt. Die wässrige CE-Methode wird nach ICH-Richtlinie Q2(R1) in Bezug auf die Diastereomerenreinheit von cis-Racemat validiert. Im Rahmen einer Überarbeitung der Monographie von Levodopa wurde die Polarimetrie zur Prüfung auf optische Drehung durch eine chirale HPLC-Methode ersetzt. Enantiomerentrennung erfolgt mit einer RP-18-Säule und einer Mischung aus Methanol und Wasser als mobile Phase, zu der Kupferacetat und N,N-Dimethyl-L-phenylalanin gegeben wird. Mit dieser Methode wurde D-Dopa auf 0,5 % begrenzt. Zusätzlich führt diese Methode zu einer schlechten Peakform der Hauptkomponente und so zu einer unsicheren Limitierung von D-Dopa in Levopdopa durch den Flächenvergleich. Eine CD-modifizierte CE-Methode von Hoogmartens et al.182 wurde zur Enantiomerenreinheit von Levodopa optimiert und validiert. Mit Hilfe einer unbeschichteten Quarzglaskapillare und eines HGE von 20 mM Phosphatpuffer pH 2,5 und 10 mM Sulf-ß-CD konnte die Enantiomerentrennung mit höherer Auflösung im Umkehrpolungsmode erzielt werden. Die Bestimmungsgrenze von D-Dopa betrug gemäß der ICH-Richtlinie Q2(R1) 0,04 % in Bezug auf den Gehalt von Levopdopa. Im letzten Abschnitt wurde an einem internationalen Ringversuch zur Enantiomerenreinheit von Timololmaleat mittels wasserfreier CE-Methode186 (NACE) teilgenommen. Die Durchführung erfolgt mit der Testung einer Systemeignung sowie mit der Bestimmung des Gehalts an R-Timolol in vier S-Timolol-Proben. Die Beurteilung der Präzision sowie die Ringversuchstudie erfolgt durch die Ermittlung der statistischen Varianzen zwischen verschiedenen Laboratorien, Messtagen und Bestimmungen…
• The purity of drugs and their preparations is one important aspect for the quality assessment. Aim of the present work was the development and validation of chromatographic and electrophoretic methods for impurity testing of drugs and their formulations. This thesis is divided in two main chapters. First, validated HPLC and CE methods for the impurity profiling of atropine sulfate were developed. Second, chiral separations and determination of enantiomeric impurity for various examples of chiral drugs by means of cyclodextrin-modified capillaryThe purity of drugs and their preparations is one important aspect for the quality assessment. Aim of the present work was the development and validation of chromatographic and electrophoretic methods for impurity testing of drugs and their formulations. This thesis is divided in two main chapters. First, validated HPLC and CE methods for the impurity profiling of atropine sulfate were developed. Second, chiral separations and determination of enantiomeric impurity for various examples of chiral drugs by means of cyclodextrin-modified capillary electrophoresis are described. The current test for related substances of atropine sulphate in European Pharmacopoeia is using ion pair chromatography. This IPC method especially in combination with gradient elution tends to be time-consuming due to long equilibration periods and it is often not very robust. In order to separate atropine sulphate from the major degradation products (A, C and H) and other related alkaloids of natural origin (B, D, E, F and G) in short analysis time, a hydrophilic embedded RP 18 column was used. The mobile phase contained acetonitrile and phosphate buffer (pH 2.5). For a sufficient retentions of the positively charged basic components as well as for a completely baseline separation of all impurities, a gradient was applied. The method was validated with respect to a quantitative determination of all related substances of atropine sulfate by using the external standard tropic acid. This method was very robust and able to guarantee a precise and accurate determination of all impurities content. This HPLC method has been successfully applied, according to the Guideline Q1A(R2) of the International Conference on Harmonization (ICH) for the long stability testing of the pharmaceutical products ”Atropine sulfate-Eye drops 0.5 and 2.0 %”. The loss of active substance as well as the level of degradation and related substances has been determined and the margin of analytical error characterized. Stability studies of atropine sulfate eye drops have been evaluated under three different climatic zones 1-3, namely refrigerator, normal conditions and accelerated conditions. The data of long stability have shown that the loss of active substance atropine sulfate depended on the storage conditions. The loss of atropine sulfate was found to be 0.7 and 1.05 % per year for the climatic zone 1 and 2, respectively. No significant influences of these values were observed for different dosages of eye drops 0.5 and 2.0 %. The total limits of impurities for both storage conditions 1 and 2 were found to be 0.45 and 0.90 %, respectively, and thus were significant lower than the 1.5 % of the nominal limit according to the European Pharmacopoeia. An additional CE method for impurity profiling of atropine sulphate based on microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) was developed and validated. This technique makes it possible to separate atropine sulfate, its degradation products and related substances. The optimized oil-in-water microemulsion background electrolyte consists of 0.8 % octan as oil phase, 6.6 % butanol as co-surfactant, 2.0 % isopropanol as organic modifier, 4.45 % sodium dodecyl sulfate as surfactant and 86.15 % sodium tetraborate buffer (10 mM, pH 9.0) as aqueous phase. In order to shorten analysis time a voltage gradient was applied and the UV-detection is performed at 195 nm. Under these electrophoretic conditions a successful separation of atropine and all impurities was achieved (Fig..6-2). The MEEKC method, which was employed to quantitative determine the related substances of atropine sulphate by using an external standard of tropic acid, was validated according to the ICH guidelines Q2(R1). The comparison to the HPLC method revealed the newly established MEEKC method to be better than with HPLC with respect to peak forms and resolution values of peaks E, D and F. The precision and the relative standard deviations obtained with HPLC method were less than with MEEKC method. The second part of the thesis describes analytical CE methods dealing with the enantioseparations of many chiral substances by using cyclodextrins (CDs) and their derivatives as chiral selectors. CD-modified microemulsion electrokinetic chromatography (CD-MEEKC) was applied to chiral separation of tropa alkaloids, namely atropine, scopolamine, ipratropium und homatropine. The standard O/W microemulsion BGE composed of 0.8 % octan, 6.6 % butanol, 2.0 % sodium dodecyl sulphate and 90.6 % sodium tetraborate buffer (10 mM, pH 9.0). Optimized enantioseparations with high resolution and short migration times of all tropa alkaloids were achieved by utilizing either heptakis(2,3-di-O-methyl-6-sulfo)-ß-CD (HDMS-ß-CD) or sulphated ß-CD (Sulf-ß-CD) as chiral selector in a concentration of 5.0 mM. The CD-MEEKC method was superior to the CD-modified CE method with respect to the enantioseparation of scopolamine. Aziridine derivatives (1-5) are attracting pharmacological interest as irreversible protease inhibitors. The diastereomeric purity of the potential protease inhibitors should be confirmed prior to the biological assay. The aim was to develop CD-modified CE methods for separation of the enantio- and diastereomers of aziridine derivatives. Robust baseline separations were obtained using Sulf-ß-CD in aqueous phosphate buffer or HDAS-ß-CD in nonaqueous acidic methanolic BGE. The aqueous CE method intended as a diastereomeric impurity determination of racemic cis-aziridine was validated according to the ICH guideline Q2(R1). The monograph of levodopa was recently revised in order to replace a poor optical rotation test with a better chiral HPLC method. Using an achiral RP-18 column the enantioseparation can be achieved using a mobile phase composed of copper acetate and N,N-dimethyl-L-phenyalanine in a water-methanol mixture. The method is able to limit the D-dopa to less than 0.5 % only and the peak shape of the uncertain major peak is rather poor which makes determination of the enantiomeric impurity difficult. A CD-modified CE method of Hoogmartens et al.182 was optimized and validated to evaluate the enantiomeric impurity of levodopa. Using an uncoated fused-silica capillary and a BGE composed of 10 mM Sulf-ß-CD in 20 mM phosphate buffer pH 2.5 in a reversed polarity mode the resolution between both enantiomers D,L-dopa was higher than 6. The limit of quantification of the D-dopa according to the ICH guideline Q2(R1) was found to be 0.04 % corresponding to the major peak (L-dopa). The last chapter describes the participation in one international interlaboratory trial for the determination of enantiomeric impurity of S-timolol maleate using a nonaqueous CE method (NACE).186 The method performance was examined using a suitability test; subsequently the precision was evaluated by quantification of variances in the determination of R-timolol at four different impurity levels in S-timolol maleate samples. Different variances, between laboratories, days and replicates, were calculated for the judgment of the interlaboratory study.…